專利名稱：一種檢測砷生物可利用度的微生物細胞傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測水體及土壤中砷生物可利用度的微生物細胞傳感器的搭建及使用。
背景技術：
隨著社會經濟的發展，砷及其化合物的污染形勢日益嚴峻，已被WHO評定為水體中最嚴重的重金屬污染物之一。砷及其化合物可造成人體心血管系統、神經系統和呼吸系統等全面的危害。對砷污染環境進行合理、準確的監測是開展污染防治工作的重要前提。 目前監測和檢測重金屬污染物主要有兩種方法一種是物理化學分析法，如電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)等，其優點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設備昂貴，操作復雜，檢測周期長，最重要的一點是，傳統的物理化學方法主要是對環境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬的生物可利用度；另一種方法是基于生物有機體的生物傳感器，其優勢是可以直接反映污染物對生物有機體的毒性及影響。微生物細胞具有易操作，繁殖及生存能力強，易儲存和穩定性高的特點，以微生物細胞為生物學感應元件的微生物細胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測效率。微生物細胞傳感器的微生物細胞含有一個由特異調控蛋白基因和報告基因組成的重組質粒。當宿主細胞的生長環境中有重金屬離子存在時，宿主細胞通過不同的機制吸收重金屬離子。當重金屬離子進入到胞內后，重組質粒或宿主染色體DNA編碼的轉錄調控蛋白被重金屬離子特異激活，與啟動子綁定或從啟動子上脫落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)啟動子的啟動，進而調控下游報告基因表達，產生可檢測的信號，這種信號的變化強度與重金屬誘導物的濃度密切相關，轉錄調控蛋白對重金屬離子的識別能力和綁定能力決定著微生物全細胞傳感器的檢測特異性和靈敏度。微生物細胞傳感器已成為重金屬生物可利用度監測和風險污染評價的重要工具。
發明內容
本發明的目的在于針對現有的化學檢測方法不能反映砷的生物可利用度且存在操作復雜、儀器價格昂貴等問題，利用大腸桿菌砷抗性操縱子ars啟動子序列、調控蛋白基因arsR和商業化質粒pEGMluc的熒光素酶報告基因(Iuc)，構建出的一種微生物細胞傳感器，從而提供一種具有高靈敏度、低成本的砷生物可利用度檢測方法。構建該細胞傳感器的具體操作步驟為1、T7啟動子和報告基因的拼接以商業化質粒載體pRSET A. B. C為模板，PCR擴增得到T7啟動子片段fl ；以商業化質粒載體pGEM-luc為模板，PCR擴增得到熒光素酶報告基因Iuc片段f2 ;將片段H和f2按一定比例混合，以混合液為模板，PCR擴增得到T7啟動子和報告基因Iuc的拼接片段f3 ；
2、包含T7啟動子的報告基因導入PUC18質粒對pUC18質粒用SacI與BamHI進行雙酶切處理后純化得到載體vl ;對拼接序列f3用SacI與BamHI進行雙酶切處理后純化得到片段f4 ;將片段f4連入載體vl，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化，得到含有T7啟動子和報告基因Iuc的載體v2 ；3、載體v2中Iac啟動子的去除以pUC18為模板，擴增得到不含Iac啟動子的pUC18部分序列f5 ;對f5用SacI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到片段fV ;對載體v2用SacI利HindIII進行雙酶切處理后純化得到載體v3 ;將片段K'連入載體v3，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化，得到含有T7啟動子和報告基因Iuc且去除Iac啟動子的載體v4 ；4、載體v4與T7終止子的拼接 以pET30a為模極，擴增得到T7終止子片段f6 ;對片段f6用BamHI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到片段f6';對載體v4用BamHI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到載體v5 ;將片段f6'連入載體v5，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化，得到受T7啟動子誘導表達的基礎型傳感器細胞；5、基礎型傳感器的表達能力驗證用2mM的IPTG誘導基礎型傳感器細胞，采用Varioskan Flash全波長掃描多功能酶標儀檢測其發射光譜以驗證基礎型傳感器細胞對報告基因的表達能力。6、目標質粒的構建以E. coli基因組為模板，擴增得到包含ars啟動子和調控蛋白基因arsR的片度f7 ;對片段f7用SacI和XhoI進行雙酶切處理后純化得到片段fT ;對基礎型傳感器細胞質粒ν6用SacI和XhoI進行雙酶切處理后純化得到片段ν6';將片段fT連入載體ν6'，利用大腸桿菌作為宿主進行轉化，得到目標質粒；7目標傳感器細胞的搭建完成利用商業化宿主感受態細胞DH5a為宿主，將目標質粒v7轉入宿主細胞得到檢測砷的生物可利用度的微生物細胞傳感器。
具體實施例方式以下實施例將對本發明作進一步的說明實施例I :第一步接種傳感器細胞單菌落于50mL三角瓶中，添加氨芐青霉素到終濃度為100 μ g/mL, 37 °C，200r · mirT1 過夜培養；第二步取O. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鮮LB培養基中，37°C，200r ·ιιι η_1培養至 OD600 = 1.2 ；第三步將菌液用新鮮LB培養基稀釋至OD6tltl = 0.4 ；第四步取50 μ L稀釋后的菌液分別與砷標準溶液、待測樣品等體積混合，30°C靜置誘導；第五步將40 μ L空載體細胞與50 μ L誘導培養液混合，加入10 μ LlMK2HPO4(ρΗ7. 8)和20mM EDTA的裂解緩沖液，_70°C條件下快速冷凍混合物lOmin，然后23°C水浴細胞3min，最后加入300 μ L新鮮配制的裂解混合物(見附錄)，混勻后室溫孵育IOmin ；第六步每個96孔板中加入20 μ L的裂解液，再加入100 μ L熒光素酶檢測液后，用熒光檢測儀立刻檢測；第七步根據標準樣品誘導下傳感器細胞的熒光值，制作熒光強度和誘導物砷濃度的標準曲線，利用標準曲線計算待測樣品的中砷的相對濃度。附錄 IOmL裂解混合物配方5. 5mL 水2mL5 X CCLR 25mg BSA2. 5mL 溶菌酶混合液(5mL 配方0. 5mLlM K2HPO4 (pH7. 8)與 20mM EDTA 的混合液，
4.5mL無菌水,25mg溶菌酶,混勻)T7啟動子序列CGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAA熒光素酶報告基因Iuc序列ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTCCATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATAGCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATAGTTGACCGCTTGAAGTCTTTAATTAAATACAAAGGATATCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAATCGATATTGTTACAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTCTTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGTCCAAATTGTAAT7終止子序列ATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCars啟動子序列TTACCTTCCTCTGCACTTACACATTCGTTAAGTCATATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAGACACTACCTGCAACAATCAGGAGCGCAA 調控基因arsR序列ATGTCATTTCTGTTACCCATCCAATTGTTCAAAATTCTTGCTGATGAAACCCGTCTGGGCATCGTTTTACTGCTCAGCGAACTGGGAGAGTTATGCGTCTGCGATCTCTGCACTGCTCTCGACCAGTCGCAGCCCAAGATCTCCCGCCACCTGGCATTGCTGCGTGAAAGCGGGCTATTGCTGGACCGCAAGCAAGGTAAGTGGGTTCATTACCGCTTATCACCGCATATTCCAGCATGGGCGGCGAAAATTATTGATGAGGCCTGGCGATGTGAACAGGAAAAGGTTCAGGCGATTGTCCGCAACCTGGCTCGACAAAACTGTTCCGGGGACAGTAAGAACATTTGCAGTTAA
權利要求
1.一種微生物細胞傳感器，由細菌作基本材料，通過基因工程手段構建，用來檢測水體和土壤中砷的生物可利用度。
2.根據權利要求I所述的微生物細胞傳感器，其特征在于大腸桿菌為宿主細胞。
3.根據權利要求I所述的微生物細胞傳感器，其特征在于高靈敏度的螢火蟲熒光素酶Iuc為報告基因。
4.根據權利要求I所述的微生物細胞傳感器，其使用方法 第一步接種傳感器細胞單菌落于50mL三角瓶中，添加氨芐青霉素到終濃度為100 u g/mL, 37 °C，200r mirT1 過夜培養； 第二步取0. 5mL的上述菌液到14. 5mL的新鮮LB培養基中，37°C，200r -min^1培養至OD6OO =1.2; 第三步將菌液用新鮮LB培養基稀釋至OD6tltl = 0.4 ； 第四步取50 y L稀釋后的菌液分別與砷標準溶液、待測樣品等體積混合，30°C靜置誘導； 第五步將40 ii L空載體細胞與50 ii L誘導培養液混合，加入10 ii L IM K2HPO4 (pH7. 8)和20mM EDTA的裂解緩沖液，_70°C條件下快速冷凍混合物lOmin，然后23°C水浴細胞3min，最后加入300 u L新鮮配制的裂解混合物(見附錄)，混勻后室溫孵育IOmin ； 第六步每個96孔板中加入20 ii L的裂解液,再加入100 u L熒光素酶檢測液后,用熒光檢測儀立刻檢測； 第七步根據標準樣品誘導下傳感器細胞的熒光值，制作熒光強度和誘導物砷濃度的標準曲線，利用標準曲線計算待測樣品的中砷的相對濃度。
5.根據權利要求4所述的微生物細胞傳感器的使用方法，其特征在于微生物細胞傳感器培的養溫度為37°C，微生物細胞傳感器的誘導溫度為30°C，熒光強度數據利用熒光檢測儀采集和檢測。
全文摘要
本發明涉及一種砷生物可利用度檢測的微生物細胞傳感器，適用于水體和土壤中砷的生物可利用度的檢測。所述細胞傳感器包括大腸桿菌，大腸桿菌作為宿主細胞承載重組質粒。重組質粒，重組質粒為含有砷抗性系統ars啟動子、砷抗性系統調控基因arsR、熒光素酶基因luc和rrnb終止子串聯序列的pUC18質粒。本傳感器對砷的響應時間為30分鐘，對砷的最低檢測濃度為0.01微摩爾/升，最高檢測濃度為100微摩爾/升，具有靈敏度高，響應速度快，成本低，操作簡單的特點，可廣泛運用于污染環境砷的檢測和風險評價。
文檔編號C12R1/19GK102796693SQ20121030603
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者莊國強, 侯啟會, 馬安周 申請人:中國科學院生態環境研究中心