專利名稱：一種奶山羊plzf基因及其促雄性生殖干細胞自我更新的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及生殖細胞自我更新相關基因，特別涉及一種奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干細胞自我更新的應用。
背景技術：
哺乳動物的精子發生包括精原干細胞(雄性生殖干細胞)的增殖、分化、發育等一系列細胞形態和生理功能的改變，最終生成精子的整個過程。其中雄性生殖干細胞的自我更新是精子發生過程中的關鍵步驟，也是雄性動物終生產生精子的基礎。PLZF是POZ家族的新成員，是人類精子發生過程自我更新的關鍵調控因子，在睪丸組織特異性表達。PLZF是一個近期被人們發現并重視的新基因(Buaas Fff, Kirsh AL，Sharma M，McLean DJj Morris 幾，Griswold MD，de Rooij DGj Braun RE. PLZF isrequired in adult male germ cells for stem cell self-renewal. Nature genetics2004，36(6):647-52;Costoya JA，Hobbs RMj Barna M，et al. Essential role of PLZF inmaintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics 2004，36(6):653-9.)。PLZF即早幼粒細胞白血病鋒指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger),是由中國學者在國際上首次發現并克隆的基因，亦是我國學者在國內自行發現的第一個人類疾病相關基因(Chen Zj Brand NJj Chen A, Chen SJj Tong JHj Wang ZYj Waxman S，ZelentA.Fusion between a novel Kruppel-Iike zinc finger gene and the retinoicacid receptor-alpha locus due to a variant t (11;17)translocation associatedwith acute promyelocytic leukaemia. The EMBO Journal 1993，12(3):1161-7;ChenSJjZelent A，Tong JHjet al. Rearrangements of the retinoic acid receptor alphaand promyelocytic leukemia zinc finger genes resulting from t (11;17) (q23;q21)in a patient with acute promyelocytic leukemia. The Journal of ClinicalInvestigation 1993，91 (5):2260-7.)。PLZF功能的缺失擾亂了精原干細胞(SSCs)增殖與分化之間的平衡，使之由增殖轉向分化。PLZF為成年雄性動物的精原干細胞自我更新所必需的，PLZF有助于精原干細胞在雄性生殖腺中駐留。PLZF定向敲除導致雄性不育，PLZF在單個、成對或結成鏈狀的未分化的精原細胞中均有表達(Buaas Fff, Kirsh AL, Sharma M, et al. PLZF is required inadult male germ cells for stem cell self-renewal. Nat Genet 2004, 36:647-652. X干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。已有研究證實干細胞可以在體外分化為早期生殖細胞，甚至進一步分化為卵母細胞或精子(HUbnerK，Fuhrmann G，Christenson LKj et al. Derivation of oocytes from mouse embryonicstem cells[J]. Science，2003，300:1251 - 1256;Geijsen N，Horoschak M，Kim K，etal. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stemcells[J]. Nature, 2004，427:148 - 154.)。
雖然至今建立了多種用于雄性生殖干細胞體外增殖和分化的研究體系，Knockout實驗也發現了許多調控自我更新的關鍵基因和蛋白，但是還不能完全實現建立體外進行自我更新和精子發生的研究模型，體外很難控制雄性生殖干細胞自我更新的起始。因此，通過構建一些增殖多能性關鍵基因的真核表達載體，利用其修飾體外培養雄性生殖干細胞，探索功能基因之間的關系，發現相關調控自我更新的信號途徑，進而揭示自我更新過程基因之間相互作用的分子機制具有重要的科學意義。
發明內容
本發明解決的問題在于提供一種奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干細胞自我更新的應用，將外源PLZF基因轉染雄性生殖干細胞可促其進行自我更新，可研究PLZF對雄性生殖干細胞特異基因表達的調控作用。本發明是通過以下技術方案來實現 一種奶山羊PLZF基因，該基因序列如SEQ. ID. NO. I所不。一種奶山羊PLZF基因，其基因的CDS序列如SEQ. ID. NO. 2所示。 一種奶山羊PLZF基因的融合基因，在奶山羊PLZF基因的下游連接熒光報告基因。所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，還在熒光標記基因的下游連接抗生素篩選基因。一種基于奶山羊PLZF基因序列構建的表達載體，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游連接熒光標記基因GFP，在GFP的下游連接抗生素篩選基因 IcanYneolrtj所述的基于PLZF基因序列構建的表達載體為pPLZF-IRES2-EGFP表達載體，通過Ecor I和BamH I酶切位點將PLZF基因克隆到pIRES2_EGFP表達載體。奶山羊PLZF基因序列轉染到雄性生殖干細胞中以促進雄性生殖干細胞自我更新的應用。一種促進奶山羊雄性生殖干細胞自我更新的方法，包括以下步驟I)克隆如SEQ. ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并將PLZF基因序列通過Ecor I和BamH I酶切位點克隆到pIRES2_EGFP表達載體中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表達載體；2)將待轉染的奶山羊雄性生殖干細胞與PPLZF-IRES2-EGFP表達載體共同孵育，將pPLZF-IRES2-EGFP表達載體轉染到雄性生殖干細胞之中；轉染后3 4h，將奶山羊雄性生殖干細胞在基本培養基上添加其體積10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巰基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺進行培養；所述的基本培養液為DMEM/F12培養液或H-DMEM培養液；并在熒光顯微鏡下對熒光標記基因進行觀察，篩選啟動自我更新相關基因表達水平增高的細胞。還以人的293T細胞的轉染作為對照，該細胞所采用的基本培養液為H-DMEM培養液。所述的啟動自我更新相關基因為PCNA、C-MYC, 0CT4、PLZF, CDK2和CYCINA1。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果
I、本發明克隆了奶山羊的PLZF基因，其CD區大小為2022bp(SEQ. ID. NO. 2)，在其CDS序列的保守性達90%以上；該基因可促進雄性生殖干細胞自我更新。2、本發明在克隆奶山羊的PLZF基因的基礎上，構建了 pPLZF_IRES2_EGFP重組載體，利用PPLZF-IRES2-EGFP重組載體轉染細胞，轉染后，隨時間延長，表達GFP的細胞數增多。pPLZF-IRES2-EGFP轉染293T后，細胞形態也未發生顯著變化，但是增殖和多能性 標記基因的表達水平略有上調，表明細胞有進入自我更新的趨勢；轉染奶山羊雄性生殖干細胞后，細胞形態發生顯著變化，啟動自我更新相關基因的表達水平顯著增高。
圖I是PCR擴增的PLZF基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是Ecor I和BamH I雙酶切鑒定陽性重組載體pPLZF_IRES2_EGFP ；圖3是奶山羊PLZF基因⑶S序列與人、牛、綿羊、大鼠、小鼠、山羊等物種序列比較所構建的系統進化樹；圖4是熒光顯微鏡觀察重組載體pPLZF-IRES2-EGFP在293T細胞的表達；圖5是熒光顯微鏡觀察重組載體PPLZF-IRES2-EGFP在奶山羊雄性生殖干細胞的表達后增殖多能性基因的表達；圖6是奶山羊雄性生殖干細胞轉染pPLZF-IRES2-EGFP 48h后生殖細胞特異性標記基因表達的RT-PCR結果。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I、奶山羊PLZF基因的克隆及載體構建首先提取奶山羊睪丸組織總RNA，反轉錄試劑盒得到cDNA，作為擴增的模板；用電子克隆技術結合Primer Premier 5. O引物設計軟件設計擴增引物,并選擇合適的限制性內切酶，具體設計以下引物上游引物RRtRaattCRCCRRtRRtRatttRCtaaC下游引物attRRatccccatcRcttctcctcctRct上游引物中劃線部分為Ecor I酶切位點，下游引物中下劃線部分為BamH I酶切位點；PLZF基因PCR擴增反應體系為15 μ L，其中包括10Xbuffer I. 5 μ L，MgCl2(25mmol/L) I. 6μ L, dNTP (2. 5mmol/L) I. 2μ L, Taq DNA 聚合酶 0· I μ L，上、下游引物(10 μ mol/L)各 O. 3 μ L，cDNA 模板 O. 5 μ L, ddH20 9· 5 μ L。反應程序94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸90s，共35個循環，最后72°C補延伸10min，4°C保存。回收并純化PCR產物，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在約2320bp (檢測結果如圖I所示)處出現特異性擴增條帶，得到奶山羊的PLZF基因；然后將PCR產物、pIRES2-EGFP真核表達載體(Addgene)分別用Ecor I和BamH I雙酶切后連接，將PLZF基因克隆入pIRES2_EGFP真核表達載體，構建重組載體PPLZF-IRES2-EGFP。將重組載體pPLZF-IRES2-EGFP進行Ecor I和BamH I雙酶切鑒定，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，雙酶切鑒定結果如圖2所示，在2320bp和5300bp處出現目的條帶，也即克隆到的PLZF基因目標片段和酶切之后剩余的PIRES2-EGFP載體骨架。通過挑取多個單克隆酶切驗證后測序，大小和序列一致，測序后得到PLZF基因序列，核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。將奶山羊PLZF基因中的⑶S序列，如SEQ. ID. NO. 2所示(⑶S序列是編碼一段蛋白產物的序列，各物種之間CDS區的高度相似，也就意味它們翻譯出的蛋白所構成的氨基酸更為相似，發揮的功能也更為相似，即蛋白的功能更為保守)。與GenBank上公布的人、牛、山羊、綿羊、小鼠、大鼠等物種的PLZF基因⑶S序列比較，用DNAMAN軟件進行比對，構建系統進化樹，結果如圖3所示。生物信息學分析表明PLZF基因的CDS序列在多個物種高度保守，也就是說PLZF蛋白在各物種中的功能較為保守。 2、重組載體的轉染及轉染后細胞的觀察將處于對數生長期的293T細胞及奶山羊雄性生殖干細胞用O. 25%胰蛋白酶消化吹打成單細胞懸液，接種到鋪有明膠的24孔培養板中。培養細胞至約70%時融合，按照Fermentas公司的TurboFect 轉染說明書分別進行pPLZF_IRES2_EGFP重組載體的轉染。具體為將2μ g載體加入300μ I opti-MEM培養液中，再加入4 μ I TurboFect轉染試齊[J，溫和混勻。室溫孵育20min后，將TurboFect/DNA混合物均勻加入培養皿內。轉染后3-4h, 293T的培養基更換為H-DMEM+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10%體積濃度的胎牛血清培養；奶山羊雄性生殖干細胞的培養基更換為DMEM/F12+0. lmmol/L β -巰基乙醇+2mmol/L L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+10%體積濃度的胎牛血清。轉染后，在熒光顯微鏡下，293T和奶山羊生殖細胞中均觀察到綠色熒光蛋白(GFP)的表達。隨時間延長，表達GFP的細胞數增多。pPLZF-IRES2-EGFP轉染293T(圖4)后，細胞形態并未發生顯著變化，但只有轉染了 PLZF重組載體的細胞出現GFP綠色熒光，并且在這些細胞中能檢測到PLZF的表達(圖4e-g)，表明所構建的重組載體pPLZF-IRES2-EGFP能順利轉染293T細胞并表達PLZF蛋白。圖4中的對照轉染pIRES2-EGFP的293T，分別為在明場和熒光顯微鏡下的觀察結果；圖4中轉PLZF中無熒光點的圖為未轉進去的293T，出現熒光點的圖為轉染PLZF重組載體的293T細胞。pPLZF-IRES2-EGFP重組載體轉染奶山羊雄性生殖干細胞后，熒光觀察結果如5所示，細胞形態發生顯著變化，轉染重組載體的細胞為上皮樣，對照組細胞呈纖維狀。圖5提示轉了 PLZF后細胞啟動自我更新相關基因PCNA、C-MYC、0CT4、PLZF的表達水平顯著增高。所述的自我更新、增殖多能性以及周期相關基因采用RT-PCR來檢測，擴增反應體系為 15 μ L :其中包括10 X buffer I. 5 μ LjMgCl2 (25mmol/L) I. 6 μ L，dNTP (2. 5mmol/L)I. 2μ L, Taq DNA 聚合酶 0. I μ L，上、下游引物(10 μ mol/L)各 O. 3 μ L，cDNA 模板 0· 5 μ L，ddH20 9. 5 μ L0
反應程序94°C預變性5min，94°C變性30s，退火30s，72°C延伸90s，共35個循環，最后72°C補延伸10min，4°C保存。RT-PCR檢測結果如圖6所示，轉染pPLZF-IRES2-EGFP的細胞較未轉染的對照細胞 的卩0應、0]^(、0(^4、？1^ 、0)1(2、0￥(1嫩1的表達水平顯著增高。說明PLZF基因可作用于一系列增殖和多能性的基因表達，進而促進哺乳動物生殖干細胞的自我更新。
權利要求
1.一種奶山羊PLZF基因，其特征在于，其基因序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.一種奶山羊PLZF基因，其特征在于，該基因的⑶S序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.一種奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，在奶山羊PLZF基因的下游連接熒光報告基因。
4.如權利要求3所述的奶山羊PLZF基因的融合基因，其特征在于，還在熒光標記基因的下游連接抗生素篩選基因。
5.一種基于奶山羊PLZF基因序列構建的表達載體，其特征在于，包含SEQ. ID. NO. 2所示的PLZF基因⑶S序列，在PLZF基因序列的下游連接熒光標記基因GFP，在GFP的下游連接抗生素篩選基因kanVnec/。
6.如權利要求5所述的基于奶山羊PLZF基因序列構建的表達載體，其特征在于，所述的基于PLZF基因序列構建的表達載體為pPLZF-IRES2-EGFP表達載體，通過Ecor I和BamHI酶切位點將PLZF基因克隆到pIRES2-EGFP表達載體。
7.奶山羊PLZF基因序列轉染到奶山羊雄性生殖干細胞中以促進其自我更新的應用。
8.一種促進奶山羊雄性生殖干細胞自我更新的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)克隆如SEQ.ID. NO. I所示的奶山羊PLZF基因序列，并將PLZF基因序列通過Ecor I和BamH I酶切位點克隆到pIRES2_EGFP表達載體中，得到pPLZF_IRES2_EGFP表達載體； 2)將待轉染的奶山羊雄性生殖干細胞與pPLZF-IRES2-EGFP表達載體共同孵育，將PPLZF-IRES2-EGFP表達載體轉染到雄性生殖干細胞之中； 轉染后3 4h，將奶山羊雄性生殖干細胞在基本培養基上添加其體積10%的胎牛血清和1%的非必需氨基酸，以及O. lmmol/L的β -巰基乙醇和2mmol/L的L-谷氨酰胺進行培養；所述的基本培養液為DMEM/F12培養液或H-DMEM培養液； 并在熒光顯微鏡下對熒光標記基因進行觀察，篩選啟動自我更新相關基因表達水平增高的細胞。
9.如權利要求8所述的促進奶山羊雄性生殖干細胞自我更新的方法，其特征在于，還以人的293T細胞的轉染作為對照，該細胞所采用的基本培養液為H-DMEM培養液。
10.如權利要求8所述的促進奶山羊雄性生殖干細胞自我更新的方法，其特征在于，所述的啟動自我更新相關基因為PCNA、C-MYC, 0CT4、PLZF, CDK2和CYCINA1。
全文摘要
本發明公開了一種奶山羊PLZF基因及其促雄性生殖干細胞自我更新的應用，該基因的CDS序列如SEQ.ID.NO.1所示。基于奶山羊PLZF基因序列構建的表達載體，包含SEQ.ID.NO.1所示的PLZF基因CDS序列，在PLZF基因序列的下游連接熒光標記基因GFP，在GFP的下游連接抗生素篩選基因kanr/neor。奶山羊PLZF基因序列轉染到雄性生殖干細胞中以促進雄性生殖干細胞自我更新的應用。
文檔編號C12N15/63GK102888407SQ20121037673
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月8日 優先權日2012年10月8日
發明者宋文聰, 華進聯 申請人:西北農林科技大學