用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片及其制備方法

用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片及其制備方法。本發明是將潔凈的基片置于燃燒的火焰上，在基片的表面沉積得到由納米煙灰顆粒組成的煙灰層，并以此納米煙灰顆粒作為模板，采用化學氣相沉積法，在納米煙灰顆粒的外表面沉積一層二氧化硅外殼層；通過高溫煅燒處理，將二氧化硅外殼層內部的納米煙灰顆粒除去，得到具有微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層；最后，將特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的二氧化硅層的表面，得到用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片。本發明的生物芯片具有對循環腫瘤細胞高效和高靈敏度富集，而且在水環境下具有高透明性，可用于實時檢測捕獲的循環腫瘤細胞。
【專利說明】用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學材料、功能材料【技術領域】，特別涉及用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片及其制備方法。
【背景技術】
[0002]早在1896年，澳大利亞病理學家托馬斯.阿什沃思(Thomas Ashworth)就曾報道
I例轉移性癌癥患者血液中觀察到了循環腫瘤細胞(circulating tumorcells,CTCs)-
從實體瘤中脫離出來并進入血液循環的腫瘤細胞。現在，一般認為，循環腫瘤細胞的檢測可有效地應用于體外早期診斷，化療藥物的快速評估，個體化治療包括臨床篩藥、耐藥性的檢測，腫瘤復發的監測以及腫瘤新藥物的開發等。如今，隨著人們對腫瘤轉移機制研究的深入，尤其是伴隨現代檢測技術的廣泛應用，CTC逐漸被人們所重視，也研究并開發了許多用于循環腫瘤細胞富集、檢測和分子生物學表征的技術。比如免疫磁珠分離法、基于尺寸的膜過濾法、基于表面抗體修飾的微流體器件等。然而，要想實現對循環腫瘤細胞富集、檢測和分子生物學表征于一體的生物平臺還是一個非常具有挑戰性的技術難題。原因主要在于:血液中CTC極其微量，往往大約每十億個正常血細胞中才會發現一個CTC，要想有效富集這些細胞極其困難，需要靈敏的檢測設備；另外，富集得到的CTC必須具有活性，這樣才能有利于后續分子生物學表征。所以如何尋找一種簡便高效的方法實現對循環腫瘤細胞的富集、檢測和分子生物學表征的技術成為了一個人們關注的課題。
[0003]CN201120255677.1、CN201110433615.X、CN200820169047.0、CN200890100321.7、CN201210023487.6、CN201210023487.6 和 CN200810162901.5 中分別公開了循環腫瘤細胞富集的方法。雖然上述技術方案都具有一定的富集循環腫瘤細胞的功能，但也存在著不同的不足，如制造過程較為復雜`，有的富集效率不高，有的富集和檢測時間較長等。
[0004]同樣，文獻 Angewandte Chemie 2009, 121, 9132, J Am Chem Soc 2008, 130, 8633,Nano Letters 2012, 12，163也報道了可以用來循環腫瘤細胞富集的生物芯片或生物平臺，但也存在上述類似的問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片。
[0006]本發明的再一目的在于提供一種制備成本低廉、簡單便捷的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的制備方法。
[0007]本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，是將潔凈的基片置于燃燒的火焰上，在基片的表面沉積得到由納米煙灰顆粒組成的煙灰層(優選煙灰層的厚度為微米厚度)，并以此納米煙灰顆粒作為模板，采用化學氣相沉積法，在所述的納米煙灰顆粒的外表面沉積一層二氧化硅外殼層(優選二氧化硅外殼層的厚度為納米厚度)，然后通過高溫煅燒處理，將所述的二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒除去，得到具有微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層；最后，通過化學反應的方法，將特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的二氧化硅層的表面，得到生物芯片，即本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片。
[0008]本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，是在基片的表面包覆有微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層，在所述的二氧化硅層的表面修飾有特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體。
[0009]所述的二氧化硅層的表面修飾有特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2。
[0010]所述的微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層的厚度優選為I~50微米。 [0011]所述的納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為20~900納米。
[0012]本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片具有微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層，通過納米結構與循環腫瘤細胞的三維拓撲結構產生增強粘附效應，以及特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體與循環腫瘤細胞表面特定蛋白的特異性結合的協同作用，從而實現了對循環腫瘤細胞的高效和高敏度富集；同時，透射光譜測試的結果表明，本發明的生物芯片在水環境下具有高透明性，可見光波透過率為30~99%，可以利用光學檢測平臺(比如激光共聚焦、熒光顯微鏡)實時檢測捕獲的循環腫瘤細胞，提供諸如細胞形態等有效信息，有利于對循環腫瘤細胞的正確檢測。
[0013]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片對特異性的循環腫瘤細胞(如乳腺癌細胞MCF7)的富集效率高達30~99%，且非特異性的細胞系(如jurkat T淋巴細胞和Daudi淋巴細胞等)卻極少粘附在生物芯片上，從而可以實現在生物樣品中的循環腫瘤細胞的高效富集。比如將血液樣品加入到放置有本發明的生物芯片的6孔板中，可以實現對血液樣品中循環腫瘤細胞的高效和高靈敏富集，而正常血細胞卻極少粘附在生物芯片上。本發明的生物芯片具有高透明性的特點，在紫外-可見光區域的透過率高達30~99%，因此可以通過熒光顯微鏡和激光共聚焦等光學檢測平臺實現對捕獲的循環腫瘤細胞進行實時檢測，提供諸如細胞形態等有效信息，有利于對循環腫瘤細胞的正確檢測。
[0014]本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的制備方法包括以下步驟:
[0015](I)將基片清洗干凈(可分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用Piranha溶液(濃H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分鐘)，氮氣吹干，然后將基片置于燃燒的火焰上，在基片的表面沉積一層由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；
[0016](2)將步驟⑴得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的基片置于含硅化合物所揮發的氣體環境中，通過化學氣相沉積，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面沉積一層二氧化娃外殼層；
[0017](3)將步驟(2)得到的基片進行高溫煅燒處理，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在基片的表面沉積得到微米厚度的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化
娃層;
[0018](4)將步驟(3)得到的基片用氧等離子體處理(優選功率是200mW，處理時間為5分鐘左右)，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于1-10%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中進行反應(優選室溫下反應30分鐘左右);取出基片并清洗(可用乙醇潤洗表面后，再用二甲基亞砜潤洗);
[0019](5)將步驟(4)得到的基片置于濃度為0.1-0.5mM的4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置(優選室溫下放置45分鐘左右)，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到納米二氧化硅顆粒的表面上；將基片取出并清洗(可用磷酸鹽緩沖液充分潤洗);
[0020](6)將步驟(5)得到的基片置于l-ΙΟμ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置進行反應(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，將基片取出并清洗(可用磷酸鹽緩沖液洗滌);
[0021](7)將濃度為1-10 μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到 的基片上(如取25 μ L滴加到的1X1平方厘米的基片表面上)，室溫放置(優選室溫下放置30分鐘左右)，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，得到所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片。
[0022]所述的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的厚度優選為微米厚度，較佳的微米厚度為0.1~500微米。
[0023]所述的微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層的厚度為I~50微米。
[0024]所述的納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為20~900納米。
[0025]所述的基片選自玻璃片、石英片和云母片等透明片材中的一種。
[0026]所述的火焰是由動物油脂、植物油脂、蠟燭、酒精或煤油等碳氫化合物燃燒所產生的火焰。
[0027]所述的含硅化合物選自四氫化硅、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷和四氯化硅所組成的組中的至少一種。
[0028]所述的化學氣相沉積的時間優選為10分鐘~72小時。
[0029]所述的高溫煅燒處理的溫度優選為400~1300°C。
[0030]所述的高溫煅燒處理的時間優選為I~8小時。
[0031]本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片具有制備成本低廉，原料易得，設備和制作工藝簡單，易工業化生產等優點，可一次性用于臨床診斷。本發明的生物芯片的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度高，分離純度高，富集后的循環腫瘤細胞活性高，特別適用于對前列腺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、惡性黑色素瘤、軟組織腺泡狀肉瘤等引起轉移的血液中的循環腫瘤細胞均有很好的富集效果，還可實時檢測捕獲的循環腫瘤細胞，提供諸如細胞形態等有效信息，有利于對循環腫瘤細胞的正確檢測。本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的制備過程無有毒有害物質，環境友好，穩定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1a.本發明實施例1制備的厚度為5.4微米的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層的正面掃描電鏡照片。
[0033]圖1b.本發明實施例1制備的厚度為5.4微米的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層的側面掃描電鏡照片
[0034]圖2.本發明實施例1制備的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片置于水中的照片，展示其在水中具有優異的透明性。
[0035]圖3.本發明實施例1制備的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7捕獲定量數據。
[0036]圖4a.采用本發明實施例1制備的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7的明場照片。
[0037]圖4b.采用本發明實施例1制備的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7的熒光顯微照片。
【具體實施方式】
[0038]實施例1.[0039](1)將I X I平方厘米的石英片分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用Piranha溶液(濃H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分鐘，再在去離子水中超聲清洗10分鐘，直至石英片潔凈，最后用氮氣充分吹干；點燃蠟燭，待火焰穩定后(5分鐘左右)，用鑷子夾取石英片置于蠟燭燃燒的火焰上，在石英片的表面沉積一層厚度為20微米的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；
[0040](2)將步驟(1)得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的石英片置于培養皿(D=40mm,H=llmm)中，加入0.1mL四氯化娃液體,密封后置于通風櫥中，I小時后將石英片取出，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面化學氣相沉積一層厚度為20納米的二氧化硅外殼層；
[0041](3)將步驟⑵得到的石英片放置于管式爐中于800°C下煅燒2小時，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在石英片的表面沉積得到厚度為5.4微米的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層，其中，納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為269納米；如圖1a及圖1b所示；
[0042](4)將步驟(3)得到的石英片用功率是200mW的氧等離子體處理5分鐘左右，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于1%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中，室溫下反應30分鐘左右；取出石英片并用乙醇潤洗表面三次，再用二甲基亞砜潤洗一次；
[0043](5)將步驟(4)得到的石英片置于濃度為0.1mM的4_馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置45分鐘左右，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到納米二氧化硅顆粒的表面上；將石英片取出并用磷酸鹽緩沖液充分潤洗；
[0044](6)將步驟(5)得到的石英片置于1 μ g/mL鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置反應30分鐘左右，將石英片取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0045](7)取25 μ L濃度為I μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的石英片上，室溫下放置30分鐘左右，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2，得到如圖2所示在水中具有優異的透明性的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片；另外透射光譜測試的結果表明，沉積二氧化硅層的石英片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
[0046](8)將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的乳腺癌細胞MCF7懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去乳腺癌細胞MCF7懸浮液，將生物芯片在硫酸緩沖液中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7用質量濃度4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液溶液固定20分鐘后，再用0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸鹽緩沖液染色15分鐘后，在PBS中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的乳腺癌細胞MCF7進行計數，計算捕獲效率。乳腺癌細胞MCF7捕獲定量數據如圖3所示；捕獲的乳腺癌細胞MCF7的明場照片如圖4a所示，熒光顯微照片如圖4b所示。
[0047]作為對照組1，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘，在磷酸緩沖液中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi進行計數，計算捕獲效率。人淋巴B細胞瘤Daudi粘附的定量數據如圖3所示。
[0048]作為對照組2，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴瘤Jurkat T細胞用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘后在磷酸緩沖液中涮洗1-2次，再用含0.2%體積濃度的Triton `X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘后在PBS中涮洗1_2次，最后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴瘤JurkatT細胞進行計數，計算捕獲效率。人淋巴瘤Jurkat T細胞粘附的定量數據如圖3所示。
[0049]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7的捕獲效率為73.2%。對照實驗中的人淋巴B細胞瘤Daudi的捕獲效率僅為8.4% ;人淋巴瘤Jurkat T細胞的捕獲效率僅為5.0%。這些數據表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，具有聞的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度，富集后的循環腫瘤細胞活性高。
[0050]實施例2.[0051](I)將I X I平方厘米的石英片分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用Piranha溶液(濃H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分鐘，再在去離子水中超聲清洗10分鐘，直至石英片潔凈，最后用氮氣充分吹干；點燃蠟燭，待火焰穩定后(5分鐘左右)，用鑷子夾取石英片置于蠟燭燃燒的火焰上，在石英片的表面沉積一層厚度為500微米的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；[0052](2)將步驟⑴得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的石英片置于培養皿(D=40mm, H=Ilmm)中，加入0.1mL四氯化娃液體,密封后置于通風櫥中，72小時后將石英片取出，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面化學氣相沉積一層厚度為200納米的二氧化硅外殼層；
[0053](3)將步驟(2)得到的石英片放置于管式爐中于800°C下煅燒2小時，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在石英片的表面沉積得到厚度為50微米的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層，其中，納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為900納米；
[0054](4)將步驟(3)得到的石英片用功率是200mW的氧等離子體處理5分鐘左右，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于1%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中，室溫下反應30分鐘左右；取出石英片并用乙醇潤洗表面三次，再用二甲基亞砜潤洗一次；
[0055](5)將步驟(4)得到的石英片置于濃度為0.1mM的4_馬來酰亞胺基丁酸_N_琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置45分鐘左右，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到納米二氧化硅顆粒的表面上；將石英片取出并用磷酸鹽緩沖液充分潤洗；
[0056](6)將步驟(5)得到的石英片置于I μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置反應30分鐘左右，將石英片取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0057](7)取25 μ L濃度為I μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的石英片上，室溫下放置30分鐘左右，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有優異的透明性的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片；透射光譜測試的結果表明，沉積二氧化硅層的石英片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
[0058](8)將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的乳腺癌細胞MCF7懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去乳腺癌細胞MCF7懸浮液，將生物芯片在硫酸緩沖液中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7用質量濃度4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液溶液固定20分鐘后，再用0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸鹽緩沖液染色15分鐘后，在PBS中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的乳腺癌細胞MCF7進行計數，計算捕獲效率。
[0059] 作為對照組1，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘，在磷酸緩沖液中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi進行計數，計算捕獲效率。
[0060]作為對照組2，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴瘤Jurkat T細胞用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘后在磷酸緩沖液中涮洗1-2次，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘后在PBS中涮洗1_2次，最后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴瘤JurkatT細胞進行計數，計算捕獲效率。
[0061]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7的捕獲效率為74.2%。對照實驗中的人淋巴B細胞瘤Daudi的捕獲效率僅為5.4% ;人淋巴瘤Jurkat T細胞的捕獲效率僅為6.1%。這些數據表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，具有聞的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度，富集后的循環腫瘤細胞活性高。
[0062]實施例3.[0063](I)將將I X I平方厘米的石英片分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用Piranha溶液(濃H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分鐘，再在去離子水中超聲清洗10分鐘，直至云 母片潔凈，最后用氮氣充分吹干；點燃植物油脂的燃燒燈，待火焰穩定后(5分鐘左右)，用鑷子夾取云母片置于植物油脂燃燒的火焰上，在云母片的表面沉積一層厚度為I微米的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；
[0064](2)將步驟(1)得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的云母片置于培養皿(D=40mm, H=Ilmm)中，加入0.1mL四氯化娃液體,密封后置于通風櫥中，10分鐘后將云母片取出，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面化學氣相沉積一層厚度為10納米的二氧化硅外殼層；
[0065](3)將步驟(2)得到的云母片放置于管式爐中于1300°C下煅燒10分鐘，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在云母片的表面沉積得到厚度為I微米的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層，其中，納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為20納米；
[0066](4)將步驟(3)得到的云母片用功率是200mW的氧等離子體處理5分鐘左右，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于10%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中，室溫下反應30分鐘左右；取出云母片并用乙醇潤洗表面三次，再用二甲基亞砜潤洗一次；
[0067](5)將步驟(4)得到的云母片置于濃度為0.5mM的4_馬來酰亞胺基丁酸_N_琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置45分鐘左右，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到納米二氧化硅顆粒的表面上；將云母片取出并用磷酸鹽緩沖液充分潤洗；
[0068](6)將步驟(5)得到的云母片置于10μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置反應30分鐘左右，將云母片取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌；[0069](7)取25 μ L濃度為I μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的石英片上，室溫下放置30分鐘左右，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有優異的透明性的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片；透射光譜測試的結果表明，沉積二氧化硅層的石英片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
[0070](8)將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的乳腺癌細胞MCF7懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去乳腺癌細胞MCF7懸浮液，將生物芯片在硫酸緩沖液中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7用質量濃度4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液溶液固定20分鐘后，再用0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸鹽緩沖液染色15分鐘后，在PBS中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的乳腺癌細胞MCF7進行計數，計算捕獲效率。
[0071]作為對照組1，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘，在磷酸緩沖液中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi進行計數，計算捕獲效率。
[0072]作為對照組2，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應`的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴瘤Jurkat T細胞用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘后在磷酸緩沖液中涮洗1-2次，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘后在PBS中涮洗1_2次，最后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴瘤JurkatT細胞進行計數，計算捕獲效率。
[0073]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7的捕獲效率為70.2%。對照實驗中的人淋巴B細胞瘤Daudi的捕獲效率僅為8.9% ;人淋巴瘤Jurkat T細胞的捕獲效率僅為5.3%。這些數據表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，具有聞的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度，富集后的循環腫瘤細胞活性高。
[0074]實施例4.[0075](I)將I X I平方厘米的石英片分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用Piranha溶液(濃H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分鐘，再在去離子水中超聲清洗10分鐘，直至玻璃片潔凈，最后用氮氣充分吹干；點燃動物油脂的燃燒燈，待火焰穩定后(5分鐘左右)，用鑷子夾取玻璃片置于動物油脂燃燒的火焰上，在玻璃片的表面沉積一層厚度為40微米的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；
[0076](2)將步驟(1)得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的玻璃片置于培養皿(D=40mm，H=llmm)中，加入0.1mL SiCl4液體，密封后置于通風櫥中，I小時后將玻璃片取出，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面化學氣相沉積一層厚度為200納米的二氧化硅外殼層； [0077](3)將步驟⑵得到的玻璃片放置于管式爐中于400°C下煅燒2小時，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在玻璃片的表面沉積得到厚度為5微米的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層，其中，納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均平均粒徑為200納米；
[0078](4)將步驟(3)得到的玻璃片用功率是200mW的氧等離子體處理5分鐘左右，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于4%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中，室溫下反應30分鐘左右；取出玻璃片并用乙醇潤洗表面三次，再用二甲基亞砜潤洗一次；
[0079](5)將步驟(4)得到的玻璃片置于濃度為0.25mM的4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置45分鐘左右，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到納米二氧化硅顆粒的表面上；將玻璃片取出并用磷酸鹽緩沖液充分潤洗；
[0080](6)將步驟(5)得到的玻璃片置于10μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置反應30分鐘左右，將玻璃片取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0081](7)取25 μ L濃度為I μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的石英片上，室溫下放置30分鐘左右，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有優異的透明性的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片；透射光譜測試的結果表明，沉積二氧化硅層的石英片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
[0082](8)將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的乳腺癌細胞MCF7懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去乳腺癌細胞MCF7懸浮液，將生物芯片在硫酸緩沖液中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7用質量濃度4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液溶液固定20分鐘后，再用0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸鹽緩沖液染色15分鐘后，在PBS中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的乳腺癌細胞MCF7進行計數，計算捕獲效率。
[0083]作為對照組1，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘，在磷酸緩沖液中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi進行計數，計算捕獲效率。
[0084]作為對照組2，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴瘤Jurkat T細胞用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘后在磷酸緩沖液中涮洗1-2次，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘后在PBS中涮洗1_2次，最后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴瘤JurkatT細胞進行計數，計算捕獲效率。
[0085]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7的捕獲效率為67.4%。對照實驗中的人淋巴B細胞瘤Daudi的捕獲效率僅為10.2% ；人淋巴瘤Jurkat T細胞的捕獲效率僅為4.7%。這些數據表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，具有聞的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度，富集后的循環腫瘤細胞活性高。
[0086]實施例5.[0087](I)將I X I平方厘米的石英片分別在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用Piranha溶液(濃H2S04/30%H202，V/V=7:3)清洗30分鐘，再在去離子水中超聲清洗10分鐘，直至石英片潔凈，最后用氮氣充分吹干；點燃酒精燈，待火焰穩定后(5分鐘左右)，用鑷子夾取石英片置于酒精燈燃燒的火焰上，在石英片的表面沉積一層厚度為40微米的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；
[0088](2)將步驟(1)得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的石英片置于培養皿(D=40mm，H=llmm)中，加入0.1mL四乙氧基硅烷液體，密封后置于通風櫥中，I小時后將石英片取出，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面化學氣相沉積一層厚度為200納米的二氧化硅外殼層；
[0089](3)將步驟(2)得到的石英片放置于管式爐中于600°C下煅燒2小時，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在石英片的表面沉積得到厚度為5微米的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層，其中，納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為400納米；
[0090](4)將步驟(3)得到的石英片用功率是200mW的氧等離子體處理5分鐘左右，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于4%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中，室溫 下反應30分鐘左右；取出石英片并用乙醇潤洗表面三次，再用二甲基亞砜潤洗一次；[0091](5)將步驟(4)得到的石英片置于濃度為0.25mM的4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置45分鐘左右，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到二氧化硅納米顆粒的表面上；將石英片取出并用磷酸鹽緩沖液充分潤洗；
[0092](6)將步驟(5)得到的石英片置于5μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置反應30分鐘左右，將石英片取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0093](7)取25 μ L濃度為I μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的石英片上，室溫下放置30分鐘左右，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有優異的透明性的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片；透射光譜測試的結果表明，沉積二氧化硅層的石英片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
[0094](8)將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的乳腺癌細胞MCF7懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去乳腺癌細胞MCF7懸浮液，將生物芯片在硫酸緩沖液中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7用質量濃度4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液溶液固定20分鐘后，再用0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸鹽緩沖液染色15分鐘后，在PBS中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的乳腺癌細胞MCF7進行計數，計算捕獲效率。
[0095]作為對照組1，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行`反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘，在磷酸緩沖液中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi進行計數，計算捕獲效率。
[0096]作為對照組2，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴瘤Jurkat T細胞用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘后在磷酸緩沖液中涮洗1-2次，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘后在PBS中涮洗1_2次，最后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴瘤JurkatT細胞進行計數，計算捕獲效率。
[0097]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7的捕獲效率為68.3%。對照實驗中的人淋巴B細胞瘤Daudi的捕獲效率僅為4.5% ;人淋巴瘤Jurkat T細胞的捕獲效率僅為10.3%。這些數據表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，具有聞的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度，富集后的循環腫瘤細胞活性高。
[0098]實施例6.[0099](I)將面積為Icm2的云母片先后在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲清洗10分鐘，然后用piranha溶液(70%:30%(V/V)H2S04/H202)清洗30分鐘，再在去離子水中超聲清洗10分鐘，直至云母片潔凈，最后用氮氣充分吹干；點燃煤油燈，待火焰穩定后(5分鐘左右)，用鑷子夾取云母片置于煤油燃燒的火焰上，在云母片的表面沉積一層厚度為500微米的由納米煙灰顆粒組成的煙灰層；
[0100](2)將步驟(1)得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的云母片置于培養皿(D=40mm, H=Ilmm)中，加入0.1mL四甲氧基硅烷液體，密封后置于通風櫥中，24小時后將云母片取出，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面化學氣相沉積一層厚度為100納米的二氧化硅外殼層；
[0101](3)將步驟(2)得到的云母片放置于管式爐中于800°C下煅燒2小時，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在云母片的表面沉積得到厚度為50微米的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層，其中，納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的平均粒徑為400納米；
[0102](4)將步驟(3)得到的云母片用功率是200mW的氧等離子體處理5分鐘左右，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于4%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中，室溫下反應30分鐘左右；取出云母片并用乙醇潤洗表面三次，再用二甲基亞砜潤洗一次；
[0103](5)將步驟(4)得到的云母片置于濃度為0.25mM的4_馬來酰亞胺基丁酸_N_琥珀酰亞胺酯(GMBS)的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置45分鐘左右，使GMBS偶聯到二氧化硅納米顆粒的表面上；將云母片取出`并用磷酸鹽緩沖液充分潤洗；
[0104](6)將步驟(5)得到的云母片置于10μ g/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置反應30分鐘左右，將云母片取出并用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0105](7)取25 μ L濃度為I μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的石英片上，室溫下放置30分鐘左右，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2，得到在水中具有優異的透明性的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片；透射光譜測試的結果表明，沉積二氧化硅層的石英片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
[0106](8)將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的乳腺癌細胞MCF7懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去乳腺癌細胞MCF7懸浮液，將生物芯片在硫酸緩沖液中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的乳腺癌細胞MCF7用質量濃度4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液溶液固定20分鐘后，再用0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用2 μ g/ml的DAPI磷酸鹽緩沖液染色15分鐘后，在PBS中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的乳腺癌細胞MCF7進行計數，計算捕
獲效率。
[0107]作為對照組1，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴B細胞瘤Daudi懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘，在磷酸緩沖液中涮洗1_2次后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴B細胞瘤Daudi進行計數，計算捕獲效率。
[0108]作為對照組2，將步驟(7)得到的生物芯片的正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每個孔內加入3毫升濃度為I X IO5個/mL的人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，置于細胞培養箱中(優選室溫下放置進行反應的時間為30分鐘左右)，吸去人淋巴瘤Jurkat T細胞懸浮液，將生物芯片在PBS中充分涮洗；然后將生物芯片捕獲的人淋巴瘤Jurkat T細胞用含4%體積濃度的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定20分鐘后在磷酸緩沖液中涮洗1-2次，再用含0.2%體積濃度的Triton X-100磷酸鹽緩沖液穿膜10分鐘后在PBS中涮洗1_2次，再用DAPI (2 μ g/ml)染色15分鐘后在PBS中涮洗1_2次，最后用空氣氣流輕輕吹干；用Nikon倒置熒光顯微鏡10倍下分別拍照(每次至少3個基片，每個基片選取中間部分10個不同的位置)，并對生物芯片上所捕獲的人淋巴瘤JurkatT細胞進行計數，計算捕獲效率。
[0109]實驗結果表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的乳腺癌細胞MCF7的捕獲效率為74.3%。對照實驗中的人淋巴B細胞瘤Daudi的捕獲效率僅為10.3% ；人淋巴瘤Jurkat T細胞的捕獲效率僅為6.7%。這些數據表明，本發明的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，具有聞的循環腫瘤細胞的捕獲效率和靈敏度，富集后的循環腫瘤細胞活性高。
【權利要求】
1.一種用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，其特征是:所述的生物芯片是在基片的表面包覆有微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層，在所述的二氧化硅層的表面修飾有特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體。
2.根據權利要求1所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，其特征是:所述的二氧化硅層的表面修飾有特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體，其特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的修飾量不少于0.1 μ g/cm2。
3.根據權利要求1所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，其特征是:所述的微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層的厚度為I~50微米；所述的納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的粒徑為20~900納米。
4.根據權利要求1所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，其特征是:透射光譜測試的結果表明，所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片在水環境下的可見光波透過率為30~99%。
5.根據權利要求1所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片，其特征是:所述的基片選自玻璃片、石英片和云母片中的一種。
6.一種根據權利要求1~5任意一項所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片的制備方法，其特征是，所述的制備方法包括以下步驟: (1)將基片清洗干凈，氮氣吹干，然后將基片置于燃燒的火焰上，在基片的表面沉積一層由納米煙灰顆粒組成的煙灰層； (2)將步驟(1)得到的沉積有由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的基片置于含硅化合物所揮發的氣體環境中，通過化學氣相沉積，在由納米煙灰顆粒組成的煙灰層的納米煙灰顆粒的外表面沉積一層二氧化娃外殼層； (3)將步驟(2)得到的基片進行煅燒處理，除去二氧化硅外殼層內部的所述的納米煙灰顆粒，在基片的表面沉積得到微米厚度的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層； (4)將步驟(3)得到的基片用氧等離子體處理，以在納米二氧化硅顆粒的表面產生羥基；然后置于1-10%體積濃度的(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷無水乙醇溶液中進行反應；取出基片并清洗； (5)將步驟(4)得到的基片置于濃度為0.1-0.5mM的4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中，室溫下放置，使4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯偶聯到納米二氧化硅顆粒的表面上；將基片取出并清洗； (6)將步驟(5)得到的基片置于l-ΙΟμg/mL的鏈霉親和素的磷酸鹽緩沖液中，室溫下放置進行反應，將基片取出并清洗； (7)將濃度為1-10μ g/mL的特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體的磷酸鹽緩沖液滴加到步驟(6)得到的基片上，室溫放置，使特異識別腫瘤細胞的抗EpCAM抗體修飾在所述的由納米二氧化硅顆粒層組成的二氧化硅層的表面，得到所述的用于循環腫瘤細胞富集和檢測的生物芯片。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是:所述的微米厚度的由納米二氧化硅顆粒組成的二氧化硅層的厚度為I~50微米；所述的納米二氧化硅顆粒中的納米二氧化硅顆粒的粒徑為20~900納米。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是:所述的火焰是由動物油脂、植物油脂、蠟燭、酒精或煤油燃燒所產生的火焰。
9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是:所述的含硅化合物選自四氫化硅、四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷和四氯化硅所組成的組中的至少一種。
10.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是:所述的進行煅燒處理的溫度為400~1300℃。
【文檔編號】C12M1/00GK103725589SQ201210382382
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月10日 優先權日:2012年10月10日
【發明者】王樹濤, 楊高, 江雷 申請人:中國科學院化學研究所