專利名稱：HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒和方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病基因檢測技術，具體涉及HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒和方法。
背景技術：
高分辨熔解曲線(High Resolution Melting, HRM)技術是近年來興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態性、-SNP,甲基化、HLA配型等的分析。該方法與其他遺傳分型技術相比，不受突變堿基位點與類型的局限，操作簡便，具有靈敏度高、特異性好、成本低廉、快速、高通量檢測的優點，結果準確， 并且實現了真正的閉管操作。HRM原理是在PCR基礎上通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況導致DNA雙鏈熔解曲線變化來檢測突變的方法，溶解曲線的變化取決于DNA序列、長度、GC含量，因此，可以通過飽和燃料監控熔解曲線的變化來反映核酸性質的差異，從而對樣品進行分析。LC Green是一種與DNA有很強的結合位點，對PCR抑制作用很小的飽和染料，已成功用于HRM檢測中。HRM廣泛應用于分子診斷的各個領域檢測人類疾病相關基因中常染色體的顯隱性和X-連鎖、鑒定人類腫瘤的體細胞突變、腫瘤樣品中篩選體細胞突變、基因突變掃描單堿基的改變、插入或缺失、特定突變、多態性位點的篩選、外顯子和短擴增子基因型掃描。檢測的樣品范圍廣HRM檢測片段范圍在38-1000bp不同來源的樣品都可以用于HRM如血粉、口腔細胞、冷凍的腫瘤樣品、也可用于酒精固定、福爾馬林固定或石蠟包埋的組織等，在人類遺傳性疾病的研究中，通常用周邊血液淋巴細胞中提取DNA，用于HRM分析。地中海貧血分為α、β、δ、δβ、γδβ等幾種類型，常見的為α地中海貧血(簡稱α地貧)和β地中海貧血(簡稱β地貧)，是我國南方各省最常見、危害最大的遺傳病之一，也是世界上最常見的遺傳性疾病之一。據WHO統計全世界約有I. 5億多人攜帶地貧基因。在我國的廣東、廣西、海南、香港、湖南、湖北、云南、貴州、四川等地區常見，黃河以南至長江流域，臺灣、福建及西藏等省(區)均有病例報道；患者以漢族多見，亦可見于回、傣、壯、苗和布衣等少數民族，海南黎族地貧基因突變的發生率達58. 4%。抽樣調查發現，廣西“地貧”基因攜帶者高達20%，居全國之首，廣東為12%，居第二位，四川、重慶等省市也是高發區，有報導發病率在4 7%。α地貧是一種由于α-珠蛋白(a-Globin)基因突變導致α-珠蛋白合成減少，α-鏈/非 α-鏈比例失衡而產生的單基因遺傳性溶血性血紅蛋白病。分缺失型和突變型(非缺失型突變)兩類，突變型α -地貧是指用限制性內切酶圖譜法未能檢測出明顯的基因缺失，但在其中可能包括導致基因功能喪失的小片段核苷酸的缺失，插入或堿基替代。非缺失型α-地貧的突變大多位于功能較強的α2珠蛋白基因，故非缺失型血紅蛋白H病患者的臨床表現要比缺失型血紅蛋白H病患者的臨床表現更為嚴重。目前世界上已報道了至少46種引起非缺失型α -地貧的點突變，這些突變影響mRNA加工，mRNA的翻譯及翻譯后肽鏈不穩定或肽鏈縮短，導致α-珠蛋白鏈合成減少從而引起α地中海貧血。中國人群中目前已報道了 a aGD3°、α a CD3\ α α GD59、α α cs, α α QS、α α 種α地貧突變類型。我國最常見最早鑒定的是α a es、α a QS。α α QS是α 2基因第125密碼子CTG(亮氨酸)突變為CCG (脯氨酸)，是一種高度不穩定的α-珠蛋白，阻礙α I β I 二聚體的形成，從而影響四聚體的合成；而α 0 是α 2基因終止密碼突變，使α鏈延長為172個氨基酸。這種突變基因轉錄的mRNA不穩定，導致α鏈障礙。目前用于檢測突變型α-地貧均為科研試劑，可檢測a aes、α a QS、α α ■三種突變型別，而在中國人群中也有報道的a aCD3°, a a 31、a a eD59三種型別沒有納入檢測范圍。目前普遍應用的基因突變檢測方法為限制小片段長度多態性分析法(RFLP法)和DNA直接測序法。RFLP法是將PCR與限制性內切酶相結合的方法，但是該方法存在以下缺點試驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，且存在第一輪酶切不完全導致的假陽性。DNA直接測序法能對目的片段進行序列測定，是檢測點突變的金標準。但該方法也存在較多缺點儀器及試劑價格昂貴，對一些長片段或外顯子較多的基因不宜用測序法直接檢測突變；另外，不適用于臨床大量樣本的檢測，對雜合突變、缺失樣本、混合樣本的檢測，無法得到較好的測序圖，必須通過克隆測序，多次試驗才能獲得精確數據；對存在GC富集的樣本、困難模板也很難通過一次測序獲得準確數據。申請號為201010152735. 8的中國專利公開了 “一種一體化檢測a、β突變型地中海貧血的試劑盒”，該試劑盒能檢測中國有報導的27種β_地貧突變型別和6種α-地貧突變型別；申請號為02117287.0的中國專利公開了“用于診斷地中海貧血的DNA芯片及其制備方法”可檢測在中國發現的21種類型的β_地貧突變以及缺失型的α-地貧。國家知識產權局中檢索到的地中海貧血檢測相關的專利數目不在少數，其診斷突變型的地中海貧血檢測技術平臺均為基因芯片法或者PCR-反向點雜交法。這些專利難以實現商品化，是因為它們都存在共同的不足其探針設計需要通過大量的探針篩選才能得到比較滿意的結果；對目的基因進行擴增時，一般分為2-3段，其片段長度為300bp-600bp左右，在雜交過程中，片段長度越長，雜交效率就越低，尤其是以玻片為載體的基因芯片，經驗上的數值是不超過400bp,而為了彌補雜交效率不足,相應的措施是延長雜交時間甚至需要過夜雜交,但這一措施并不適合于快速檢測的初衷；以膜或者芯片為載體的基因芯片檢測方法，其檢測過程繁雜，且均設計對PCR產物的操作，開管操作極易產生污染。為了提高檢測效率及準確性，開發一種集成化檢測方法在短時間內完成多種突變型α-地貧型別的快速檢測是很有必要的。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種利用HRM法檢測突變型α-地中海貧血核苷酸多態性的試劑盒及其方法，該試劑盒可以同時檢測6種突變型a -地貧，檢測過程更加快速，檢測結果也更為準確。本發明技術方案為提供一種HRM法檢測突變型a -地中海貧血基因的試劑盒，所述試劑盒包括兩個PCR反應管a -PCR管I和a -PCR管2，所述PCR反應管包括PCR反應試劑，所述PCR反應試劑包括引物、PCR Buffer, dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、飽和熒光染料；所述a -PCR管I包括擴增α a CD30、α α CD31、α α CD59三個位點的一對引物上游引物aFl為序列SEQ ID NO: 1，下游引物a Rl為序列SEQ ID NO:4 ；或上游引物aFl為SEQ ID N0:2，下游引物a Rl為序列SEQ ID NO:5 ；或上游引物aFl為序列SEQ ID NO: 3， 下游引物a Rl為序列SEQ ID N0:6 ；所述a -PCR管2包括擴增a a GS、a a QS、a α麗三個位點的一對引物上游引物a F2為序列SEQ ID NO: 7，下游引物a R2為序列SEQ ID NO: 10 ；或上游引物aF2為序列SEQ ID NO: 8，下游引物a R2為序列SEQ ID NO: 11 ；或上游引物a F2為序列SEQ ID NO: 9，下游引物a R2為序列SEQ ID NO: 12。優選的上述HRM法檢測突變型a -地中海貧血基因的試劑盒，所述DNA聚合酶為Taq酶或熱啟動酶，所述a -PCR管I包括擴增α a GD3°、α α CD3\ α α CD59三個位點的一對引物上游引物a Fl為序列SEQ ID NO: 2，下游引物a Rl為SEQ ID NO: 5 ；所述a -PCR管2包括擴增α a GS、α a QS、α α麗三個位點的一對引物上游引物aF2為序列SEQ ID NO: 7，下游引物a R2為序列SEQ ID NO: 12。優選的上述HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述飽和熒光染料為EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。優選的上述HRM法檢測突變型α -地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述的 PCR 反應試劑各組分終濃度為1-5 XPCR buffer, O. I-ImM dNTPs, O. 1-1 μ M 引物，l_5mMMgCl2, DNA聚合酶，1-3 X飽和熒光染料。優選的所述dNTPs為dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩爾的混合液；所述PCRBuffer的pH值為8. 0-9. 0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl，氯化鉀、硫酸銨、氯化鎂。本發明提供的又一技術方案為提供一種HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的方法，包括如下步驟(I)采用上述的試劑盒對樣品的模板DNA的目的基因進行PCR擴增；(2)對PCR產物的目的基因的突變位點進行HRM分析。優選的上述HRM法檢測突變型α -地中海貧血基因的方法，其特征在于，所述步驟
(1)進行PCR擴增反應的條件為92-98°C預變性3_15min;92_98°C變性10-30s、50_68°C退火 10-45s、70-75°C延伸 10_45s，35-50 個循環。優選的上述HRM法檢測突變型α -地中海貧血基因的方法，其特征在于，所述步驟
(2)PCR產物進行HRM分析的熔解程序為92-98°C變性l_2min，40_45°C復性l_2min，然后初始熔解溫度為58-65°C開始程序升溫熔解至92-97°C，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，25-45次每秒；然后40°C冷卻10s。優選的上述HRM法檢測突變型α -地中海貧血基因的方法，其特征在于，所述步驟
(I)具體為加入熱啟動酶的PCR反應試劑進行PCR擴增反應的條件為94°C預變性5min ；94°C變性20s、55°C退火30s、72°C延伸30s, 40個循環；所述步驟(2) PCR產物進行HRM分析的熔解程序為95°C變性lmin，40°C復性lmin，然后初始熔解溫度為65°C開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，40次每秒；然后40°C冷卻10s。
本發明的相對于現有技術中的方案本發明的優點是利用優化的PCR-HRM反應條件，可以同時檢測6種突變型α-地中海貧血包括a-cod30，a-Cod31, a -Cod59,a -WM-codl22, a-QS_codl25，a-CS_codl42中的一個或一個以上的組合。采用新型突變研究技術HRM法，無需序列特異性探針，無需測序，也不受突變堿基位點與類型的局限，應用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，參照陰性、陽性對照，即可完成對樣本多種基因型的片段，可用于地中海貧血的診斷或產前篩查。本發明是應用HRM技術進行基因檢測的方法應用，所述的檢測方法包含了 a-Globin基因發生單堿基突變區域的引物對，所述的兩組引物對可以在相同的條件下進行反應。從而簡便快速的完成對α-地貧的檢測，克服了現有技術需要對PCR產物進行雜交或測序操作的繁雜性，實現閉管檢測，通量高，耗時短，為a -地貧的臨床治療或遺傳分析提供指導依據。
圖la，圖Ib :為本發明實施例進行引物篩選驗證得到的電泳圖采用三例全血樣本提取的不同的DNA模板，使用所設計的弓I物分別進行檢測，篩選最合適的引物。圖2:為a-PCR管I擴增產物電泳圖，圖中1-7泳道包含兩種不同的酶配制的a -PCR管I。1-3泳道為3例不同的EDTA抗凝全血，使用熱啟動酶配制的a -PCR管進行擴增的產物，4-6泳道為3例不同的EDTA抗凝全血，使用Taq酶配制的a -PCR管進行擴增的產物，標本同1_3泳道,7泳道為6泳道標本的重復檢測。DNA marker為IOObp Ladder (TaKaRa公司生產)。由圖2可知，a-PCR管I進行擴增的反應中，使用熱啟動酶或Taq酶均可成功擴增出目的條帶。圖3 :為a -PCR管2擴增產物電泳圖。圖中1_12泳道包含兩種不同的酶配制的a -PCR管。1-6泳道為6例不同的EDTA抗凝全血，使用熱啟動酶配制的a -PCR管進行擴增的產物，7-12泳道為6例不同的EDTA抗凝全血，使用Taq酶配制的a -PCR管進行擴增的產物，標本同1-6泳道，DNA marker為IOObpLadder (TaKaRa公司生產)。由圖3可知，a -PCR管2進行擴增的反應中，使用熱啟動酶或Taq酶均可成功擴增出目的條帶。圖4a為本發明實施例使用a -PCR管I對不同標本(分別為外周血血漿、外周血全血、羊水細胞、體液、腔道脫落物樣本)DNA模板進行PCR擴增時得到的產物電泳圖，圖4b為本發明實施例使用a -PCR管2對不同標本(分別為外周血血漿、外周血全血、羊水細胞、體液、腔道脫落物樣本)DNA模板進行PCR擴增時得到的產物電泳圖。由圖4a、4b可知，外周血血漿、外周血全血、羊水細胞、體液、腔道脫落物樣本均可成為a -PCR管I和a -PCR管2的擴增反應的樣本來源。圖5 :為本發明實施例使用a -PCR管2對不同標本DNA模板進行PCR擴增后檢測的熔解曲線圖。圖6 :為本發明實施例使用不同的飽和熒光染料進行HRM的熔解曲線圖，所用樣本為正常樣本，圖6Α、6Β分別為兩段PCR產物的HRM圖。圖7 :為CS雜合子、CS純合子、正常樣本的擴增產物進行HRM的熔解曲線圖。圖8 :為QS雜合子、QS純合子、正常樣本的擴增產物進行HRM的熔解曲線圖。圖9 :為麗雜合子、麗純合子、正常樣本的擴增產物進行HRM的熔解曲線圖。圖10 :為a -cod30雜合子、a -Cod30純合子、正常樣本的擴增產物進行HRM的熔解曲線圖。圖11 :為a cod31雜合子、a cod31純合子、正常樣本的擴增產物進行HRM的熔解曲線圖。圖12 :為a -Cod59雜合子、a cod59純合子、正常樣本的擴增產物進行HRM的熔解曲線圖。
具體實施例方式為詳細說明本發明的技術內容、構造特征、所實現目的及效果，以下結合實施方式并配合附圖詳予說明。本發明提供一種檢測突變型α -地中海貧血的快速檢測試劑盒，該方法高通量，快速便捷，閉管操作，利用本試劑盒可以同時檢測6種突變型α -地貧。本發明提供一種基于HRM法基因分型技術的基因檢測方法，包含以下步驟I、根據a -Globin基因序列，針對待檢的兩個靶向區域設計篩選合適的PCR引物對，設計的引物能夠特異性擴增包括α-地中海貧血全部突變位點的區域。設計的引物可由專業的合成公司合成，如上海生工等。2、對全血、羊水、血斑等樣本進行處理。提取基因組DNA，利用步驟I)篩選的引物，采用合適的PCR反應體系，對進行目的片段擴增。3、根據高分辨熔解曲線發對擴增后的目的基因的6種突變型別同時檢測。4、在包含所述引物的PCR試劑中，使用兩管PCR進行擴增，PCR反應試劑涉及的·組分可以使用市售的產品，如ΝΕΒ公司生產的Taq 5XMaster Mix,Fermentas公司生產的熱啟動酶等。所述目的基因選自a-Globin基因中突變α-地中海貧血發生的區域α2基因，所述的引物對包含α aeD3°、a aeD31、a a CD5\ a a es、a a QS、a a 6種突變類型。PCR試劑包括a -PCR管I和a -PCR管2，其中a -PCR管I由一對擴增含a a CD3°、a aCD3\ a a GD59三個位點的引物、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、飽和熒光染料及模板DNA組成。a-PCR管2由一對擴增含a a cs、a a QS、a a麗)三個位點的引物、PCRBuffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、飽和熒光染料及模板DNA組成，兩對a -PCR引物分別為a Fl和a Rl, a F2和a R2，從以下如表I所示序列都能能夠特異性擴增包括a -地中海貧血全部
突變位點的區域。
權利要求
1.一種HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括兩個PCR反應管a -PCR管I和a -PCR管2，所述PCR反應管包括PCR反應試劑，所述PCR反應試劑包括引物、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、飽和熒光染料； 所述a -PCR管I包括擴增α α _、α a CD3\ α α CD59三個位點的一對引物 上游引物aFl為序列SEQ ID NO: 1，下游引物a Rl為序列SEQ ID NO: 4 ； 或上游引物aFl為SEQ ID NO: 2，下游引物a Rl為序列SEQ ID NO: 5 ； 或上游引物aFl為序列SEQ ID N0:3，下游引物a Rl為序列SEQ ID NO:6 ； 所述a-PCR管2包括擴增a aGS、a a QS、a a 三個位點的一對引物 上游引物a F2為序列SEQ ID N0:7，下游引物a R2為序列SEQ ID NO: 10; 或上游引物aF2為序列SEQ ID NO:8，下游引物a R2為序列SEQ ID NOill ； 或上游引物a F2為序列SEQ ID N0:9，下游引物a R2為序列SEQ ID NO: 12。
2.根據權利要求I所述的HRM法檢測突變型a-地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為Taq酶或熱啟動酶， 所述a-PCR管I包括擴增α a GD3°、α α CD3\ α α GD59三個位點的一對引物上游引物aFl 為序列 SEQ ID NO: 2，下游引物 a Rl 為 SEQ ID NO: 5 ； 所述a-PCR管2包括擴增a aGS、a a QS、a a 三個位點的一對引物上游引物a F2為序列SEQ ID N0:7，下游引物a R2為序列SEQ ID N0:12。
3.根據權利要求I所述的HRM法檢測突變型a-地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述飽和熒光染料為EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。
4.根據權利要求2所述的HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應試劑各組分終濃度為1-5XPCR buffer, O. I-ImMdNTPs7O. 1-1 μ M引物，l-5mM MgCl2, DNA聚合酶，1-3 X飽和熒光染料。
5.根據權利要求4所述的HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒，其特征在于，所述dNTPs為dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩爾的混合液；所述PCRBuffer的pH值為8.0-9. 0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl，氯化鉀、硫酸銨、氯化鎂。
6.一種HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)采用權利要求I所述的試劑盒對樣品的模板DNA的目的基因進行PCR擴增； (2)對PCR產物的目的基因的突變位點進行HRM分析。
7.根據權利要求書6所述的HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的方法，其特征在于，所述步驟(I)進行PCR擴增反應的條件為 92-98°C預變性 3-15min ； 92-98°C變性 10-30s、50-68°C退火 10-45s、70_75°C延伸 10_45s，35-50 個循環。
8.根據權利要求書6所述的HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的方法，其特征在于，所述步驟(2) PCR產物進行HRM分析的熔解程序為92-98°C變性l_2min，40-45°C復性l-2min，然后初始熔解溫度為58-65°C開始程序升溫熔解至92-97°C，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，25-45次每秒；然后40°C冷卻10s。
9.根據權利要求6所述的HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的方法，其特征在于，所述步驟(I)具體為加入熱啟動酶的PCR反應試劑進行PCR擴增反應的條件為94°C預變性5min ；94°C變性20s、55°C退火30s、72°C延伸30s, 40個循環；所述步驟(2) PCR產物進行HRM分析的熔解程序為95°C變性 lmin，40°C復性 Imin，然后初始熔解溫度為65°C開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實時檢測熒光信號，40次每秒；然后40°C冷卻10s。
全文摘要
本發明涉及一種疾病基因檢測技術，具體涉及HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒及其方法。本發明提供一種HRM法檢測突變型α-地中海貧血基因的試劑盒，所述試劑盒包括兩個PCR反應管α-PCR管1和α-PCR管2，所述PCR反應管包括PCR反應試劑，所述PCR反應試劑包括引物、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、飽和熒光染料。本發明利用優化的PCR-HRM反應條件，可以同時檢測6種突變型α-地中海貧血包括α-cod30，α-cod31，α-cod59，α-WM-cod122，α-QS-cod125，α-CS-cod142中的一個或一個以上的組合。
文檔編號C12Q1/68GK102925560SQ20121038230
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者彭春梅, 陳金元, 陳鋒, 胡守旺, 謝佐福, 周曉強, 姚銘鋒 申請人:泰普生物科學(中國)有限公司