專利名稱：山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇abcden的組合基因的制作方法
技術領域：
本發明屬于エ業微生物領域，涉及山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因。
背景技術：
維生素C (Vc)又名抗壞血酸，是機體營養、生長所必需的ー種微量水溶性維生素，在抗氧化和維持新陳代謝平衡等方面起著重要的作用，廣泛應用于制藥エ業、食品エ業、化妝品エ業和飼料エ業等，其應用范圍不斷擴展，市場需求穩定。在エ業生產中，維生素C主要通過“ニ步發酵法”生產，即第一步發酵使用黑醋桿菌將D-山梨醇轉化為L-山梨糖,第二步發酵使用氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) 和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)混合發酵將L-山梨糖轉化為維生素C的前體
2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)。其中氧化葡糖桿菌為產酸菌，但單獨培養生長和產酸能力很弱，需在伴生菌巨大芽孢桿菌促進下完成生長和產酸過程。兩菌混合發酵生產2-酮基-L-古龍酸的效率尚有提升空間，而提高產酸菌氧化葡糖桿菌的糖酸轉化能力是提高混菌發酵生產效率的關鍵。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因。本發明的第二個目的是提供ー種山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因。本發明的第三個目的是提供一種山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因。本發明的第四個目的是提供ー種含有山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合基因的轉化宿主細胞。本發明的第五個目的是提供ー種含有山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合基因的轉化宿主細胞。本發明的第六個目的是提供ー種含有山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因的轉化宿主細胞。本發明的技術方案概述如下一種山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因，它是列序表中SEQ ID No. 4所述核苷酸序列。ー種山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因，它是序列表中SEQ ID No. 5所述核苷酸序列。一種山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因，它是序列表中SEQ ID No. 6所述核苷酸序列。ー種含有山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN組合基因的轉化宿主細胞，是將含有序列表中SEQ ID No. 4核苷酸序列的重組載體導入到宿主氧化葡糖桿菌得到的轉化宿主細胞。ー種含有山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合基因的轉化宿主細胞，是將含有序列表中SEQ ID No. 5核苷酸序列的重組載體導入到宿主氧化葡糖桿菌得到的轉化宿主細胞。ー種含有山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因的轉化宿主細胞，是將含有序列表中SEQ ID No. 6核苷酸序列的重組載體導入到宿主氧化葡糖桿菌得到的轉化宿主細胞。本發明的方法通過構建山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成 基因簇ABCDEN不同組合方式的氧化葡糖桿菌重組菌，能明顯提高與巨大芽孢桿菌混合培養中的2-酮基-L-古龍酸的產量，最高能提高20%。
圖I為原始氧化葡糖桿菌及3種含有重組載體的氧化葡糖桿菌分別與巨大芽孢桿菌混菌發酵結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進ー步的說明。下面的內容及實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但并不用于限制本發明。本發明所使用的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)是以保藏編號為CGMCCNo. I. 110為例，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)以保藏編號為CGMCC No I. 459 %例，上述兩個菌均從中國普通微生物菌種保藏管理中心購得。所用質粒PBBR1MCS從中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心(Biovector Science Lab, Inc)購得。通過合成生物技術手段來改造氧化葡糖桿菌，搭配產酸關鍵酶——山梨糖脫氫酶和山梨酮脫氫酶的表達量及其輔酶——吡咯喹啉醌的合成量的最適關系，提高氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌混菌發酵轉化L-山梨糖為2-酮基-L-古龍酸的性能，提供一種山梨糖/山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因組合提高2-酮基-L-古龍酸產量的方法。實施例I(I)山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合的氧化葡糖桿菌構
建以氧化葡糖桿菌基因組為模板，以序列表SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8為引物，PCR擴增帶有KpnI和HindIII酶切位點的山梨糖脫氫酶基因(序列表SEQ ID No. I);以SEQ IDNo. 11和SEQ ID No. 12為引物，以氧化葡糖桿菌基因組為模板，PCR擴增帶有SpeI和SacI酶切位點的吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN及其上游啟動子(序列表SEQ ID No. 3);分別雙酶切后，與經KpnI和SacI酶切的載體pBBRlMCS連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α后驗證連接正確的質粒，再通過電轉化方法導入氧化葡糖桿菌，獲得山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN組合的氧化葡糖桿菌。
(2)山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合的氧化葡糖桿菌構建以氧化葡糖桿菌基因組為模板，以序列表SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10為引物，PCR擴增帶有HindIII和BamHI酶切位點的山梨酮脫氫酶基因(序列表SEQ IDNo. 2)，以SEQID No. 11和SEQ ID No. 12為引物，以氧化葡糖桿菌基因組為模板，PCR擴增帶有SpeI和SacI酶切位點的吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN及其上游啟動子(序列表SEQ ID No. 3)，分別雙酶切后，與經KpnI和SacI酶切的載體pBBRlMCS連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α后驗證連接正確的質粒，再通過電轉化方法導入氧化葡糖桿菌，獲得山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN組合的氧化葡糖桿菌。(3)山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合的氧化葡糖桿菌構建以氧化葡糖桿菌基因組為模板，以SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8為引物，PCR擴增帶有KpnI和HindIII酶切位點的山梨糖脫氫酶基因(序列表SEQ ID No. I),以氧化葡糖桿菌 基因組為模板，以SEQ ID Νο.9和SEQ ID No. 10為引物，PCR擴增帶有HindIII和BamHI酶切位點的山梨酮脫氫酶基因(序列表SEQ ID No. 2)，以氧化葡糖桿菌基因組為模板，以SEQID No. 11和SEQID No. 12為引物，PCR擴增帶有SpeI和SacI酶切位點的吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN及其上游啟動子(序列表SEQ ID No. 3)，分別雙酶切后，與經KpnI和SacI酶切的載體pBBRlMCS連接，連接產物轉化入大腸桿菌DH5 α后驗證連接正確的質粒，再通過電轉化方法導入氧化葡糖桿菌，獲得山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合的氧化葡糖桿菌。實施例2含重組載體的氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌的混菌發酵(I)固體培養固體培養基的制備為按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，瓊脂 20g，KH2P04 lg，MgSO4 O. 2g, CaCO3 Ig 加水至 1L，調 pH 為 6· 8，121°C滅菌20min，制成固體培養基；將實施例I獲得的保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的3種重組菌及原始菌株氧化葡糖桿菌分別取150 μ L接種于固體培養基上，30°C培養48小時；取150 μ L保藏于體積濃度為20%的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)接種于固體培養基上，30°C培養24小時；(2)種子培養種子培養基制備為按比例稱取L-山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素 lg，蛋白胨 10g，KH2P04 lg, MgSO4 O. 2g, CaCO3 Ig 加水至 1L，調 pH 為 6· 8，121°C滅菌20min,制成種子培養基；將經步驟(I)培養的3種重組菌及原始菌株氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養基，在30°C，250r/min搖床振蕩培養，48h，得到各氧化葡糖桿菌的種子液；將經步驟(I)培養的巨大芽孢桿菌轉入種子培養基，在30°C，250r/min搖床振蕩培養，24h，得到巨大芽孢桿菌的種子液；(3)發酵
發酵培養基制備為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4 Ig,MgSO4 O. 5g，CaCO3 lg，加水至1L，調pH為7. 0,121°C滅菌20min，制成發酵培養基；將巨大芽孢桿菌種子液和3種重組菌及原始菌株氧化葡糖桿菌種子液接種到發酵培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為4X108cfu/ml，使各種氧化葡糖桿菌的密度為4父1(^血/1111，在301，25017/1^11搖床振蕩培養120h，獲得2-酮基-L-古龍酸。實施例32-酮基-L-古龍酸和L-山梨糖含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)。·樣品制備取發酵培養不同時間的發酵液ImL于I. 5mL離心管中，10000r/min轉速離心3min,取上清100 μ L于I. 5mL離心管中，并加入900 μ L流動相(5mM H2SO4)得到稀釋十倍的樣品。振蕩混勻后，用O. 22μπι的纖維素微孔濾膜過濾樣品，得到待測樣品。高效液相色譜條件色譜柱bio-rad HPX-87H,流動相5mM H2SO4J^1速0. 6mL/min,柱溫65°C,示差檢測器。檢測結果見附圖I。原始氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌利用實施例2的發酵條件進行搭配混菌發酵的2-酮基-L-古龍酸濃度達65. 9g/L ;用實施例I的方法獲得3種重組菌和巨大芽孢桿菌混菌發酵的2-酮基-L-古龍酸濃度較原始菌株有提高，其中山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合(74. 2g/L )、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN組合(73. Og/L),山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN搭配(79. lg/L)，與原始混菌相比分別提高了 12. 6%, 10. 8%和20. 0%。實驗證明通過對產酸關鍵酶(山梨糖脫氫酶、山梨酮脫氫酶)和其輔酶吡咯喹啉醌合成途徑的不同組合搭配進行理性設計和組合優化，可以提高氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌體系發酵生產2-酮基-L-古龍酸的濃度。
權利要求
1.一種山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因，其特征是它是序列表中SEQ ID No. 4所述核苷酸序列。
2.一種山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因，其特征是它是序列表中SEQ ID No. 5所述核苷酸序列。
3.一種山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇AB⑶EN的組合基因，其特征是它是序列表中SEQ ID No. 6所述核苷酸序列。
4.一種含有山梨糖脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN組合基因的轉化宿主細胞，其特征是將含有序列表中SEQ ID No. 4核苷酸序列的重組載體導入到宿主氧化葡糖桿菌得到的轉化宿主細胞。
5.一種含有山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN組合基因的轉化宿主細胞，其特征是將含有序列表中SEQ ID No. 5核苷酸序列的重組載體導入到宿主氧化葡糖桿菌得到的轉化宿主細胞。
6.一種含有山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因的轉化宿主細胞，其特征是將含有序列表中SEQ ID No. 6核苷酸序列的重組載體導入到宿主氧化葡糖桿菌得到的轉化宿主細胞。
全文摘要
本發明公開了一種山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN的組合基因，是序列表中SEQ ID No.6所述核苷酸序列。本發明的方法通過構建山梨糖脫氫酶基因、山梨酮脫氫酶基因與吡咯喹啉醌合成基因簇ABCDEN不同組合方式的氧化葡糖桿菌重組菌，能明顯提高與巨大芽孢桿菌混合培養中的2-酮基-L-古龍酸的產量，最高能提高20%。
文檔編號C12N15/62GK102816780SQ20121033033
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者元英進, 杜瑾 申請人:天津大學