專利名稱：一種新型人胎盤屏障體外模型的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型人胎盤屏障體外模型。
背景技術：
目前胎盤屏障體外模型有胎盤灌流模型和滋養層細胞模型兩類。胎盤灌流模型是對完整胎盤小葉中的胎兒動靜脈進行插管，以建立胎兒循環，可用于外源及內源性物質的胎盤轉運機制研究，為胎盤代謝、內源性物質在母兒間的循環，以及致畸作用的風險評估提供了最直接的證據。但該技術的局限性在于，妊娠早、中期臍血管狹窄，插管困難，無法通過該模型對藥物的胎盤透過性進行準確評價，胎盤制備和灌流過程中操作復雜，易損傷組織，影響結果的準確性。胎盤滋養層細胞培養模型的原代培養和滋養層細胞系(BeWo，、Jar和JEG-3)具備胎盤的激素合成和一定的胎盤滋養層細胞形態學特點，可接種于體外通透性支持物上，如Transwell等，但該模型不能摸擬人胎盤屏障結構在孕期呈現的動態變化過程，通常用細胞模型得到的實驗結果往往需要用胎盤灌流方法進一步證實。
發明內容
為了克服上述方法的缺陷，本發明人通過大量實驗后，以胎盤組織培養技術和Ussing擴散池方法為基礎，建立了一種新型人胎盤屏障體外模型。與胎盤灌流模型相比，本模型操作簡便，可對各孕期胎盤組織取材研究；與胎盤滋養層細胞培養模型相比，本模型的轉運體的表達在整個研究過程不易改變，極性和細胞間的連接與體內更加相似，克服了胎盤滋養層細胞培養模型的細胞培養周期長的缺陷。本發明的目的是提供一種新型的人胎盤屏障體外模型。本發明人胎盤屏障體外模型通過以下方法建立，包括步驟I.制備胎盤組織薄片I)收集胎盤選擇25-30歲，孕36-40周足月分娩的健康產婦胎盤，胎盤娩出后，在無菌條件下，用冰冷的含肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中備用。2)用冰冷的含肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中備用。3)切取胎盤組織塊在胎盤終末絨毛部位，取2塊組織塊，用KRBB漂洗。4)玻璃化冷凍法冷凍胎盤組織在室溫下將組織塊移至冷凍保護液A中平衡5min，然后移入冷凍保護液B中快速清洗至少10次，時間控制在50s內；之后迅速將組織塊移至冷凍的葉片上，將載有組織塊的冷凍葉片立即投入液氮中保存30s。5)振動切片按照Leica VT1000振動切片機的說明設置速度、頻率、切片厚度，將冷凍好的胎盤組織塊用專用膠水固定在切片機的托盤中進行切片。6)組織復蘇將切好的胎盤組織薄片按照母體面-胎兒面的方向固定于擴散池的夾片上，迅速浸入37°C含I. OmoI/L的蔗糖液中lmin，然后順次移至含O. 5mol/L、0. 25mol/L的鹿糖液中，分別停留3min,最后在純水中平衡5min。2、建立人胎盤屏障體外系統此系統由雙通道的Ussing擴散池、溫度加熱塊、氣體供應裝置、恒溫浴槽四部分裝置組成；將恒溫水浴槽經樹脂膠管與溫度加熱塊相連，調節恒溫浴槽內水溫維持Ussing擴散池內溫度保持37°C恒溫。將Ussing擴散池的通氣針閥與氣體供應裝置連接，同時Ussing擴散池的兩側通入95% O2和5% CO2的混合氣體。調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，以保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出。3、將胎盤組織薄片固定連接在擴散池中I)樣品固定將復蘇后的胎盤組織薄片固定于樣品夾片上，將載有胎盤組織的樣品夾片插入擴散池兩室底部的插口內，固定完好。 2)加注灌流液樣品固定后即刻在擴散池的母體側和胎兒側同時緩慢加入預熱至37. 5 0C，ρΗ7· 4 的培養液 KRBB 7mL。3)調節氣流調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出。4)平衡37. 5°C恒溫條件下維持胎盤組織薄片的活性，轉運實驗開始前將組織薄片預平衡30min。 所述冷凍保護液A是將7. 5%乙二醇、7. 5%DMS0、85%純水充分混合后配制的溶液；冷凍保護液B是將15%乙二醇、15%DMS0、70%純水充分混合后配制的溶液。本模型建立后，即可用于有關的胎盤研究，根據研究目的進行相關操作。本發明模型的優點和特點I.本模型模擬胎盤在母體內的環境，具備體內胎盤完整的絨毛結構，分泌功能和物質轉運功能，模擬了母胎間物質轉運的循環系統。通過胎盤絨毛組織形態學特點，胎盤滋養層細胞標志性分泌物hCG的分泌，外排轉運體P-gp mRNA的表達和外排功能，以及對被動擴散低-高分子量標志物的通透性，反映該模型持續灌流5小時仍與在體胎盤保持了相似的功能活性。2.經形態學和功能學鑒定，本模型具備胎盤的在體環境，及物質交換、屏障和內分泌的功能，為研究胎盤的結構、功能、物質代謝及妊娠相關疾病提供了一種新的快速篩選方法。該方法在毒理學、靶向治療以及妊娠期應用藥物的安全性評價領域具有廣泛的應用價值。3.本發明模型對臨床較難收集到的樣本，如在環境污染物和毒物的胎兒宮內暴露，感染病毒對胎盤功能的影響等研究中，利用人胎盤屏障體外模型可嚴格控制實驗條件，對特殊疾病的發病機制進行研究。4.本系統可同時完成2個組織樣品的測量。5.本發明Ussing擴散池包含了 2個擴散小室，可為細胞和組織提供相似于體內環境的生理環境。以往的胎盤組織是在普通培養瓶或培皿中培養后應用到相關的實驗研究，而人體胎盤是母兒間物質交換的場所，存在母體和胎兒兩個血液循環系統，其間由胎盤屏障相隔，調控了營養物質、氣體及代謝產物的轉運，并具有內分泌、免疫等功能。而Ussing擴散池的2個擴散小室為模擬胎盤的母體和胎兒循環過程提供了有利條件。
圖I本模型體外系統各裝置聯接圖其中1.胎盤組織薄片；2. Ussing擴散池；3.溫度加熱塊；4.外部恒溫水浴槽；
5.Ussing擴散池的通氣針閥；6.氣體供應裝置。
具體實施例方式為了進一步說明本發明，下面通過實施例作進一步的說明，但不限制本發明。實施例一、試劑的制備
UKRBB :稱取 NaCl 6. 923g、KCl O. 354g、MgSO4 ·7H20 O. 288g,CaCl2 ·6Η20 0. 56g、NaHCO3 2. lg、Na2HPO4 0. 136g、葡萄糖I. Sg、L-丙氨酸0. 178g，混合后以800mL雙蒸水充分溶解，調節PH值至7. 4，雙蒸水補足體積至IOOOmL,過O. 22 μ m濾膜，分裝，4°C保存。2、冷凍保護液A :將7. 5%乙二醇、7. 5%DMS0、85%純水充分混合，配制成溶液。3、冷凍保護液B :將15%乙二醇、15%DMS0、70%純水充分混合，配制成溶液。二、建立人胎盤屏障體外模型I.制備胎盤組織薄片I)收集胎盤選擇25-30歲，孕36-40周足月分娩的健康產婦胎盤，胎盤娩出后，在無菌條件下，用冰冷的含4U/mL肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤3次，浸于冰冷的含4U/mL肝素的KRBB中。2)用冰冷的含4U/mL肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤3次，之后浸于冰冷的含4U/HiL肝素的KRBB中備用。3)取胎盤終末絨毛部位，即胎盤母體面底板區的中間帶的叢密絨毛處，2塊約3cmX 3cmX Icm大小的組織塊，用KRBB漂洗。4)在室溫下將組織塊移至冷凍保護液A中平衡5min，然后移入冷凍保護液B中快速清洗至少10次，時間控制在50s內；之后迅速將組織塊移至自制的冷凍葉片上，將載有組織塊的冷凍葉片立即投入液氮中保存30s。5)按照Leica VT1000振動切片機的說明設置速度、頻率及500 μ M切片厚度，將冷凍好的胎盤組織用專用膠水固定在切片機的托盤中進行切片。6)將切好的胎盤組織薄片按照母體面-胎兒面的方向固定于擴散池的夾片上，迅速浸入37°C含I. OmoI/L的蔗糖液中lmin，然后順次移至含O. 5mol/L、0. 25mol/L的蔗糖液中，分別停留3min,最后在純水中平衡5min。2、建立人胎盤屏障體外系統將恒溫水浴槽經樹脂膠管與溫度加熱塊相連，調節恒溫浴槽內水溫維持Ussing擴散池內溫度保持37°C恒溫。將Ussing擴散池的通氣針閥與氣體供應裝置連接，同時Ussing擴散池的兩側通入95% O2和5% CO2的混合氣體。調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，以保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出。3、將胎盤組織薄片連接固定在擴散池中I)將復蘇后的胎盤組織薄片固定于樣品夾片上，將載有胎盤組織的樣品夾片插入擴散池兩室底部的插口內，固定完好。2)樣品固定后即刻在擴散池的母體側和胎兒側同時緩慢加入預熱至37. 5°C，pH7. 4 的培養液 KRBB 7mL。3)調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出。4)平衡37. 5°C恒溫條件下維持胎盤組織薄片的活性，轉運實驗開始前將組織薄片預平衡30min。三、驗證模型是否建立成功I.胎盤終末絨毛形態學檢測胎盤終末絨毛部位隨機切取組織，生理鹽水清洗。于Ussing擴散池中培養5h后·經2. 5%戊二醛溶液固定4h。將組織用O. Imol -L^1PBS (pH=7. 4)清洗3次，每次40min。然后再用含有1%鋨酸的O. Imol · L^1PBS (pH=7. 4)固定I. 5h，50%、70%、95%、100%酒精逐級脫水，各lOmin。環氧樹脂丙酮(I I)浸透2h，環氧樹脂812+815包埋，Leica超薄切片機切片(50-70nm)。切片用5%乙酰雙氧鈾鎂和檸檬酸鉛染色，用JEM-IOO電鏡觀察絨毛形態。結果透射電鏡下觀察合體滋養細胞表面均覆有濃密的微絨毛，呈細而長，整齊排列，細胞內含有豐富的內質網和線粒體，遍布于整個胞質，胞質內含有少量脂質顆粒。2.胎盤組織人絨毛膜促性腺激素(β -hCG)的分泌胎盤組織薄片置于擴散池中培養，分別于0、l、2、3、4、5、12、24、48h在胎盤屏障體外模型母體側、胎兒側各取樣100 μ L，同時補充同溫度等體積的K氏緩沖液，IOOOrpm.mirT1,離心IOmin,取上清液，4°C保存。Elisa法檢測試劑盒說明書進行操作，酶標儀在450nm吸收波長下讀取OD值，繪制標準曲線，將OD值帶入標準曲線，計算待測樣本的濃度。結果胎盤終末絨毛組織在擴散池中培養，48h內培養液中均可檢測到β-hCG，且均呈現出先上升后下降的趨勢，分泌量峰值分別在培養的5h。3.胎盤組織P-gp/MDR I mRNA的表達將灌流后的胎盤組織置于液氮中，離心柱法提取總RNA，檢測總RNA濃度，鑒定其純度及完整性，以2 μ g RNA為模板逆轉錄合成cDNA。上游引物
5’ TGCTCAGACAGGATGTGAGTTGG3 ’ ；下游引物 5 ’ GTAATTACAGCAAGCCTGGAACC3，產物長 122bp。管家基因 GAPDH 上游引物 5 ’ CCATGGAGAAGGCTGGGG3 ’;下游引物 5 ’ -CAAAGTTGTCATGGATGACC3，，產物長246bp。PCR擴增的反應體系為=Premix Ex Taq酶10 μ L，cDNA2 μ L，引物各I. O μ L加雙蒸水至總體積20 μ L。反應條件94°C預變性lmin ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環，72°C延伸lOmin, 4°C IOmin0 1%瓊脂糖凝膠電泳，100V，25min，紫外燈下觀察拍照，凝膠圖像分析系統檢測灰度值。以P-gp灰度值/GAPDH灰度值表示P-gp的表達水平。結果采用半定量RT-PCR方法可檢測到經灌流5h后的胎盤終末絨毛存在P_gpmRNA的表達。4.胎盤組織P-gp外排功能檢測母體側和胎兒側均加入空白/ΙΟΟμΜ維拉帕米的KRBB 7mL，擴散池的兩室通Λ 95 % 02和5% C02的混合氣體，37 °C恒溫條件下維持胎盤組織薄片的活性，空白的KRBB/100 μ M維拉帕米的KRBB中平衡30min。母體側分別加入4 μ M的P-gp探針底物羅丹明(Rhol23)/含4μ M羅丹明和100 μ M維拉帕米KRBB7mL，胎兒側加入空白的KRBB/100 μ M維拉帕米的KRBB。轉運開始后30min，于胎兒側取樣200 μ L，每組平行做3個樣本，多功能酶標儀530nm激發波長，590nm發射波長下檢測熒光強度值。根據標準曲線計算藥物濃度，上述實驗均避光操作，實驗重復3次，計算表觀滲透系數。結果依據公式分別計算Papp,母體側向胎兒側的轉運中，通過P-gp抑制劑維拉帕米抑制P-gp功能 ，可顯著增加Rhol23由母體側向胎兒側的轉運，Papp值由
O.26±0. ΟΙΧΙΟ-7/cm.s—1顯著增加為2. 89±0· 06X ΙΟ-7/cm · s—1，表明胎盤屏障體外模型母體側的P-gp具有顯著的外排特性(p〈0. 01)，可用于p-gp參與的主動轉運研究。5.胎盤屏障通透性檢測將胎盤組織薄片與擴散池固定連接，平衡30min后，于擴散池的母體側分別加入37°〇，0.5 4 11熒光素溶液和10 μ M FD70s溶液7mL。于給定的時間間隔1、2、3、8、12、24h，在胎兒側取樣200 μ L，同時補充同溫度等體積的KRBB。多功能酶標儀490nm激發波長，520nm發射波長下檢測熒光強度值。根據標準曲線計算各時間點藥物濃度，計算各時間點轉運率和Papp，轉運率=胎兒側藥物轉運量/母體側藥物的初始量X 100%。避光操作，實驗重復3次。結果低分子量標志物突光素分子量為332Da, 24h內的轉運率為(33. 10±3. 22)%，轉運率與時間呈良好的線性關系，無飽和現象，符合被動擴散特點。熒光素在24h的Papp為(3. 42 ±O. 24) X 10_6cm · s—1，吸收較好，高分子量標志物FD70S分子量為 70，OOODa, 24h 內的轉運率為(O. 39±O. 01) %，Papp 為(3. 93±O. 08) X 10_8cm · s-1，吸收較差，表現為與被動擴散的分子量選擇性相同的滲透特征。
權利要求
1.一種新型人胎盤屏障體外模型，其特征在于通過如下方法建立，包括步驟 1)制備胎盤組織薄片 收集胎盤選擇25-30歲，孕36-40周足月分娩的健康產婦胎盤，胎盤娩出后，在無菌條件下，用冰冷的含肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中； 用冰冷的含肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中備用； 切取胎盤組織塊在胎盤終末絨毛部位，取2塊 組織塊，用KRBB漂洗； 玻璃化冷凍法冷凍胎盤組織在室溫下將組織塊移至冷凍保護液A中平衡5min，然后移入冷凍保護液B中快速清洗至少10次，時間控制在50s內；之后迅速將組織塊移至冷凍的葉片上，將載有組織塊的冷凍葉片立即投入液氮中保存30s ； 振動切片按照Leica VT1000振動切片機的說明設置速度、頻率、切片厚度，將冷凍好的胎盤組織塊用專用膠水固定在切片機的托盤中進行切片； 組織復蘇將切好的胎盤組織薄片按照母體面-胎兒面的方向固定于擴散池的夾片上，迅速浸入37°C含I. OmoI/L的蔗糖液中lmin，然后順次移至含O. 5mol/L、0. 25mol/L的鹿糖液中，分別停留3min,最后在純水中平衡5min ； 2)建立人胎盤屏障體外系統 將恒溫水浴槽經樹脂膠管與溫度加熱塊相連，調節恒溫浴槽內水溫維持Ussing擴散池內溫度保持37°C恒溫；將Ussing擴散池的通氣針閥與氣體供應裝置連接，同時Ussing擴散池的兩側通入95% O2和5% CO2的混合氣體；調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，以保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出； 3)將胎盤組織薄片固定連接在擴散池中 樣品固定將復蘇后的胎盤組織薄片固定于樣品夾片上，將載有胎盤組織的樣品夾片插入擴散池兩室底部的插口內，固定完好； 加注灌流液樣品固定后即刻在擴散池的母體側和胎兒側同時緩慢加入預熱至37.5 0C，ρΗ7· 4 的培養液 KRBB 7mL ； 調節氣流調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出； 平衡37. 5°C恒溫條件下維持胎盤組織薄片的活性，轉運實驗開始前將組織薄片預平衡30min ； 所述冷凍保護液A是將7. 5%乙二醇、7. 5%DMS0、85%純水充分混合后配制的溶液；冷凍保護液B是將15%乙二醇、15%DMS0、70%純水充分混合后配制的溶液。
全文摘要
本發明公開了一種新型人胎盤屏障體外模型，本模型模擬胎盤在母體內的環境，具備體內胎盤完整的絨毛結構，分泌功能和物質轉運功能；本模型持續灌流5小時仍與在體胎盤保持了相似的功能活性，本模型的建立為研究胎盤的結構、功能、物質代謝及妊娠相關疾病提供了一種新的快速篩選方法，在毒理學、靶向治療以及妊娠期應用藥物的安全性評價領域具有廣泛的應用價值。
文檔編號C12N5/073GK102899284SQ20121038310
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者宋殿榮, 郭潔, 韓芳, 張崴, 王雅楠, 王玉華 申請人:天津中醫藥大學第二附屬醫院