專利名稱：一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
背景技術：
在本文中，術語“Rh”是恒河猴(Rhesus Macacus)外文名稱的頭兩個字母。RhD抗原自1939年被發現以來，因導致新生兒溶血病、發生血管外遲發性溶血性輸血反應而成為紅細胞中僅次于ABO血型的重要抗原。Rh血型的抗原性很強，尤其以D抗原最強，僅次于ABO系統的A和B抗原。凡是人紅細胞上有RhD抗原者，為Rh陽性，反之為陰性。RhD陰性血型在中國人中所占比例約為3 5%。，屬于稀有血型。50% 75%的Rh陰性個體通過輸血和妊娠，可受D抗原紅細胞免疫而產生抗D ；隨著對Rh血型的不斷研究，認為Rh血型系統可·能是紅細胞血型中最為復雜的一個血型系。世界各國的衛生組織都嚴格規定，個體在輸血時，只能輸用Rh陰性血液。Rh血型的發現，對更加科學地指導輸血工作和進一步提高新生兒溶血病的實驗診斷和維護母嬰健康，都有非常重要的意義。Rh抗原是由位于I號染色體短臂上的兩個同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RhD和RhCE基因，每個基因都是由10個外顯子組成；RhD基因編碼D抗原，RhCE基因編碼Ce和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內含子有93. 8%的同源性,外顯子I 7編碼50 60個氨基酸,外顯子8 10編碼最后58個殘基。兩者最顯著的區別是內含子4，RhD的內含子4少了約600bp。RhD和RhCE基因分別長57295bp和57831bp，兩個基因相隔約30kb，尾對尾形成排列(5’RhD3’-3’RhCE5’)，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白I基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98. 6%同源性的區域被稱為Rh盒子(Rh boxes) ;RhD陰性的RhD基因缺失,兩端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rh box-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。見附圖I。近年來，研究發現一些血清學初檢RhD陰性的個體經過進一步敏感的血清學檢驗，如吸收放散試驗，可以能檢出D抗原的存在，即部分RhD陰性個體擁有難以檢測出的D抗原。進一步的研究顯示,此類D抗原又可以分為部分D(partrial-D)和弱表現型D(weak-D)兩種類型；部分D個體制表達部分而非完整的D抗原，在數量和本質上都與RhD陽性的D抗原有區別，而弱D表達的D抗原是完整的與RhD陽性相比，只有在D抗原數量上有顯著區別。這兩類特殊血型中都可以檢出D基因，這就有兩個方面值得探討一是這些個體的基因屬于沉默基因或無效基因；二是這些個體并非真實RhD陰性，而是D抗原較弱，一般檢測方法未檢測到RhD抗原。現已發現RhD陰性的個體中存在著一種重要的RhD的弱表現型DEL(D-elution, elution中文意為洗脫)，DEL在所占比例在不同文獻報告中所占的比例也不同，國外報告在黑人和日本人中DEL比例較高，約30 50%，中國人初篩RhD陰性的人群中香港報告DEL占30%，內地占20 30%。目前已證實DEL基因外顯子均無缺失，RhD基因表達調控的差異可能是DEL的產生原因，已有的研究顯示在中國大陸、中國臺灣和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外顯子的1227位發生G > A的突變引起的，導致mRNA產生變異，使蛋白質的表達量減少，但抗原性質未變；而1227位的G > A突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標記。DEL血型引起了日益增加的關注主要源于兩個方面一是目前國內外對DEL血型作為RhD陰性血型對待，DEL血液仍用于供給RhD陰性患者使用，但國內外都有越來越多的報道證實RhD陰性患者輸用DEL血液后，產生了抗-D抗體或體內抗-D抗體效價升高，可能引起輸血反應，成為臨床輸血中的不安全因素；二是DEL表達的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能夠輸用D陽性血液，從而節約寶貴的RhD陰性血液資源？以上的研究都必須對DEL血型進行準確的鑒定，同時大規模的檢測也需要采用可靠、簡便和經濟的方法才能夠進行。用免疫血清學的方法對DEL血型的檢出有賴于使用的抗-D試劑和操作方法，可靠性較低，而且由于步驟繁瑣而不適合臨床大規模應用，可靠的方法是應用基因檢測的方法·來檢出DEL血型。目前，國外已有多種根據1227位發生G > A的突變而設計的檢測試劑盒問世，可用于DEL血型的檢出，但存在以下缺點I、價格昂貴產自德國的BAG和INN0-TRAIN公司的D基因檢測試劑雖然可靠性好，但每人份約需1200 1300人民幣元，非常昂貴；產自美國G&T公司試劑，雖然每人份約需100人民幣元，但可靠性較差，而且這個價格仍然是大規模檢測難以承受的；2、操作繁瑣德國的BAG和IVIN公司的D基因檢測試劑每人份需要4 8個反應管，而美國G&T公司試劑每人份需要12個反應管，樣本DNA和耗材的消耗量很大，而且加樣繁瑣，容易出錯，同時判讀困難，不適于大規模的檢測工作；3、內對照均為人類生長激素基因，但我們實際使用中發現有內對照有擴增條帶，但檢測帶無擴增產物，不能判斷有些陰性結果是否是由于Rh基因降解所致。
發明內容
本發明的目的是為了克服前述試劑的缺點，提供一種經濟、簡便和直觀的分子生物學方法以及實施該方法的試劑盒。本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及為實施該方法制備的體外診斷試劑盒，用于檢測人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d 和 d/d 基因型。本發明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)來完成的。因此，本發明可被視為是基于PCR-SSP(Sequence specific primer,序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對不同位點而設計出序列特異性引物，然后通過優化序列特異性引物的混合比例、反應緩沖液組分和PCR反應條件，從而達到準確檢測出人類RhD血型基因型的目的。特別地，發明在已設計出的諸多序列特異性引物中篩選出了一組特異性相對較高的引物，如說明書表I所示的序列，有效地縮短了反應時間。并且優化了混合比例，極大地提高了反應的靈敏度，避免假陽性出現。在本文中，術語“多重PCR”是指通過在同一個反應中同時完成多個基因的擴增的篩選檢測方法。研究表明，對于成功進行多重PCR尤為重要的因素是用于擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、PCR緩沖液的濃度、循環溫度、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡。在一個實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(I)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8iil PCR引物緩沖液、2. 0 iU引物混合物、2. Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. 0 模板DNA，充分混合；(2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4 0C ；(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍
昭·
>、、、其中，所述PCR 引物緩沖液包含 2. Oil I 500mM KCl, 2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. Ou I 25mMMgCl2、0. I I. OM (NH4) 2S04、0 2. 0 y I DMS0、0 I. 0 y I 甘油和4. 0 6. I ii I DDW。所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ IDN05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp;SEQ ID N03和SEQ ID N04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp ；SEQ ID N05和SEQ ID N06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp ;SEQ ID N07和SEQ ID N08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在816bp，序列見表I。這種引物縮短了反應時間，提高了結果特異性。所有引物的濃度均為25pmol/yl，其混合比例為SEQ IDNOl SEQ ID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ IDN07 SEQ ID N08 = 4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，司選比例EQ ID NOl SEQID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQID N08 = 3. 5 3. 5 I. 5 I. 5 I. 5 I. 5 : 7 : 7。在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(I)在0. 5mL的Ependoff管內加入12. 8 U IPCR引物緩沖液、2. 0 U I引物混合物、
2.Ou IdNTP混合物、0. 2 u ITaqDNA聚合酶和3. 0 U I模板DNA,充分混合；(2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到40C ;以及(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照；其中，所述PCR 引物緩沖液包含 Oii I 500mM KC1.2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. 0 y I DDW。所有引物的濃度均為25pmol/iil，所述引物混合物混合比例為SEQ IDNOl SEQIDN02 SEQ ID N03 SEQ IDN04 SEQ IDN05 SEQ IDN06 SEQ IDN07 SEQ IDN08=4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(I)引物混合物I管；(2) PCR引物緩沖液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)陽性對照2管，陰性對照I管；以及(6)使用說明書；其中，所述的PCR引物緩沖液包含2.Oii I 500mM KCl,2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. Ou I 25mMMgCl2、0. I I. 0M(NH4)2S04、0 2. 0 y I DMS0、0 I. 0 y I 甘油和
4.0 6. I ii I DDff ；所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp ；SEQ IDN03和SEQ ID N04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp ;SEQ ID N05和SEQ ID N06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp ;SEQ ID N07和SEQ ID N08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在816bp，序列見表
I。所有引物的濃度均為25pmol/iil，其混合比例為SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ IDN06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，可選比例EQ ID NOl SEQ ID N02 SEQIDN03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =
3.5 : 3. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : 7 : 7。在本發明的另一實施方式中，本發明一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(I)引物混合物I管；⑵PCR弓丨物緩沖液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)陽性對照2管，陰性對照I管；以及(6)使用說明書；其中，所述PCR 引物緩沖液包含 Oii I 500mM KCl, 2. 0 u IlOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. 0 y I DDW。所述引物混合物包含SEQ ID N01、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ IDN05、SEQ IDN06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。混合比例為SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。在本發明另一實施方式中，本發明還涉及所述試劑盒在檢測人類RhD血型基因型中的用途。試劑盒為體外診斷試劑盒，用于檢測人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
本發明的一個或多個實施方式的細節在附圖和下面的說明中有描述。通過閱讀附圖、詳細描述和權利要求可以清楚地了解本發明的其他特征、目的和優點。
附圖I描述的是Rh血型基因組結構圖。RhD和RhCE基因尾對尾形成排列(5’ RhD3’ -3’ RhCE5’ )，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白I基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98. 6%冋源性的區域被稱為Rh盒子(Rh boxes);從圖中可以看到RhD陰性的RhD基因缺失,兩端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rh box-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。附圖2為單對引物的PCR反應電泳圖，通過單對引物的PCR反應結果，A為SEQIDNOl和SEQ ID N02擴增結果，產物大小為102bp,與目標產物相符；B為SEQ IDN03和SEQIDN04、SEQ IDN05和SEQ ID N06擴增結果，都獲得了目的片斷；C為SEQ ID N07和SEQ IDN08擴增結果，比對DL2000的標尺，產物大小為800bp左右，與目的片斷的大小相符，說明設計的引物合適。·附圖3為本試劑盒檢測RhD基因型電泳圖，其中，M :Marker，Takara，DL2000。1、2為INN0-TRAIN公司的標準質控對照，I為D/d型，2為d/d型，3 8為待測樣本，3為D/D，4為D/d，5為del/d，6為d/d，7為del/d，8為d/d。描述的是檢測本試劑盒靈敏度和特異性的試驗結果，判定格局為D/d型，目標條帶為3條,分別為206bp、261bp和816bp ;d/d型，目標條帶為2條，分別為206bp和816bp ；D/D型，目標條帶為2條，分別為206bp和261bp。DEL/d,目標條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和816bp ;根據不同的條帶可以判斷出檢測結果，INN0-TRAIN公司的標準質控對照D/d型和d/d型也被準確檢出。附圖4為INN0-TRAIN公司試劑盒RhD基因分型電泳圖。描述的是用本發明試劑檢出的D/d型、DEL/d型和d/d型用INN0-TRAIN公司的D基因檢測試劑盒進行復檢，根據表2的格局判斷結果，兩種試劑盒結果相符。
具體實施例方式本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法以及用于實施該方法的體外診斷試劑盒。本發明的方法和試劑盒可用于檢出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d 和 d/d 基因型。本發明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)來完成的。因此，本發明可被視為是基于PCR-SSP(Sequence specific primer,序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對不同位點而設計出序列特異性引物，然后通過優化序列特異性引物的混合比例、反應緩沖液組分和PCR反應條件，從而達到準確檢測出人類RhD血型基因型的目的。本發明的基礎部分在于對Rh血型基因的認識。Rh抗原是由位于I號染色體短臂上的兩個同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RhD和RhCE基因，每個基因都是由10個外顯子組成；RhD基因編碼D抗原，RhCE基因編碼Ce和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內含子有93. 8%的同源性。RhD和RhCE基因分別長57295bp和57831bp，兩個基因相隔約30kb，尾對尾形成排列(5’ RhD3’ -3’ RhCE5’ )，中間隔差一個功能未知的小膜蛋白I基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個具有98. 6%同源性的區域被稱為Rh盒子(Rh boxes) ;RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rh box-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。中國大陸、中國臺灣和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外顯子的1227位發生G > A的突變引起的，導致mRNA產生變異，使蛋白質的表達量減少，但抗原性質未變；而1227位的G > A突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標記。因此，設計出的引物必須能夠特異性地擴增出RhD基因而非RhCE基因，同時還能夠對不同的D基因型加以區分。原理見附圖2。在一個實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，基于對PCR-SSP以及由此發展出的多重PCR原理的應用。成功進行多重PCR尤為重要的因素是用于擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、PCR緩沖液的濃度、循環溫度、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡。該方法包括步驟(I)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8iil PCR引物緩沖液、2. 0 iU引物混合物、2. Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. 0 模板DNA，充分混合；·(2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4 0C ；(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。其中，緩沖液基于普通PCR緩沖液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐劑而配制，在實施方式中，試驗過不同濃度的甘油、DMSO、(NH4)2SOjP BSA等佐劑。雖然在多重反應中，有報道5%-10%的DMSO和甘油可以改善擴增的效率(提高產物量)和特異性(沒有非特異性產物)。本發明所述PCR引物緩沖液包含2. OiU 500mM KC1.2. Ou I IOOmMTris-HCl (PH 9. 0) ,2. Ou I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM (NH4)2 SO4、0 2. 0 y I DMS0、0 l.Oul 甘油和 4. 0 6. I ii I DDff0所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ IDN05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp;SEQ ID N03和SEQ ID N04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp ；SEQ ID N05和SEQ ID N06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp ;SEQ ID N07和SEQ IDN08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在816bp，序列見表I。所有引物的濃度均為25pmol/iil，在實施方式中，試驗了多種不同引物對之間的相對濃度，采用同一模板(已知D基因型)和反應條件下，對比產物的均衡性，最終確定了引物的的最佳比例。其混合比例為SEQ IDNOl SEQID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ IDN06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 = 4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，可選比例EQ ID NOl SEQ ID N02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQID N07 SEQ IDN08 = 3. 5 : 3. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : 7 : 7。反應條件如下94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，5640秒和72°C、1分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。可選反應條件為94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、35秒，55°C >40秒和72°C、I分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V, 20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(I)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8iU PCR引物緩沖液、2. 0 iU引物混合物、
2.Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. 0 模板DNA，充分混合；(2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4 0C ；
(3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍昭.
>、、、 在本發明中，5%的DMSO是反應的最佳濃度，增加和減少都對反應不利。而甘油的添加對反應會產生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴增的效率，但在本發明中沒有作用。本發明所述PCR引物緩沖液包含.OiU 500mM KCl,2.0u IIOOmM Tris-HCl (PH 9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和
5.Ou I DDW。所有引物的濃度均為25pmol/iil，所述引物混合物混合比例為SEQ IDNOl SEQIDN02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ IDN08 = 4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。在另一個實施方式中提供了本發明不同退火溫度下的反應結果，盡管許多基因能在退火溫度為56°C 60°C被特異的擴增，我們的經驗表明，，當同時擴增許多特異的基因時，擴增效率高的基因會使擴增效率低的基因的擴增產量降低。將退火溫度降低4°C 6°C對于在多重PCR中擴增出同樣的基因是必需的。過低的退火溫度會出現非特異性的擴增條帶，高的退火溫度會導致擴增缺失。最終確定的反應條件如下94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56 °C、40秒和72°C、1分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(I)引物混合物I管；(2) PCR引物緩沖液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)陽性對照2管，陰性對照I管；以及(6)使用說明書；其中，所述的PCR引物緩沖液包含2.Oii I 500mM KCl,2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. Ou I 25mMMgCl2、0. I I. 0M(NH4)2S04、0 2. 0 y I DMS0、0 I. 0 y I 甘油和
4.0 6. I ii I DDff ；所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02 分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴增片斷長度為102bp ；SEQ IDN03和SEQ ID N04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp ;SEQ ID N05和SEQ ID N06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp ;SEQ ID N07和SEQ ID N08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在816bp，序列見表
I。所有引物的濃度均為25pmol/iil，其混合比例為SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =
4 4 I I I. 5 I. 5 6. 5 6. 5，可選比例EQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =
3.5 : 3. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : I. 5 : 7 : 7。
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在本發明的另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(I)引物混合物I管；(2) PCR引物緩沖液I管；(3) Taq 聚合酶 I 管；(4) dNTP 混合物 I 管；(5)陽性對照2管，陰性對照I管；以及(6)使用說明書；其中，所述PCR 引物緩沖液包含 2. Oii I 500mM KCl, 2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH9. 0) ,2. 6u I 25mMMgCl2、0. I I. OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. 0 y I DDW。所述引物混合物包含SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。混合比例為SEQ ID NOl SEQ IDN02 SEQ ID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ IDN08 = 4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。反應條件如下94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，560C >40秒和72°C、I分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照；在本發明另一實施方式中，本發明還涉及所述試劑盒在檢測人類RhD血型基因型中的用途。試劑盒為體外診斷試劑盒，用于檢測人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。包含本發明所使用的多種其他試劑，如dNTP-Mix和Taq酶為非限制性的。現在已經一般性地描述了本發明，通過參考下面的實施例可以更容易地理解本發明，下面的實施例是通過說明的方式提供的，并不意味著對本發明的限制，除非特別說明。實施例實施例I引物序列的設計根據特異性的位點設計的弓丨物序列，所述引物混合物包含SEQ ID NOl、SEQ IDN02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07 和 SEQ ID N08。其中SEQ ID NOl和SEQ ID N02分別為特異性擴增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，SEQ ID NOl最末堿基針對1227位發生G > A的突變而設計，SEQ ID N02位于第9、10外顯子之間的內含子中，引物擴增片斷長度為102bp;SEQ ID N03和SEQ ID N04分別為擴增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內對照使用，擴增片斷長度為206bp ；SEQ ID N05和SEQ ID N06分別為特異性擴增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴增片斷長度為261bp ；SEQ ID N07和SEQ ID N08分別為特異性擴增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴增片斷長度為在816bp，序列見表I。表I本發明弓丨物序列表
引物名稱引物序列產物大小引物特異性
SEQ ID N01 5'-ATGACCAAGTnTCTGGAAA-3'
102bpDEL 基因·
SEQ ID N02 5_-CAGCAAGTCAACATATATACT-3'
SEQ ID N03 S'-ACTGACACCGACAGTCCTT-S'
206bp內對照SEQ ID N04 5'-GCTGTGTCCTGGCAATGGT-3’
SEQ ID N055'-GTAATGAGACATTTAGGCT-3’
261 bpD基因
SEQ ID N06 S'-CAACTCCATmCTCTGACT-S'
SEQ ID N07 5’-ACCTGGCCGCAACTGATTTT-3’Rh box.hybrjd
816bp
SEQ ID N08 S'-GCGGTGCATTAGCCGATTAG-S'(RhD陰ft)實施例2單對引物的PCR反應通過單對引物的PCR反應來驗證引物設計的合理性，以最終確定能夠用于多重PCR反應的引物組分。試驗材料為d/d、D/d和DEL型DNA，反應緩沖液為普通PCR緩沖液，Taq酶購自上海Promega公司，dNTP購自北京鼎國生物科技公司。反應體系為20yl :在0. 5mL的EpendofT管內加入 l.Oul 引物、2. OiUPCR 緩沖液、2. OiU 25mM MgCl2、I. 0 yldNTP 混合物、0. 2 ylTaq DNA聚合酶、3. 0 U I模板DNA和11. 8 yl雙蒸水，充分混合；根據引物的Tm值確定退火溫度，反應條件分別如下SEQ ID NOl和SEQ ID N02 :94°C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(940C >30秒，60。。、30秒和72 °C >30秒)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。SEQ ID N03和SEQ ID N04 :94°C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(940C >30秒，55 0C >30秒和72 °C >30秒)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。SEQ ID N05和SEQ ID N06 :94°C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(940C >30秒，56 0C >30秒和72 °C >30秒)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。SEQ ID N07和SEQ ID N08 :94°C變性5分鐘，然后進行30個循環的PCR反應(940C >30秒，59 0C >30秒和72。。、I分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。取出PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照；反應結果見附圖2，可見都有目的條帶，說明引物設計合理，可以擴增出目的條帶。
實施例3本發明與其他試劑盒對比在本發明的另一實施方式中，本發明一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含引物混合物I管；PCR引物緩沖液I管；Taq聚合酶I管；dNTP混合物I管；陽性對照2管，陰性對照I管；以及使用說明書；其中，所述PCR引物緩沖液包含2. O ill 500mMKCU2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH 9. 0),2. 6 u I 25mMMgCl2,0. 2u 11. OM(NH4)2SO4U-Ou IDMSO和5. 0 ill DDW。待檢DNA包括有INNO-TRAIN公司的標準質控對照，D/d型和d/d型；按照使用說明書，在0. 5mL的Ependoff管內加入12. 8u I PCR引物緩沖液、2. Oyl引物混合物、2. 0 u IdNTP混合物、0. 2 ill Taq DNA聚合酶和3. 0 yl模板DNA，充分混合；反應條件如下94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應(94°C、40秒，56°C >40秒和72°C、I分鐘)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C ;取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。INN0-TRAIN公司的檢測試劑盒可以檢出RhD基因型，，其使用方法如下取I. 5ml離心管I支,按照樣本的多少(設為X個樣本)加雙蒸水42X ill、試劑盒的紅色反應液(redPCR)21Xu I、Taq酶(5U/u 1)0. 56Xu 1，混勻備用；PCR反應液配制根據樣本數的多少，取X支I. 5ml離心管，并標記好樣本編號，每管加入63 u I前述配制的混合液，在加入7iUDNA，混勻。將樣本加入試劑盒的反應管中，10 iil/孔，共6孔。反應條件如下94°C變 性2分鐘，然后進行10個循環的PCR反應(94°C、20秒和65°C、I分鐘)，20個循環的PCR反應(94°C、20秒，61°C、1分鐘和72°C、30秒)，隨后72°C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4°C。根據其反應格局判斷檢測結果，其反應格局見表2表2INN0-TRAIN試劑盒反應格局
權利要求
1.一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含 (1)引物混合物I管； 所述引物混合物由下列序列組成SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ IDN07和SEQ ID N08，其序列見說明書中表I。
(2)PCR引物緩沖液I管； (3)Taq聚合酶I管； (4)dNTP混合物I管； (5)陽性對照2管，陰性對照I管；以及 (6)使用說明書。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于引物混合物的混合比例為SEQIDNOl SEQ ID N02 SEQ ID N03 SEQIDN04 SEQIDN05 SEQIDN06 SEQIDN07 SEQIDN08 = 4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。
3.如權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于PCR引物緩沖液包含2.0 ill 500mMKC1.2. Ou I IOOmMTris-HCl (PH 9. 0) ,2. Ou I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4^O ·2.Ou I DMS0、0 ~ I. Ou I 甘油和 4. 0 6. I ii I DDW。
4.如權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于，其中所述的所述PCR引物緩沖液包含 2. Oii I 500mMKCl、2. Oii I IOOmM Tris-HCl (PH 9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I·1.OM(NH4)2SO4U-Ou I DMSO 和 5. Oii I DDW。
5.一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟 (1)在0.5mL的Ependoff管內加入12.8u I PCR引物緩沖液、2. O yl引物混合物、·2.Ou IdNTP混合物、0. 2 U I TaqDNA聚合酶和3. O 模板DNA，充分混合，所述引物混合物由下列序列組成SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ IDN06、SEQ ID N07和SEQ ID N08，其序列見說明書中表I ; (2)將Ependoff管放入PCR擴增儀中，94°C變性5分鐘，然后進行35個循環的PCR反應94°C、40秒，56 °C、40秒和72 °C、I分鐘，隨后72 V延伸5分鐘，然后將溫度降低到4 V ；以及 (3)取出PCR產物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結果并拍照。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.OiU 500mMKC1.2. Ou I IOOmMTris-HCl (PH 9. 0) ,2. Ou I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM (NH4)2SO4'O ·2.Ou I DMS0、0 ~ I. Ou I 甘油和 4. O 6. I ii 1DDW。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.O ill·500mM KC1.2. Ou I IOOmM Tris-HCl (PH 9. 0) ,2. 6u I 25mM MgCl2^O. 2 u I I. OM(NH4)2SO4,·I.Oii I DMSO 和 5. Oii I DDff0
8.如權利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQ ID NOl、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ IDN07和SEQ ID N08，本發明提供的最佳混合比例為SEQ ID NOl SEQ ID N02 SEQID N03 SEQ ID N04 SEQ ID N05 SEQ ID N06 SEQ ID N07 SEQ ID N08 =·4 : 4 : I : I : I. 5 : I. 5 : 6. 5 : 6. 5。
9.如權利要求1-4中任一權利要求所述的試劑盒用于檢測人類RhD血型基因型，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
全文摘要
本發明涉及一種能夠檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點的改變，設計多對引物，進行聚合酶鏈反應(PCR)來完成的。因此，本發明可被視為是基于PCR-SSP(Sequence specific primer，序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對不同位點而設計出序列特異性引物，然后通過優化序列特異性引物的混合比例、反應緩沖液組分和PCR反應條件，從而達到準確檢測出人類RhD血型基因型的目的。在一個實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的多重PCR方法；在另一實施方式中，本發明提供了一種檢測人類RhD血型基因型的試劑盒。本發明的一個或多個實施方式的細節在附圖和說明中有描述。通過閱讀附圖、詳細描述和權利要求可以清楚地了解本發明的其他特征、目的和優點。
文檔編號C12Q1/68GK102787171SQ20121032545
公開日2012年11月21日 申請日期2012年9月5日 優先權日2012年9月5日
發明者葉世輝, 吳大洲, 左琴琴, 徐華, 段勇, 王滿妮 申請人:陜西省血液中心