專利名稱：一種rt-pcr法診斷溫石棉及人造礦物纖維致肺部病變的引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種引物，尤其涉及一種診斷溫石棉及人造礦物纖維所致肺部病變的引物。
背景技術：
石棉是天然纖維狀的硅酸鹽類礦物質，由于具有耐熱、保溫、耐磨、電絕緣以及耐化學腐蝕等優良的性能，多年來被廣泛應用于石棉水泥、紡織品、絕緣摩擦材料等的制造。石棉種類較多，根據化學組分的不同可分為角閃石石棉(包括青石棉、鐵石棉等)和蛇紋石石棉(溫石棉)兩大類。石棉由于其纖維狀的特性，被人體吸入后，附著并沉積在肺部，能夠 導致肺纖維化、間皮瘤和胸膜斑等的發生。石棉家族中危害最大的是青石棉，它具有較強的致癌性，在大多數國家已被禁用。而溫石棉具有柔軟且不耐酸的特性，與堅硬而耐酸堿的角閃石石棉相比，在人體內的持久性較差，易清除出體外，因此其危害相對較小。然而有關溫石棉安全性的多項流行病學研究和毒理學研究都提示我們溫石棉潛在的生物學危害不容忽視。溫石棉接塵工人的肺功能指標(包括FVC、FEVl等)較非接塵人群均有所下降。長時間暴露于低劑量的溫石棉可引起胸膜斑的發生，溫石棉暴露也可導致胸膜鈣化，引起纖維化病變和石棉肺的發生。單純溫石棉暴露能夠引起接塵人群肺癌和間皮瘤的高發，溫石棉已被認為是間皮瘤發病的主要原因。大量有關哺乳動物的接塵實驗證實溫石棉能夠導致肺部炎癥反應、石棉小體的產生以及纖維化病變發生。目前在全世界范圍內溫石棉的生產和使用已經逐漸遭到限制或禁止，與此同時各國也在積極開展石棉替代品的生產使用、危害及防護措施研究。人造礦物纖維(man-madevitreous fibers, MMVFs)是一類由玻璃、巖石、礦洛或其他經過加工的礦物材料等作為原料生產得到的非晶體結構的纖維狀硅酸鹽物質，在形態和性能等方面與石棉較為相似，因此也做為石棉替代品廣泛應用。人造礦物纖維的生產和應用發展很快，目前常用的包括耐火陶瓷纖維、玻璃纖維、巖棉等，隨著近年來的大量生產以及廣泛應用，它們對人體健康的危害也引起了人們的廣泛關注。早在耐火陶瓷纖維商業化生產后不久就有研究通過體腔注射的方法證實了耐火陶瓷纖維能夠引起大鼠體內間皮瘤的發生。長期吸入實驗進一步證實耐火陶瓷纖維主要損傷大鼠和倉鼠的肺部組織，吸入3個月后能夠觀察到巨噬細胞浸潤、肺泡外上皮細胞異常增生以及肉芽腫的形成，6個月后可觀察到明顯的局灶性胸膜纖維化。一些研究小組提供的細胞動力學和生化數據卻表明玻璃纖維能夠在小鼠和倉鼠體內引起纖維化反應。Takahashi研究小組與Guber等人分別于1996年和2006報道了一例長期吸入玻璃纖維誘發的肺纖維化病變。McConnell等人于1999年進行了一項關于巖棉的致病性研究，通過粉塵吸入實驗，觀察到倉鼠肺部纖維化現象的出現。呼吸性粉塵可經呼吸道進入肺部引起大量肺泡巨噬細胞游出，這一過程中不僅引發了氧自由基等產生，破壞細胞膜的結構和功能，還可刺激肺泡巨噬細胞、中性粒細胞等分泌各種細胞因子，這些細胞因子可以通過受損的肺泡上皮進入到肺間質，作用于相應的靶細胞從而引起它們的病理改變。當細胞因子作用于成纖維細胞，促使細胞大量增殖，或誘導細胞外基質蛋白表達增強，導致成纖維細胞大量增殖和膠原等細胞外基質蛋白的大量沉積，還可引起肺纖維化的產生。呼吸性粉塵致肺部病變的機制非常復雜，而且潛伏期較長，目前尚無有效的方法對其進行早期評估和早期篩查。近年來microRNA(miRNA)已經成為一類重要基因表達調控分子，具有廣泛多樣的生物功能。miRNA在線蟲中首次被發現，參與幼蟲的發育調控。成熟miRNA分子的形成過程包括若干步驟首先通過RNA聚合酶II轉錄合成原始miRNA (pri-miRNA),經核酸酶Drosha酶切產生具有莖環結構的miRNA前體(pre-miRNA) ；pre-miRNA通過轉運子Exportin 5從核內轉移到胞質中，經Dicer酶剪切后形成一條成熟的約22個核苷酸組成的小分子RN A，即成熟的miRNA分子。成熟的miRNA與Argonaute蛋白家族的成員組裝成核酸蛋白復合體miRNP，通過與靶標mRNA 3’端非翻譯區序列結合引起靶標mRNA的降解或翻譯抑制。miR-29 家族包括 miR_29a、miR-29b_l、miR-29b_2 和 miR_29c，而大鼠 miR-29b_l和miR-29b-2的序列完全相同，分別位于4號和13號染色體上。miR-29家族成員的靶基因較多，包括與肺纖維化直接相關的I型膠原和III型膠原等多種膠原分子，以及基質金屬蛋白酶、血小板衍生生長因子以及骨形態發生蛋白等已證實與肺纖維化密切相關的分子。miR-29已被證實與多種纖維化病變相關，包括肝纖維化、心肌纖維化、腎纖維化以及肺纖維化。體內或體外過表達miR-29能夠降低膠原表達量,而抑制miR-29表達則可導致膠原表達量的上升，纖維化病變加劇。miR-29受TGF- β /SMAD信號通路抑制，進一步調控其已知靶基因I型膠原以及其它纖維化相關分子，如整合素、原纖維蛋白等。已有多篇文獻指出miR-29可作為纖維化病變潛在的治療新靶點予以應用。現有研究證實miR-29參與博萊霉素誘導的特發性肺纖維化，將miR-29通過轉座子系統導入小鼠體內過表達可減輕其肺組織纖維化程度，同時還可減少炎性細胞的浸潤。但是目前有關miR-29與呼吸性粉塵引起的肺部病變之間的關聯尚未見報道。隨著人們對miRNA認識的不斷深入，與之相關的研究手段和技術方法也在不斷成熟，日益豐富。在miRNA的定量檢測方面，由于成熟miRNA不具備poly (A)尾，且序列很短，常規的oligo d(T)或隨機引物不能用于其逆轉錄反應。日前常用的stem-loop法使用帶有莖環結構的逆轉錄引物合成cDNA，該引物不僅特異性地針對某種miRNA，還能夠增加cDNA鏈的序列長度，便于后續的PCR擴增反應。這種定量檢測方法大大簡化了各類生物樣本中miRNA表達量的檢測，降低檢測成本，推動了 miRNA在生物醫學領域的發展和應用。而miRNA由于其小分子、穩定性強等特點，正逐漸成為臨床應用較為理想的生物標志物，而新技術的不斷發展也使得miRNA定量檢測在特異性和敏感性方面更具優勢，因此使用miRNA作為健康危害早期評估和早期篩查的生物標志物具有較好的可行性。
發明內容
本發明提供了一種RT-PCR法診斷溫石棉及人造礦物纖維所致肺部病變的引物，利用該引物可以對溫石棉致肺部病變進行早期篩查和評估。一種RT-PCR法診斷溫石棉及人造礦物纖維所致肺部病變的引物，為引物組A^l物組B或引物組C，每組弓I物包括逆轉錄弓I物和PCR擴增引物；引物組A:
逆轉錄弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG ；PCR 擴增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATCTGAAAT ；引物組B:逆轉錄引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACACT ；PCR 擴增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATTTGAAATC ；
引物組C:逆轉錄引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG ；PCR 擴增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATTTGAAAT ；所有引物組PCR擴增的下游引物為GTGCAGGGTCCGAGGT。miRNA作為一種小分子RNA，在組織及外周血中的表達都具有較好的特異性及穩定性，令其在疾病的診斷和篩查中表現出顯著的優勢。本發明發現miR-29家族成員在溫石棉等纖維粉塵暴露的大鼠肺部表現出顯著的表達改變，提出miR-29作為潛在效應生物標志物的可能。本發明通過建立大鼠染塵模型，在大鼠肺組織病理表現的基礎上，檢測miR-29家族成員在染塵大鼠肺組織中的表達情況。結果表明，miR-29b在6個月的所有纖維粉塵暴露組中都發生表達下調，因此可作為溫石棉及人造礦物纖維致肺部病變的潛在效應生物標志物；而miR-29c在3個月和6個月的溫石棉暴露組中都表現出表達量顯著降低，可用于溫石棉致肺部病變的早期篩查。本發明以miRNA定量檢測為技術平臺，提出擴增小分子RNAmiR-29家族成員的引物，從而實現將miR-29的表達作為溫石棉及人造礦物纖維所致肺部病變的效應生物標志物，為溫石棉及人造礦物纖維所致肺部病變的診斷和篩查提供了一種有力的檢測手段。
圖I為對照組大鼠肺組織(X100)切片電鏡圖。A :HE 染色；B: VG 染色。圖2為染塵后3個月溫石棉組大鼠肺組織切片電鏡圖。A HE 染色 X 100 ；B VG 染色 X 100 ；C :電鏡觀察 X 10000。圖3為染塵后3個月人造礦物纖維組大鼠肺組織(X 100)切片電鏡圖。A HE 染色；B VG 染色；A1 RWS ；A2 GWF ；A3 RFS ；A4 RF ；B1 RF ；B2 =RFS0圖4為染塵后6個月人造礦物纖維組和溫石棉組大鼠肺組織(X100)切片電鏡圖。A HE 染色；B VG 染色；A1 AS 組；B1 AS 組；A2 :RFS、B2 =RffS0圖5為溫石棉及人造礦物纖維暴露大鼠肺組織miR_29a/b/c的表達情況圖。A :染塵3個月；B :染塵6個月。
具體實施方式
I、粉塵制備將玻璃纖維、巖棉、耐火陶瓷纖維工廠材料和溫石棉樣品在瑪瑙研缽中加水研磨成粉狀，180度烘2h后繼續研磨至極細小粉末狀。將標準品粉塵180度烘2h后，稱重，瑪瑙
研缽中研磨至極細粉末。分散度如下表所示
2-5 nim5-10 mm>10 mm>20 mm
溫 Hil 24.23%41.85%20.70%13.22%
玻璃纖維標準品 7.09%26.49%39.93%26.49%
玻璃纖維 4.86%34.82%37.25%23.08%
耐火陶瓷纖維標準品 24.40%46.05%27.49%2.06%
耐火陶瓷纖維 10.05。/。38.28%37.80%13.88%
巖棉標準品 6.90%59.00%31.42%2.68%
Vrf'11 6.41%30.34%43.59%19.66%2、建立染塵大鼠模型將磨好的粉末溶于生理鹽水，配成懸液(溫石棉懸液為10mg/ml，人造礦物纖維懸液為20mg/ml)。高壓滅菌后待用。將90只兩周雄性SD大鼠隨機分成9組，包括空白對照組(BL)、生理鹽水組(NS)、溫石棉組(AS)、巖棉標準品組(RWS)、耐火陶瓷纖維標準品組(RFS)、玻璃纖維標準品組(GWS)、巖棉組(RW)、耐火陶瓷纖維組(RF)、玻璃纖維組(GW)。采用非暴露式氣管灌注法染塵(灌肺前先對其編號及體重稱量)，具體過程如下a)將大鼠用適量乙醚麻醉；b)將麻醉后的大鼠頸部皮膚夾緊，使其嘴部張開，身體自然垂下；c)打開大鼠的嘴部，在聚光燈下找到氣管，將針頭插入氣管；d)用注射器抽取Iml懸液(NS組為等量生理鹽水)，與針頭接緊后，抽動注射器，有氣體抽入則將溶液全部打出至肺中；若不能抽動注射器則表示針頭插入大鼠胃中，須拔出重新插入；e)拔出針頭，用吸耳球對準大鼠氣管處反復吹氣，促使溶液更好地進入肺部，減少上呼吸道殘留。f)將大鼠放開，拎住頸部上下輕抖，促使溶液進入肺部。g)觀察大鼠的生理狀況，待大鼠轉醒后，繼續飼養。3、肺組織病理形態觀察每組大鼠分別于染塵后3個月、6個月處死取材。部分肺組織用10%甲醛固定，經脫水、石蠟包埋后，按4 μ m的厚度切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色和Van Gieson (VG)染色(曹書芬等，2007 ;鄭集義，2005)。電鏡樣品經2. 5%戊二醛和I %鋨酸雙重固定，磷酸緩沖液清洗，50%,80%, 100%丙酮逐級脫水，環氧樹脂816包埋、聚合，超薄切片，經O. 5%醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色。分別于光鏡和電鏡下觀察肺組織的病理形態學改變，依據Szapiel法(Szapiel et al. , 1979)對每個肺組織進行肺泡炎及肺纖維化的程度病理分級，對結果進行分析。光學顯微鏡下觀察，空白對照組、生理鹽水組在這兩個時間點均未見明顯病變，肺組織結構清晰，肺泡間隔未見增厚，無炎癥、水腫及纖維化表現，肺泡腔內無明顯炎性滲出物及脫落上皮(圖I)。溫石棉組大鼠肺組織光鏡下可見肺間質纖維化，從細支氣管、周圍血管及鄰近肺泡壁至整個肺葉彌漫性改變程度不等，VG染色顯示呈深紅色的膠原纖維，電鏡下可見巨噬細胞胞漿內有大量空泡，腫脹變性明顯，肺泡間隔有較多纖維，6個月溫石棉組大鼠肺組織在上述病變的基礎上局部伴有蜂窩狀改變及肺泡結構破壞(圖2)。巖棉標準品組、耐火陶瓷纖維標準品組、玻璃纖維標準品組、巖棉組、耐火陶瓷纖維組、玻璃纖維組大鼠肺組織均未見明顯纖維化，VG染色未見明顯膠原纖維，主要表現為肺泡腔內可見巨噬細胞、脫落的上皮細胞及少量滲出液等炎癥性反應以及肺泡壁增厚，以耐火陶瓷纖維標準品組和耐火陶瓷纖維組尤為明顯(圖3)。6個月各人造礦物纖維組上述病變有所加重，但未見明顯纖維化(圖4)。人造礦物纖維具有致炎癥反應能力，表現為明顯的炎癥侵犯肺泡壁和鄰近的肺泡 腔，II型肺泡上皮細胞替代I型上皮細胞。人造礦物纖維暴露引起的大鼠肺組織形態學改變主要是巨噬細胞肺泡炎，不產生纖維化病變。提示這些粉塵的致肺纖維化能力較石棉組弱，或不具有致肺纖維化能力。4、miR_29 表達檢測首先查詢miRBase 數據庫(http://www. mirbase. org/),獲取大鼠 miR-29 家族成員的成熟序列，分別為Rno-miR-29a :5，-uagcaccaucugaaaucgguua-3 Rno-miR-29b_l/-2 :5， -uagcaccauuugaaaucaguguu-3，Rna-miR-29c :5，-uagcaccauuugaaaucgguua-3J根據stem-loop法原理,分別設計miR_29a、miR_29b和miR_29c的逆轉錄引物及
PCR擴增引物。PCR擴增引物的上游為特異引物，下游為通用引物。引物序列見下表
權利要求
1. 一種RT-PCR法診斷溫石棉及人造礦物纖維所致肺部病變的引物，為引物組A、引物組B或引物組C，每組引物包括逆轉錄引物和PCR擴增引物；其特征在于 引物組A : 逆轉錄弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACTAACCG ； PCR 擴增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCATCTGAAAT ； 引物組B : 逆轉錄弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACAACACT ； PCR 擴增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCAITTGAAATC ； 引物組C : 逆轉錄弓 I物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACTAACCG ； PCR 擴增引物的上游引物GCGGCGGTAGCACCAITTGAAAT ； 所有引物組PCR擴增的下游引物為GTGCAGGGTCCGAGGT。
全文摘要
本發明涉及一種RT-PCR法診斷溫石棉及人造礦物纖維致肺部病變的引物，包括引物對1、引物對2或引物對3，分別用于擴增miR-29a、miR-29b和miR-29c，堿基序列如SEQ ID NO.4～9所示。本發明通過建立大鼠染塵模型，在大鼠肺組織病理表現的基礎上，設計miRNA擴增引物，檢測miR-29家族成員在染塵大鼠肺組織中的表達情況，為溫石棉及人造礦物纖維暴露引起的健康危害提供了早期診斷和篩查的有效工具。
文檔編號C12Q1/68GK102827938SQ20121032842
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者張幸, 武為, 肖蕓, 朱麗瑾, 馮玲芳, 張敏 申請人:浙江省醫學科學院