一種hTERTmRNA的TRPCR檢測試劑盒及檢測方法

專利名稱：一種hTERTmRNA的TRPCR檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及ー種端粒酶催化亞基(hTERT)mRNA的預備模板PCR (Template-ReadyPCR, TRPCR)檢測試劑盒及檢測方法。
(ニ)
背景技術：
端粒酶(telomerase)是ー種特殊的逆轉錄酶,是由RNA和蛋白質組成的核糖核蛋白(RNP)復合物，包含3個主要成分端粒酶RNA (hTR)模板，端粒酶催化亞單位(hTERT)和端粒酶相關蛋白(hTLP)。hTR是端粒酶進行延伸反應的模板，約有450個堿基，其中包 含5’ -CUAACCCUAAC-3’的模板序列；hTERT是端粒酶逆轉錄酶的蛋白催化亞基，hTLP是端粒酶的調節單位。端粒酶的主要功能是利用染色體末端(端粒)的3’末端為引物，以自身RNA為模板合成端粒-TTAGGG-重復序列添加到染色體末端，從而維持端粒原有長度，使端粒的穩定和保護染色體的功能得以延續，細胞因逃逸漸進性衰老而達到“永生化”。在ー些特定的組織細胞，如生殖細胞、胚胎細胞、造血干細胞、外周血淋巴細胞、毛發、皮膚、子宮內膜等分裂旺盛的組織細胞中有低水平的活化端粒酶的表達，但在正常成熟的體細胞中則沒有端粒酶活性，這些體細胞因為端粒的逐漸縮短而導致衰老和死亡。極少數體細胞可能偶然通過激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延長可能給另外的基因損傷的積累提供機會，導致進行性腫瘤性發展，即癌變，因此，端粒酶的重新激活是體細胞向腫瘤細胞轉化，即癌變的關鍵步驟。對大量的臨床標本的檢測表明，絕大多數的腫瘤細胞都呈端粒酶陽性(>85%)，而在癌旁組織和正常組織的端粒酶陽性率很低(<5%)，因此，端粒酶是ー個被廣泛接受的特異性很高的腫瘤標志物。細胞內端粒酶的調控主要是通過hTERT的表達調控來實現的，hTERT mRNA的表達水平在癌細胞中有明顯上調，因此，對hTERT mRNA的檢測可能發展成為對癌癥進行檢測和分子診斷的有力手段。RT-PCR (reverse transcription 逆轉錄-聚合酶鏈反應)，指將逆轉錄(ReverseTranscription, RT)反應和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。RT- PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了ー種分析基因表達的快速靈敏的方法。然而，RT-PCR在臨床檢測應用方面，存在很大的改進空間，主要問題是(1)依賴于逆轉錄反應，且2步酶促反應(逆轉錄和PCR)的最優反應條件是有差異的，體系優化受到限制；(2)需要嚴格預防和抑制RNA酶的污染，需要提取純化RNA，前處理的過程復雜，操作要求高，步驟繁瑣，耗時長；(3)容易受到各種抑制物質的影響，容易受到假陽性的困擾；(4)逆轉錄酶的價格居高不下，操作成本很難降下來；(5)對于低豐度RNA的檢測靈敏度不夠高的時候，需要采用非常復雜和容易污染的套式PCR。

發明內容
本發明目的是提供ー種操作簡單快速、特異性強的用于端粒酶催化亞基(hTERT)檢測的試劑盒及檢測方法。本發明采用的技術方案是
ー種端粒酶催化亞基(hTERT) mRNA的預備模板PCR檢測試劑盒，主要包括(I)管內固定有探針A的錨定PCR管；所述探針A核苷酸序列如下5’ -GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3，；探針A是與目標RNA上一段序列互補的單鏈寡核苷酸DNA，這段序列位于下面所述的探針B互補結合的區域之外；探針A的錨定可以采用本領域常規方法進行，用于錨定探針A的固體介質，可以是塑料離心管，也可以是磁珠，凝膠顆粒或其他可以吸附結合核酸的固體介質；(2)探針 B，其核苷酸序列如下5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGITTCGGCG-3’ ；探針 B 是包含與目標 RNA 上另一段序列互補的單鏈寡核苷酸DNA，其結構為兩端是特異的PCR引物序列，中間為與目標RNA序列的互補序列；(3) PCR 引物NTPl :5，- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3，NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，；(4)裂解液；所述裂解液為本領域常規含有表面活性劑(如吐溫20、NP-40等)、用于細胞裂解的緩沖液；

(5) PCR緩沖液；所述緩沖液為PCR反應常規緩沖液；(6)洗滌液；所述洗滌液可為本領域常規含有表面活性劑(如吐溫20、NP_40等)的緩沖液。該試劑盒的原理如下(1)預先制備好與目標RNA上一段序列互補的錨定探針——探針A ;探針A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附結合核酸的固體介質上，作用是通過特異性地結合目標RNA,將目標RNA選擇性地吸附在固體介質上；(2)與目標RNA上另一段序列互補的模板探針——探針B ;探針B兩端帶有PCR引物序列，使用時是添加在裂解液中的；當細胞被裂解后，探針B通過部分雜交與目標RNA結合，這樣探針B也就被選擇性地吸附在上述固體介質上；(3)在雜交反應之后，經過反復清洗，只有能與探針A互補雜交結合的目標RNA分子及與該RNA雜交結合的探針B留在反應管中；(4)由于探針B兩端帶有PCR引物序列，這樣加入PCR反應液后，以探針B為模板，不需要RT，可直接進行PCR反應。優選的，所述裂解液組成如下l%(w/vol)SDS, 500mmol/L NaCl, 2mmol//L MgCl2,10mmol/L 2-疏基こ醇，0. lmg/ml 魚精 DNA (市購)，0.1% (vol/vol) Tween20,1% (w/vol)脫脂奶粉，溶劑為10mmol/L、pH7· 5的Tris_HCl。優選的，所述PCR 緩沖液組成如下50mmol/L KCl, I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/LdNTP，5% (vol/vol)DMS0,0. 05%(vol/vol) Tween20,0. 4XSYBR Green I(濃度 0.4X 的含義是，其中各組分在反應液中的終濃度為IXSYBR Green I中的0. 4倍，市購Miroprobe原液濃度為10000X，使用時按體積比稀釋至PCR緩沖液中終濃度為0. 4X即可)，0. 5U/20ulTaq 酶，溶劑為 10mmol/L、ρΗ9· O 的 Tris-HCl。優選的，所述洗滌液為TBST緩沖液，其終濃度組成為150 mmol/L NaCl, 0. 05%Tween 20，溶劑為 10 mmol/L、pH 7.5Tris_HCl。本發明還涉及利用所述試劑盒檢測端粒酶催化亞基mRNA的方法，所述方法包括
(I)取待測樣本，加入探針B和裂解液(裂解液中探針B添加濃度為O. Inmol/L 100nmOl/L)，反復吸打，轉移至離心管中，冰上放置20min，4°C離心，取上清液，得到裂解上清液；待測樣本可來自組織或細胞，或者臨床標本如痰液、血液等；待測樣本來自痰液時，裂解上清液獲得方法如下I飛ml痰液+ 5^10 ml痰融液,37°C振蕩IOmin, 4°C、5000 rpm離心IOmin,棄上清,取沉淀+ 200 ul裂解液(其中探針8濃度為1鹽01/1)，反復吸打，轉移到1.5 ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液組成PBS+0. 1% (w/vol) DTT0待測樣本來自細胞時，裂解上清液獲得方法如下24孔板細胞培養，吸去培養液，+ 200ul裂解液(其中探針B濃度為lnmol/L)，反復吸打，轉移到1.5 ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液； 1.5 ml離心管中，+ 200ul裂解液(其中探針B濃度為lnmol/L)，用吸頭搗碎組織，室溫振蕩IOmin,4°C>15000 rpm離心20min，取上清，得到裂解上清液；(2)取步驟(I)裂解上清液20uL至錨定PCR管中，6(T70°C保溫進行雜交反應5 15min，反應結束后吸干管內液體，以洗滌液洗滌T9次，吸干，加入20uL由PCR緩沖液和PCR引物(PCR反應液中引物對濃度為0. 2umol/L)配制的PCR反應液，進行PCR擴增，擴增產物進行SYBR熒光定量分析；在雜交反應之后，通過多次反復的洗滌，在洗去未雜交結合的核酸的同時，也洗去了其他可能干擾PCR反應的物質，從而保證了 PCR反應的特異性和成功率;(3)以空白裂解液作為陰性對照，按照步驟(I)和(2)方法進行處理和分析，以空白裂解液Ct值減去樣本Ct值的差值大于或等于1，判斷樣品為陽性。所述PCR擴增條件如下93°C預變性3min ;然后93°C 3s、66°C 30s, 35個循環。本發明采用最新的預備模板PCR (Template-Ready PCR，TRPCR)技術，整個PCR的前處理流程被簡化成裂解保溫洗滌等3步簡單操作，耗時由常規的4個小時以上，減少到50分鐘以下，不需要純化RNA，不需要去除DNA，不需要對RNA進行特別的保護，不需要進行逆轉錄反應，因此，操作簡單，快速，標準化程度高。由于RNA的利用率高，引物是特別優化設計，且通過洗滌步驟能去除各種干擾因素，PCR的特異擴增效率得到了很大的增強。


圖I為本發明原理示意圖；A:探針A;B:探針B;C:固定介質；P1/P2:引物對；RNA:目標RNA; IIII:雙鏈互補雜交結合。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I :洗滌去除非固定的探針B用于檢測hTERT mRNA 的探針 B : 5’ -CAGGAGCAGCATTCCATCACGCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’，陰影部分為與 mRNA 結合的互補序列，兩端為 PCR 引物序列。PCR 引物TABl CAGGAGCAGCATTCCATCACG, TAB2 CCTTCTCTGGACCTGCGACG。肺癌細胞株A549細胞于24孔板中進行細胞培養，1000個細胞/孔，過夜培養后，吸去培養液，+ 200ul裂解液B (裂解液添加探針B濃度為lnmol/L)，反復吸打，轉移到I. 5ml離心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm離心20min，取上清，得到細胞裂解上清液；裂解液B組成如下1%SDS,500mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2,10mmol/L 2-巰基こ醇，O. lmg/ml 魚精 DNA (Sigma 公司)，O. 1% Tween20,1% 脫脂奶粉，lnmol/L 探針 B，溶劑為10mmol/L、pH7.5 的 Tris-HCl ；取50ul的上述的細胞裂解液上清，其中含有lnmol/L的探針B，加到0. 2ml的PCR薄壁管中，66°C保溫lOmin，再吸干管內液體，以TBST緩沖液洗滌1，3，5，7，9或12次，加入50ul PCR反應液(50ul PCR緩沖液+引物對0. 2umol/L)，進行PCR程序(94°C 3min預變性，然后40個循環的94°C 3s,66°C 30s，ニ步法)，以SYBR green I熒光定量分祈，結果顯示洗滌次數達到及超過5次，探針B不再有強于空白対照的擴增信號(Ct值與空白相當)，表明洗滌步驟可以徹底洗掉不結合的探針DNA。
洗滌次數Ct-空白対照Ct-探針B
I29.1115.15
328.2421.33
528.5427.25
728.7328.31
929.3128.63
1228.7128.32空白対照的Ct值(來源于引物ニ聚體)在28. 2Γ29. 31之間。當洗滌次數達到及超過5次，探針B的Ct值為27. 25 28. 63，與空白対照的值相當，說明不再有特異擴增。TBST 緩沖液組成150 mmol/L NaCl, 0. 05% Tween 20，溶劑為 10 mmol/L、pH7.5Tris-HCl ；PCR 反應液(SYBR 熒光定量)組成50mmol/L KC1，I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/LdNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4X SYBR Green 1,0. 5U/20ul Taq酶，0. 2umol/L引物對，溶劑為 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。實施例2 :磁珠法制作錨定管用于錨定hTERT mRNA 的探針 A : 5，- GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA。TBST緩沖液20ul，含有IOug Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和2pmol生物素化的探針A (生物素化的探針A由合成時直接修飾加在5’端)，裝入O. 2ml的PCR薄壁管中，室溫lhr，以磁鐵將磁珠吸附在管壁內，吸干管內液體，加50ul TBST緩沖液，打勻，吸干，如此反復洗滌共6次，最后吸干；加50ul TE緩沖液，備用。細胞裂解24孔板細胞培養，吸去培養液，+ 200ul裂解液B (同實施例I )，反復吸打，轉移到I. 5 ml離心管中，冰上20min, 4°C> 15000 rpm離心20min,取上清,得到細胞裂解上清。然后以磁鐵將磁珠吸附在管壁內，吸干管內液體，加入20ul細胞裂解上清，其中含有探針B，66°C保溫5min，再以磁鐵將磁珠吸附在管壁內，吸干管內液體，以TBST緩沖液洗滌6次，加入20ul PCR反應液(SYBR熒光定量)，進行PCR程序(95°C 2min預變性，然后40個循環的95°C 3s,66°C 30s, ニ步法)，SYBR熒光定量分析。用這種方法，對1(Γ10000個A549細胞進行檢測，可以得到陽性結果(細胞裂解液上清的Ct值小于空白裂解液的Ct值)。
權利要求
1.ー種端粒酶催化亞基(hTERT) mRNA的預備模板PCR檢測試劑盒，主要包括 (1)管內固定有探針A的錨定PCR管；所述探針A核苷酸序列如下5’-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3’ ； (2)探針B，其核苷酸序列如下5，-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3，； (3)PCR 引物NTPl :5，- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3，NTP2 :5， - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，； (4)裂解液; (5)PCR緩沖液； (6)洗滌液。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述裂解液組成如下1%SDS,500mmol/LNaCl, 2mmol/L MgCl2,1Ommol/L 2-疏基乙醇,O. lmg/ml 魚精 DNA, 0.1% Tween20,1% 脫脂奶粉，溶劑為 10mmol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。
3.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述PCR緩沖液組成如下50mmol/LKCl,I. 5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4XSYBR Green I,0.5U/20ul Taq 酶，溶劑為 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述洗滌液為TBST緩沖液。
5.利用如權利要求I所述試劑盒檢測端粒酶催化亞基mRNA的方法，所述方法包括 (1)取待測樣本，加入探針B和裂解液，反復吸打，轉移至離心管中，冰上放置20min，4°C離心，取上清液，得到裂解上清液； (2)取裂解上清液20uL至錨定PCR管中，6(T70°C保溫5 15min，吸干管內液體，以洗滌液洗滌3、次，吸干，加入20uL由PCR緩沖液和PCR引物配制的PCR反應液，進行PCR擴增，擴增產物進行SYBR熒光定量分析； (3)以空白裂解液作為陰性對照，按照步驟(I)和(2)方法進行處理和分析，以空白裂解液Ct值減去樣本Ct值的差值大于或等于1，判斷樣品為陽性。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下93°C預變性3min；然后93°C 38、66で308，35個循環。
全文摘要
本發明提供了一種端粒酶催化亞基(hTERT)mRNA的檢測試劑盒及檢測方法，所述試劑盒主要包括(1)管內固定有探針A(SEQ ID No.1)的錨定PCR管；(2)探針B(SEQ ID No.2)；(3)PCR引物(SEQ ID No.3/4)；(4)裂解液；(5)PCR緩沖液；(6)洗滌液。本發明與采用傳統的RT-PCR方法的試劑盒相比，采用本試劑盒不需要純化抽提RNA，不需要進行逆轉錄反應，將原本長達3個小時以上的PCR前處理過程縮短為約50分鐘，因此，操作簡便快速易行，具有較高的RNA檢測的靈敏度和特異性，適合對各種來源的細胞， 包括從組織，痰液，血液等標本中收集的細胞進行hTERT mRNA的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102851387SQ20121036976
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者陳燃, 伍迪, 金曉錚 申請人:浙江今復康生物科技有限公司