專利名稱：一種卵巢透明細胞癌診斷試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種利用HNFlB熒光探針制備的熒光原位雜交檢測試劑盒，還涉及HNFlB熒光探針的制備方法，本發明的HNFlB熒光探針及相應的試劑盒可用于卵巢透明細胞癌診斷和治療方案選擇。
背景技術：
卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖器官常見的腫瘤之一,發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴重威脅。卵巢癌的病因尚不清楚，其發病可能與年齡、生育、血型、精神因素及環境等有關。卵巢癌臨床早期無癥狀，鑒別其組織類型及良惡性相當困難，目前為止，臨床資料統計 五年生存率僅25% 30%。卵巢癌是相對常見的病，大約有1. 4%的女性會患上這種病。發現早，90 %的病人都能活下來；發現遲，癌細胞擴散到卵巢，存活率低于30 %。卵巢透明細胞癌(Ovarian clear cell carcinoma, OCCA)占卵巢癌的5% 11 %,發病平均年齡58歲，與子宮內膜異位癥的關系密切，在病變的卵巢中合并子宮內膜異位癥達24%左右，而同時存在盆腔子宮內膜異位癥病變的達25% 50%左右，這在其他卵巢上皮性癌中是少見的。卵巢透明細胞癌為惡性腫瘤，預后較其它分型更差，與臨床分期有密切關系。卵巢癌檢查有幾種方法，包括細胞學診斷、超聲波檢查、免疫學檢查等，但均不十分成功。目前而言，卵巢惡性腫瘤標志物的敏感性和特異性均不能滿足早期診斷的需要，多用來檢測治療中和/或治療后的病情變化，為評定療效和及時發現腫瘤復發提供依據。肝細胞核因子-1 (HNFI homeobox B, HNF1B)位于17號染色體長臂I區2帶，編碼一種包含同源結構域的轉錄因子超家族成員，編碼蛋白與DNA結合形成同源二聚體，或與 HNFla (hepatocyte nuclear factor1-alpha)結合形成異質二聚體。轉錄因子 HNFlB對胰腺細胞形成和維持血糖穩態具有重要作用。基因突變會導致腎囊腫和非胰島素依賴型糖尿病或稱為第二型糖尿病，在一些癌癥中該基因的表達會發生改變。目前有研究表明，HNFlB是卵巢透明細胞癌的生物標志物，可有效區分透明細胞癌與其它病變類型。臨床研究中通過RNA干擾該基因表達，能達到細胞凋亡目的，使該基因在治療方面有廣闊的應用前景。[Jin L, et al. Regulation of tissue-specific expression of renal organicanion transporters by hepatocyte nuclear factor I a /β and DNA methylation.JPharmacol Exp Ther, 2012Mar ;Stanislas Faguer, et al. Diagnosis, management, andprognosis ofHNFIB nephropathy in adulthood. Kidney International80,768-776 ;Berndt SI,Sampson J,Yeager M,et al. Large-scale fine mapping of the HNFlB locusand prostate cancer risk.Hum Mol Genet.201IAug 15 ；20 (16) :3322-9 ;Brimo F,Herawi M, Sharma R, et al. Hepatocyte nuclear factor-1β expression in clear celladenocarcinomas of the bladder and urethra diagnostic utility and implicationsfor histogenesis. Kim HJ, Bae JS, Lee J, et. al. HNFlBpolymorphism associatedwith development of prostate cancer in Korean patients. Hum Pathol. 201INov ；42(11) :1613-9. Urology. 201IOct ；78 (4) :969. el_6 ;Sohei Yamamoto，Hitoshi Tsuda，Shinsuke Aida, et, al.1mmunohistochemical detection of hepatocyte nuclearfactor
Iβ in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas and nonneoplasticendometrium. Human Pathology Vol. 38.1ssue 7，1074—1080 ；K. Yamaguchi，M. Mandai，T. Oura，N. Matsumura，J. Hamanishi and T. Baba et al.，Identification of an ovarianclear cell carcinoma gene signature that reflects inherent disease biology andthe carcinogenic processes, Oncogene 29(2010), pp.1741-1752.]目前試驗室檢測方法常見的有基于免疫組化的表達分析和基于熒光定量PCR方法(FQ-PCR)或測序技術的突變及缺失分析。[Harries LW, Brown JE, Gloyn AL(2009)Species-Specific Differences in the Expression of the HNF1A， HNFlBandHNF4AGenes. PLoSONE 4(11) e7855 ；Immunohistochemical detection of hepatocytenuclearfactor I β in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas andnonneoplastic endometrium. Human Pathology Vol. 38,Issue 7，1074-1080] 綜上，HNFlB因其在卵巢透明細胞癌中的特異表達特征，有望作為腫瘤鑒別分型和靶向治療的新靶標。但該基因的檢測方法目前僅停留在試驗室階段，市場無靈敏度高、特異性好的檢測試劑。熒光原位雜交技術基于堿基互補原則，用已知序列標記DNA探針與載玻片上的待測DNA/RNA互補雜交，在熒光顯微鏡下檢測雜交信號判斷結果。FISH技術將細胞遺傳學和分子生物學改變聯系起來，讓微小的基因改變顯現于肉眼之下，拓展了細胞遺傳學檢測的范圍，顯著提高了其識別異常染色體的能力。目前已被廣泛應用于腫瘤研究中的基因擴增、易位重排及缺失等檢測。本發明利用熒光原位雜交技術，以HNFlB基因區段為靶標，設計并制備熒光探針。利用探針實現對HNFlB基因狀態的檢測，有助于卵巢透明細胞癌鑒別分型和治療方案制定，從而達到早鑒別早治療，提高診療效果。本發明提供了一種卵巢透明細胞癌分子標志物HNFlB探針的制備方法，并在此基礎上利用探針自主研制了 HNFlB基因檢測試劑盒，填補了國內該檢測領域的空白，具有十分重大的意義。
發明內容
本發明的一個目的是提供HNFlB基因探針(GSP HNF1B)和作為內控的用于17號染色體鑒別的17號染色體著絲粒探針(CSP17)的制備方法。根據本發明一個優選的實施方案，GSP HNFlB的制備步驟包括(I)克隆篩選通過NCBI Mapview數據庫檢索所有含有HNFlB (17ql2)基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇最優的克隆。(2)克隆培養和鑒定按照篩選確定的克隆編號購買相應的克隆，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培養液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養8 12小時；針對HNFlB基因探針使用相應的STS弓丨物進行PCR擴增，并通過2 %瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選克隆的鑒定。(3)基因探針制備對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提取；通過OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行純化；獲得探針，避光、-20±5°C儲存。(4)基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。根據本發明一個優選的實施方案，CSP17的制備步驟包括(I)片段分析通過NCBI Mapview數據庫檢索重復區域序列，進行重復性分析。(2)引物設計針對重復片段,利用Primer Premier 5· O設計引物對。(3)克隆、培養和鑒定以人基因組DNA為模板，利用上述引物對進行PCR反應。通過電泳進行鑒定；將目的產物進行克隆、培養，同樣使用上述引物對進行PCR擴增，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選克隆的鑒定。(4)探針制備對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提取；通過OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行純化；獲得探針，避光、-20±5°C儲存。(5)探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。根據本發明一個優選的實施方案，克隆篩選步驟中含有HNFlB基因最優選的克隆，編號為 CTD-2257N17(chrl7 :36033624. · 36152533)。根據本發明一個優選的實施方案，克隆培養和鑒定步驟中使用的STS引物對序列為上游引物 5’-TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’ (SEQ ID NO 1)和下游引物 5’-TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’ (SEQ ID NO 2) ;PCR擴增條件為94°C 5 分鐘；(94 °C 30 秒，56。。30 秒，72 0C 45 秒)X 35 循環；72°C 7 分鐘。根據本發明一個優選的實施方案，用于制備CSP17探針的引物對序列為上游引物 5’-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’(SEQ ID NO 3)和下游引物 5’_AGTGITTCCAAACTGCTGAATC-3，(SEQ ID NO :4) ;PCR擴增條件為:94°C 5 分鐘；(94°C 30秒，56°C 30 秒，72°C 45秒)X 35循環；72°C 7分鐘。根據本發明一個優選的實施方案，探針制備步驟中克隆質粒DNA提取可使用市售的質粒提取試劑盒，優選Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。根據本發明一個優選的實施方案，探針制備步驟中克隆質粒DNA的定量是將質粒DNA稀釋后分別測定260nm和280nm下的吸光度，計算產物濃度。根據本發明一個優選的實施方案，探針制備步驟中質粒DNA進行熒光標記可以使用切口平移方法標記，利用DNaseI和DNA聚合酶I實現基因探針的熒光標記。根據本發明一個優選的實施方案，50 μ I切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在IOU 20U間，DNase I使用量在O. OOlU O. OlU間，標記條件為16°C 2小時。根據本發明一個優選的實施方案，探針標記的熒光素為熒光素標記的dUTP，并優選 Spectrum dUTP。根據本發明一個優選的實施方案，探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用I
2μ I滅菌純化水或Human Cot-1DNA (I μ g/ μ I)溶解沉淀。本發明的另一個目的是利用HNFlB基因探針和CSP17探針(內控)制備一種用于輔助卵巢透明細胞癌鑒別分型和治療選擇的HNFlB基因熒光原位雜交檢測試劑盒。為了實現本發明，我們采用了以下技術方案(I)樣本處理和制片按照原位雜交方法對樣本進行處理。
(2)雜交配制雜交液，主要包括標記探針和雜交緩沖液。合適溫度下進行8 16小時的雜交，然后以合適的洗液洗去未結合上的和非特異結合的探針；DAPI復染劑復染。(3)通過熒光顯微鏡相應濾塊觀察熒光信號，對不同信號進行觀察計數。基于以上技術方案發明的試劑盒包括1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA，DAPI復染劑，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據本發明的一個優選實施方案，雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSCjt酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為O. lg/ml。根據本發明的一個優選實施方案，熒光標記探針混合物包括GSP HNFlB和CSP17探針，每人份熒光標記探針混合物中兩種基因探針的使用量均為O. 5 μ I。
根據本發明的一個優選實施方案，由雜交緩沖液、熒光標記探針混合物和未標記的競爭性DNA配制雜交液，其中未標記的競爭性DNA選擇Human C0T-1DNA。每人份雜交液中加入7 μ I雜交緩沖液，I μ I熒光標記探針混合物，Human C0T-1DNA使用量為I μ g，并用H20 補至 10 μ I。根據本發明的一個優選實施方案，其中DAPI復染劑配制方法為50 250ng DAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS,甘油混合液)。利用本發明的試劑盒，依照常規的熒光原位雜交方法對人的中期和間期細胞進行信號計數。本發明與現有技術相比，具有下列優點(I)實現了對卵巢透明細胞癌新分子標志物HNFlB基因狀態的檢測；(2)進行準確、快速的信號計數、且結果重復性好；(3)無需進行細胞培養和制備高質量的中期染色體片，可用于中期或間期細胞信號計數，操作相對簡單；(4)通過制備成試劑盒，可以實現在腫瘤生物學、細胞遺傳學等領域的應用，有助綜合評價各分子標志物，了解其與腫瘤發生等的聯系。
圖1顯示GSPHNF1B克隆鑒定的電泳結果。目的產物223bps。其中I道為marker，2道為樣本；箭頭標示代表300bp。圖2顯示CSP17克隆鑒定的電泳結果。目的產物316bps。其中I道為marker，2道為樣本；箭頭標示代表300bp。圖3顯示人類外周血淋巴細胞中期染色體上GSP HNFlB (紅色)和CSP17(綠色)檢測結果。圖4顯示卵巢透明細胞癌組織樣本中GSP HNFlB (紅色)和CSP17 (綠色)的檢測結果。其中箭頭分別指示出兩色探針的熒光信號。圖5顯示卵巢漿液性囊性癌組織樣本中GSP HNFlB (紅色)和CSP17 (綠色)的檢測結果。其中箭頭分別指示出兩色探針的熒光信號。
圖6顯示HNFlB基因所在17ql2區段。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。
實施例1:GSP HNFlB探針的制備(I)引物設計克隆篩選=HNFlB基因位于人染色體17ql2區段，NCBI Mapview數據庫檢索所有含有HNFlB基因的克隆，篩選出包含有該基因的克隆，編號為CTD-2257N17。(參見附圖6)(2)克隆培養和鑒定購買克隆CTD-2257N17，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培養液(氯霉素抗性)中，37°C搖床中搖菌培養8 12小時；菌液使用上游引物5’ -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’ 和下游引物 5’ -TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’ 進行 PCR擴增，擴增條件為94°C 5分鐘；(94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X 35循環；72°C 7分鐘。對擴增產物進行電泳驗證，結果在223bps具有明亮的條帶(參見附圖1)。(3)基因探針制備鑒定陽性的菌液,使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照 說明書要求的操作方法進行質粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對質粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ μ I) = 0D260 X 50 (ng/ μ I)計算質粒DNA濃度。通過切口平移方法對質粒DNA進行突光標記，探針標記的突光素為SpectrumdUTP，選擇orange-dUTP標記HNFlB基因。按如下方案，嚴格避光條件下在冰上配制PCR反應體系。
組分加入量
IOxDNA聚合酶I buffer5 μ
0.5 mM dTTPI μ
I mM d3TPI μ
DNA聚合酶I lOU/μΙI μ
DNase I 0.001 U/μΙ5 μ
0.2 mM orange-dUTP2.5 μ
模板I Ag
水補足50μ1配完后震蕩混勻，16°C標記2小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制
標記產物45μ1
Human Cot-1 DNA5μ1
醋酸鈉(3mol/L)5μ1
無水乙醇125μ1混勻后置于_80°C冰箱中2小時，4°C 12000rpm離心20分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 12000轉/分鐘離心10分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避光干燥。使用I μ I滅菌純化水溶解沉淀，獲得HNFlB基因探針，避光、_20°C儲存。(4) HNFlB基因探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細胞或中期染色體(10號染色體)上均可見熒光信號。
實施例2 CSP17著絲粒探針的制備(I)引物設計通過NCBI Mapview數據庫檢索重復區域序列，進行重復性分析，利用Primer Premier 5· O設計引物對。(2)克隆、培養和鑒定以人基因組DNA為模板，利用上游引物5’-TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’ (SEQ ID NO :3)和下游引物5’-AGTGITTCCAMCTGCTGAATC-3進行PCR反應。擴增條件為94°C 5分鐘；(94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒)X 35循環；72°C7分鐘。對擴增產物進行電泳驗證，結果在316bps具有明亮的條帶(參見附圖2)。(3)探針制備鑒定陽性的菌液,使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit,按照說明書要求的操作方法進行質粒DNA提取，通過測定260nm和280nm處的吸光度對質粒DNA定量；按照公式雙鏈DNA濃度(ng/ μ I) = 0D260 X 50 (ng/ μ I)計算質粒DNA濃度。 通過切口平移方法對質粒DNA進行突光標記，探針標記的突光素為SpectrumdUTP，選擇green-dUTP標記CSP17探針。按如下方案，嚴格避光條件下在冰上配制PCR反應體系。
組分加入量
IO XDNA聚合酶I buffer5 μ
0.5 mM dTTP1.4μ1
I mM d3TPI μ
DNA聚合酶I lOU/μΙI μ
DNase I 0.001 U/μΙ3 μ
0.2 mM green-dUTP1.5 μ
模板I Kg
水補足50μ1配完后震蕩混勻，16°C標記2小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。對標記產物進行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1. 5ml離心管中依次加入醋酸鈉和無水乙醇，避光、冰上配制
標記產物45μ1
Human Cot-1 DNA5μ1
醋酸鈉(3mol/L)5μ1
無水乙醇125μ1混勻后置于_80°C冰箱中2小時，4°C 12000rpm離心20分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，加入Iml的70%乙醇，4°C 12000轉/分鐘離心10分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避光干燥。使用I μ I滅菌純化水溶解沉淀，獲得HNFlB基因探針，避光、_20°C儲存。(4)CSP17探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。包含中期或間期染色體DNA，熒光原位雜交后，間期細胞或中期染色體(17號染色體)上均可見熒光信號。實施例3 =HNFlB基因熒光原位雜交檢測試劑盒制備以10人份/盒為例。(I)雜交液配制
將標記好的探針依次放好，按下表方案配制熒光標記探針混合物
權利要求
1.一種輔助卵巢透明細胞癌診斷和治療方案選擇的HNFlB基因狀態熒光原位雜交檢測試劑盒，包括1)雜交緩沖液、熒光標記探針混合物、未標記的競爭性DNA、DAPI復染齊U，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于熒光標記探針混合物包含GSPHNF1B探針和17號染色體著絲粒探針，每人份熒光標記探針混合物中GSP HNFlB和CSP17探針的使用量均為O. 5 μ I。
2.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于未標記的競爭性DNA為HumanC0T-1DNA。
3.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于雜交緩沖液的組分包括去離子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去離子甲酰胺濃度為50% 70%，硫酸葡聚糖濃度為O. lg/ml。
4.根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于DAPI復染劑配制方法為50 250ngDAPI溶于Iml抗褪色液(10mg/ml對苯二胺/PBS,甘油混合液)。
5.一種制備權利要求1試劑盒所述HNFlB基因探針和17號染色體著絲粒探針的方法，如下 (1)片段篩選通過NCBIMapview數據庫檢索所有含有HNFlB基因的克隆，并對這些克隆進行篩選，選擇含有HNFlB基因最優的克隆，編號為CTD-2257N17(chrl7 36033624. . 36152533);通過NCBI Mapview數據庫檢索17號染色體重復區域序列，并進行重復性分析，選擇引物設計區域； (2)培養鑒定按照HNFlB篩選確定的克隆編號購買克隆(Invitrogen)，常規培養，使用針對HNFlB基因區域的STS引物進行PCR擴增，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物片段進行分析，從而完成待選HNFlB克隆的鑒定；CSP17以人基因組DNA為模板，利用設計的引物對進行PCR反應，通過電泳進行鑒定；將目的產物進行克隆、培養，從而完成待選CSP17片段鑒定； (3)探針制備對鑒定陽性的菌液，進行質粒DNA的提取；通過OD值的測定對質粒DNA進行定量；然后，通過切口平移方法對質粒DNA進行熒光標記；對標記產物進行純化； (4)探針驗證使用人類正常分裂中期淋巴細胞滴片進行探針驗證。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于包含HNFlB基因片段的克隆培養和鑒定步驟中使用的STS引物對序列分別為上游引物5’ -TGCACAGACTACAACCCTAAACC-3’和下游引物 5’ -TGTAGCACTGTTGTTCTTTGGG-3’ ；PCR 擴增條件為94°C 5 分鐘；(94°C 30 秒，56 0C 30 秒，72 0C 45 秒)X 35 循環；72°C 7 分鐘。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于制備CSP17探針的引物對序列為 上游引物5’ -TTGTAGAATCTGCGAAGGGAC-3’ 和下游引物5，-AGTGTTTCCAAACTGCTGAATC-3’ ；PCR 擴增條件為94°C 5 分鐘；(94°C 30 秒，56°C 30 秒，72 V 45 秒)X 35 循環；72°C 7 分鐘。
8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針制備過程中50μ I切口平移體系中DNA聚合酶I使用量在IOU 20U間，DNase I使用量在O. OOlU O. OlU間。
9.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針標記的熒光素為熒光素標記Spectrum dUTP。
10.根據權利要求5所述的制備方法，其特征還在于探針濃縮方法為乙醇沉淀濃縮，最后使用I 2 μ I滅菌純化水或Human Cot-1DNA (I μ g/ μ I)溶解沉淀。
全文摘要
本發明涉及一種利用HNF1B熒光探針制備的熒光原位雜交檢測試劑盒，還涉及HNF1B熒光探針的制備方法，本發明的HNF1B熒光探針及相應的試劑盒可用于卵巢透明細胞癌診斷和治療方案選擇。
文檔編號C12N15/10GK102994630SQ20121035788
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者李明, 何瑰, 陳華云 申請人:中山大學達安基因股份有限公司