一種基因載體系統及其制備方法

專利名稱：一種基因載體系統及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物載體領域，特別涉及基因載體系統及其制備方法。
背景技術：
基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞以糾正基因的缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的的生物醫學新技術。利用載體將外源基因導入靶細胞是一種基因治療的有效方法，成功的基因治療依賴于有效的基因載體。常見的載體包括病毒類載體和非病毒載體。其中，病毒類載體包括逆轉錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等。但是病毒類載體在臨床應用中存在著很大的安全隱患，在基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國“氣泡嬰兒”事件，在很大程度上都是由病毒類基因載體的不安全性造成的。非病毒載體多為高分子陽離子聚合物，因其安全、有效、無免疫原性等優點，已成為病毒類載體最有希望的替代者。陽離子聚合物聚乙烯亞 胺(PEI)是非病毒類載體中受到關注最多的一個，它已經在體外和體內的轉染實驗中得到應用，但由于其毒性高、轉染效率低、在體內運輸過程的非特異性吸附以及沒有靶向性的缺點，阻礙了它的進一步發展(Boussif O, Zanta M. A, Behr J. P. et al. A VersatileVector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and inVivo-Polyethylenimine. PNASj 1995;92:7297-7301)。腫瘤的理想基因治療過程為載有基因物質的基因載體在血液中循環，到達腫瘤組織后被腫瘤細胞內吞并完成轉染治療。但是，血液中含有很多帶負電的蛋白類物質，帶正點的載體容易與其吸附凝聚成大顆粒而發生沉淀(Liu, Y, and Reineke, T.M. Poly(glycoamidoamine)sfor gene delivery. Structural effects on cellularinternalization,buffering capacity,and gene expression.BioconjugateChem. 2007; 18，19-30.);而且，正常體液環境中的細胞表面帶負電，帶正電的載體也容易接近正常細胞，被正常細胞內吞，因此，載體難于到達腫瘤組織，導致轉染效率低。為了提高基因載體體系進入目標組織細胞的效率，常用的方法是(1)引入遮蔽體系。遮蔽體系通常選用帶負電的高分子材料，復合在基因載體體系表面，使整個顆粒帶負電。避免在血液運輸過程中的非特異性吸附。但是，單純的遮蔽體系會影響基因載體與目標組織的結合效率。(2)引入靶向。在載體上引入對目標細胞具有特異性結合能力的靶向配體，如精-甘-天短肽(RGD短肽)、葉酸等。但是，單純的靶向配體阻止不了載體體系的非特異性吸附。即使將兩者同時引入載體體系，由于遮蔽體系表面所帶的負電與細胞表面帶負電荷產生斥力，也會影響載體體系與細胞的結合效率，即其轉染效率低。

發明內容
本發明解決的技術問題在于提供一種基因載體系統，轉染效率高。本發明提供了一種基因載體系統，包括祀向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質；
所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；所述基因物質為質粒DNA或SiRNA。優選的，所述靶向配體與pH敏感遮蔽體系的質量比為(O. f 10) :1，ρΗ敏感遮蔽體系與陽離子載體的質量比為(廣80):1，所述陽離子載體與基因物質的質量比為(O. 5 50):1。
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優選的，所述pH敏感遮蔽體系中，所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量為300(Tl3000，所述聚谷氨酸的分子量為3000 13000。優選的，在所述靶向配體中，所述聚乙二醇的分子量為100(Γ2000，所述聚賴氨酸的分子量為2000 20000。優選的，所述陽離子載體為聚乙烯亞胺。本發明提供了一種基因載體系統的制備方法，包括以下步驟(A)將基因物質與陽離子載體混合孵育，得到二元復合物；所述基因物質為質粒DNA或SiRNA ；(B)將所述二元復合物與pH敏感遮蔽體系混合，得到三元復合物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；(C)將所述三元復合物與靶向配體混合，得到基因載體系統；所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。優選的，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。優選的，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物。優選的，所述靶向配體按照以下方法制備
將聚乙二醇與賴氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；將所述聚賴氨酸-聚乙二醇聚合物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發生反應，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。優選的，所述步驟(A)中，所述孵育時間為1(Γ30分鐘。與現有技術相比，本發明基因載體系統包括靶向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質。所述pH敏感遮蔽體系含有聚賴氨酸鏈及聚天冬氨酸或聚谷氨酸鏈，因此具有PH值敏感性，在中性或偏堿性的環境中，其帶有負電荷，可以有效保護陽離子載體和基因物質；在酸性環境下，其電荷翻轉，表 現為帶正電荷，有利于其接近表面帶有負電荷的細胞，從而提高基因載體系統與細胞的結合效率，提高轉染效率。同時，靶向配體可以伸展到陽離子載體的外圍，提高靶向配體與細胞表面受體的結合率，從而提高基因載體系統與細胞的結合效率。實驗結果表明，本發明提供的基因載體系統對Hela細胞轉染效率可達4. 4X IO5 8. 8 X 108RLU/mg Protein，對 Huh 7 細胞的抑制效率可達 79% 84%。
具體實施例方式為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明優選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特征和優點，而不是對本發明權利要求的限制。本發明實施例公開了一種基因載體系統，包括祀向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質；所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；所述基因物質為質粒DNA或SiRNA。按照本發明，所述基因載體系統中，所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。所述聚乙二醇的分子量優選為100(Γ2000，更應優選為120(Γ1800，最優選為140(Γ1600 ;本發明對所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對聚乙二醇兩端的羥基進行改性，優選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團，如乙烯基，本發明對其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。本發明對所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場購買。所述聚賴氨酸的分子量優選為2000 20000，更優選為5000 15000，最優選為8000 12000。本發明對所述靶向配體的來源沒有特殊限制，優選按照以下方法制備將聚乙二醇與賴氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；將所述聚賴氨酸-聚乙二醇共聚物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發生反應，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。在制備靶向配體的過程中，首先以聚乙二醇為引發劑，引發賴氨酸-N-內羧酸酐發生開環聚合，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物。所述聚乙二醇的分子量優選為100(Γ2000，更應優選為120(Tl800，最優選為140(Tl600 ;本發明對所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對聚乙二醇兩端的羥基進行改性，優選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團，如乙烯基，本發明對其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。本發明對所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場購買。本發明對所述賴氨酸-N-內羧酸酐的來源沒有特殊限制，可以由市場夠買；所述賴氨酸-N-內羧酸酐可以帶有保護基，也可以不帶有保護基。所述反應的溶劑優選為N，N-二甲基甲酰胺。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果聚聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，所述透析所用的透析袋的截留量為 300(T4000Da。得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，將其與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發生反應，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。本發明對所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽的來源沒有特殊限制，可以由市場購買。所述反應的時間優 選為2(T30h，所述反應的溫度優選為6(T80°C。所述反應的催化劑優選為偶氮異丁腈。所述反應的溶劑優選為N，N- 二甲基甲酰胺。按照本發明，所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物、超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物或超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為600 1000，優選為600 800 ;所述聚賴氨酸的分子量為1000 25000，優選為4000 8000 ；所述聚天冬氨酸的分子量為100(Γ25000，優選為300(Γ13000 ;所述聚谷氨酸的分子量為100(Γ25000，優選為300(Γ13000。所述pH敏感遮蔽體系優選為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物。所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物中超支化的聚乙烯亞胺分子量優選為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量優選為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量優選為300(Γ13000。本發明對所述pH敏感遮蔽體系的來源沒有特殊限制，當其為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物時，優選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物時，首先以聚酰亞胺為引發劑，與天冬氨酸-N-內羧酸酐反應，所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物后，將其與賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物。所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為 3000 4000Da。當所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物時，優選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物時，以聚乙烯亞胺為引發劑，將其與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。當所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規共聚物時，優選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規共聚物時，以聚乙烯亞胺為引發劑，將其與谷氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。按照本發明，所述基因載體系統中的所述陽離子載體的作用為擔載基因物質，其優選為聚乙烯亞胺，所述聚乙烯亞胺的分子量優選為200(Γ4000，更優選為2500。本發明對所述陽離子載體的來源沒有特殊限制，可以由市場購買。按照本發明，所述基因載體系統中的所述基因物質為質粒DNA或siRNA。所述質 粒DNA優選為熒光素酶質粒DNA ;所述siRNA優選為沉默熒光素酶的Luc siRNA,其序列為5' -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。按在本發明，在所述基因載體系統中，所述靶向配體與pH敏感遮蔽體系的質量比優選為(O. Γ10):1,更優選為(21):1 ;ρΗ敏感遮蔽體系與陽離子載體的質量比為(Γ80):1,更優選為(1(Γ70) :1 ;所述陽離子載體與基因物質的質量比為(O. 5 50) :1，更優選為(2 40) : I。本發明提供了一種基因載體系統的制備方法，包括以下步驟(A)將基因物質與陽離子載體混合孵育，得到二元復合物；所述基因物質為質粒DNA或siRNA ;(B)將所述二元復合物與pH敏感遮蔽體系混合，得到三元復合物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ；
(C)將所述三元復合物與靶向配體混合，得到基因載體系統；所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。按照本發明，首先將基因物質與陽離子載體混合孵育。所述陽離子載體的作用為擔載基因物質，其優選為聚乙烯亞胺，所述聚乙烯亞胺的分子量優選為200(Γ4000，更優選為2500。本發明對所述陽離子載體的來源沒有特殊限制，可以由市場購買。所述基因物質為質粒DNA或siRNA。所述質粒DNA優選為熒光素酶質粒DNA ;所述siRNA優選為沉默熒光素酶的Luc siRNA，其序列為Y -CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3'。所述陽離子載體與基因物質的質量比為(O. 5 50): 1，更優選為(2 40):1。所述混合孵育的溶劑優選為水，為了混合孵育的效果更好，優選首選將基因物質與陽離子載體分別溶于水，形成水溶液后再將兩者的水溶液進行混合孵育，所述基因物質水溶液的濃度優選為O. 02^2mg/mL ;所述陽離子載體水溶液的濃度優選為O. 02 2mg/mL。所述混合孵育的時間優選為1(Γ30分鐘。基因物質與陽離子載體混合孵育后，得到二元復合物。然后，將所述二元復合物與PH敏感遮蔽體系混合。所述混合時所用的溶劑優選為水。為了保證混合均勻，優選將pH敏感遮蔽體系溶于水，形成水溶液后再與二元復合物進行混合，所述PH敏感遮蔽體系水溶液的的濃度優選為O. 02 2mg/mL，其pH值優選為7. 4。所述混合的時間優選為1(Γ30分鐘。所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物、超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物或超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，優選為600 800 ;所述聚賴氨酸的分子量為1000 25000，優選為4000 8000 ;所述聚天冬氨酸的分子量為1000 25000，優選為3000 13000 ;所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000，優選為3000^13000.所述pH敏感遮蔽體系優選為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物。所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物中超支化的聚乙烯亞胺分子量優選為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量優選為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量優選為300(Γ13000。本發明對所述pH敏感遮蔽體系的來源沒有特殊限制，當其為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物時，優選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物時，首先以聚酰亞胺為引發劑，與天冬氨酸-N-內羧酸酐反應，所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物；得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物后，將其與賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物。所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1:廣1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟 知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為 3000 4000Da。當所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物時，優選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物時，以聚乙烯亞胺為引發劑，將其與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。當所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規共聚物時，優選按照以下方法制備將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的共聚物。在制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規共聚物時，以聚乙烯亞胺為引發劑，將其與谷氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，所述反應的溶劑優選為二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的混合物，二氯甲烷和N，N- 二甲基甲酰胺的體積比為I: f 1:10。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果制備超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚谷氨酸的無規共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干處理，所述透析所用的透析袋的截留量為300(T4000Da。按照本發明，將所述二元復合物與pH敏感遮蔽體系混合后，得到三元復合物。最后，將所述三元復合物與靶向配體混合，得到基因載體系統。所述混合時所用的溶劑優選為水。為了保證混合均勻，優選將靶向配體溶于水，形成水溶液后再與三元復合物進行混合，所述靶向配體水溶液的濃度優選為O. 02 2mg/mL。所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。所述聚乙二醇的分子量優選為100(Γ2000，更應優選為120(Tl800，最優選為140(Tl600 ;本發明對所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對聚乙二醇兩端的羥基進行改性，優選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團，如乙烯基，本發明對其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。本發明對所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場購買。所述聚賴氨酸的分子量優選為200(Γ20000，更優選為500(Γ15000，最優選為800(Tl2000。本發明對所述靶向配體的來源沒有特殊限制，優選按照以下方法制備將聚乙二醇與賴氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；
將所述聚賴氨酸-聚乙二醇共聚物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發生反應，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。在制備靶向配體的過程中，首先以聚乙二醇為引發劑，引發賴氨酸-N-內羧酸酐發生開環聚合，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物。所述聚乙二醇的分子量優選為100(Γ2000，更應優選為120(Tl800，最優選為140(Tl600 ;本發明對所述聚乙二醇沒有特殊限制，可以對聚乙二醇兩端的羥基進行改性，優選為一端為氨基，另一端為其他功能化的基團，如乙烯基，本發明對其改性方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。本發明對所述聚乙二醇的來源也沒有特殊限制，可以由市場購買。本發明對所述賴氨酸-N-內羧酸酐的來源沒有特殊限制，可以由市場夠買；所述賴氨酸-N-內羧酸酐可以帶有保護基，也可以不帶有保護基。所述反應的溶劑優選為N，N-二甲基甲酰胺。所述反應時間優選為6(T80h，更優選為62 78h。所述反應的溫度優選為2(T40°C。所述反應結束后，如果聚聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物帶有保護基，可以對所述保護基進行脫除。本發明對所述脫保護的方法沒有特殊限制，可以按照本領域技術人員熟知的方式進行。所述反應結束后，優選經過透析并凍干，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，所述透析所用的透析袋的截留量為 300(T4000Da。得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物，將其與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發生反應，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。本發明對所述精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽的來源沒有特殊限制，可以由市場購買。所述反應的時間優選為2(T30h，所述反應的溫度優選為6(T80°C。所述反應的催化劑優選為偶氮異丁腈。所述反應的溶劑優選為N，N- 二甲基甲酰胺。將得到的基因載體系統進行細胞轉染，結果表明，本發明提供的基因載體系統對Hela細胞轉染效率可達4X IO5 8X 108RLU/mgProtein，對Huh 7細胞的轉染效率可達79% 84。為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的基因載體系統及其制備方法進行說明，本發明的保護范圍不受以下實施例的限制。實施例I將3克分子量為3000的聚乙二醇溶于30mLDMF中，得到第一溶液；將ε -芐氧羰基-L-賴氨酸-N-內羧酸酐溶于30mLDMF中，得到第二溶液。將第二溶液注射到第一溶液中，30°C反應72小時，反應結束后用乙醚沉降，過濾干燥后，溶解在三氟乙酸中，加入溴化氫的乙酸溶液，在室溫下脫保護2小時，然后用乙醚沉降，干燥后用水溶解，3500Da的透析袋透析3天，換水6次，產物冷凍干燥后得到聚乙二醇-聚賴氨酸的共聚物。將Imol聚乙二醇-聚賴氨酸的共聚物與Imol帶巰基的RGD和Imol偶氮二異丁腈溶解在30mL無水無氧的DMF中，在70°C下反應24小時，得到精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物，即靶向配體。實施例2-9分別將聚乙烯亞胺(PEI)和天冬氨酸-N-內羧酸酐溶于二氯甲烷和DMF的混合溶劑中，二氯甲烷和DMF的體積比為1:2。將兩者混合，在30°C下反應72小時。然后加入ε -芐 氧羰基-L-賴氨酸-N-內羧酸酐的二氯甲烷和DMF的混合溶液，35°C反應72小時，反應結束后用乙醚沉降，過濾干燥后，溶解在三氟乙酸中，加入溴化氫的乙酸溶液，在室溫下脫保護2小時，然后用乙醚沉降，干燥后用水溶解，3500Da的透析袋透析3天，換水6次，產物冷凍干燥后得到聚乙二醇-聚天冬氨酸-聚賴氨酸的嵌段共聚物共聚物，記為PEI-b-PLAA-b-PLL。使用不同分子量的引發劑PEI,改變賴氨酸-NCA和天冬氨酸-NCA的摩爾量，可以得到不同分子量和組成的PEI-b-PLAA-b-PLL。其分子組成以及在不同pH值是的粒徑和電位數值如表I所示。表I實施例2、的原料、比例及產物的顆粒大小和表面電位
權利要求
1.一種基因載體系統，包括靶向配體、PH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質； 所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物； 所述PH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ； 所述基因物質為質粒DNA或siRNA。
2.根據權利要求I所述的基因載體系統，其特征在于，所述靶向配體與PH敏感遮蔽體系的質量比為(O. f 10) :1，pH敏感遮蔽體系與陽離子載體的質量比為(廣80) :1，所述陽離子載體與基因物質的質量比為(O. 5^50) :10
3.根據權利要求I所述的基因載體系統，其特征在于，所述pH敏感遮蔽體系中，所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ800，所述聚賴氨酸的分子量為400(Γ8000，所述聚天冬氨酸的分子量為3000 13000，所述聚谷氨酸的分子量為3000 13000。
4.根據權利要求I所述的基因載體系統，其特征在于，在所述靶向配體中，所述聚乙二醇的分子量為100(Γ2000，所述聚賴氨酸的分子量為200(Γ20000。
5.根據權利要求I所述的基因載體系統，其特征在于，所述陽離子載體為聚乙烯亞胺。
6.一種基因載體系統的制備方法，包括以下步驟 (A)將基因物質與陽離子載體混合孵育，得到二元復合物； 所述基因物質為質粒DNA或siRNA ; (B)將所述二元復合物與pH敏感遮蔽體系混合,得到三元復合物； 所述PH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為60(Γ1000，所述聚賴氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚天冬氨酸的分子量為100(Γ25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000 25000 ； (C)將所述三元復合物與靶向配體混合，得到基因載體系統； 所述靶向配體為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的聚合物。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物按照以下方法制備 將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐和賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的共聚物。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物按照以下方法制備 將聚乙烯亞胺與天冬氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物； 將所述聚乙烯亞胺-聚天冬氨酸共聚物與賴氨酸-N-內羧酸酐發生聚合反應，得到聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物。
9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述靶向配體按照以下方法制備 將聚乙二醇與賴氨酸-N-內羧酸酐反應，得到聚賴氨酸-聚乙二醇的共聚物；將所述聚賴氨酸-聚乙二醇聚合物與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽發生反應，得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物。
10.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(A)中，所述孵育時間為10 30分鐘。
全文摘要
本發明提供一種基因載體系統，包括靶向配體、pH敏感遮蔽體系、陽離子載體和基因物質；所述靶向配體為精-甘-天短肽、聚乙二醇和聚賴氨酸的共聚物；所述pH敏感遮蔽體系為超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的規則共聚物；超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和聚天冬氨酸的無規共聚物；或者超支化的聚乙烯亞胺、聚賴氨酸和的聚谷氨酸的無規共聚物；所述超支化的聚乙烯亞胺分子量為600~1000，所述聚賴氨酸的分子量為1000~25000，所述聚天冬氨酸的分子量為1000~25000，所述聚谷氨酸的分子量為1000~25000；所述基因物質為質粒DNA或siRNA。所述基因載體系統可與細胞有效結合，轉染效率高。
文檔編號C12N15/85GK102816795SQ201210310840
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者田華雨, 董璇, 陳學思, 郭兆培 申請人:中國科學院長春應用化學研究所