水稻基因組學的研究方法
【專利摘要】本發明涉及一種水稻基因組學的研究方法，本發明根據粳稻日本晴全基因組BAC序列與秈稻93-11全基因組序列BLAST分析的結果，開發基于秈稻-粳稻第1染色體序列差異的特異InDel標記，還對所設計引物在2個秈稻和5個粳稻品種之間進行多態性鑒定，獲得分子標記除了在秈稻-粳稻亞種之間具有多態性之外，一些標記在亞種內也具有多態性，因此這些引物可以用于同一亞種間多態性鑒定。甚至少數標記對來自于同一遺傳背景及其相應突變體之間有多態性。可以預見，開發的分子標記在秈稻-粳稻遺傳分化、秈稻-粳稻雜種優勢的分子機制解釋、分子標記輔助育種等方面具有重要利用價值。
【專利說明】水稻基因組學的研究方法
【技術領域】
[0001]水稻基因組學的研究方法，屬于基因工程學領域。
【背景技術】
[0002]水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單子葉模式植物,共有12對染色體，其中第I染色體是最長的，其長度達51.4Mb，約占水稻基因堿基總數的1/10。其中短臂序列長493729bp，約6756個基因，約30%基因(2073個基因)已被功能分類。基因大小的均值是6.4kb。第I染色體是富含G + C的染色體，特別是在編碼區，具有幾個分散或串聯重復序列基因簇分布的特征。已經定位于第I染色體的基因有抗病性基因、白葉枯病抗性基因、稻瘟病抗性基因、抗蟲性基因、品質相關性狀基因、產量相關性狀基因、株型相關性狀基因、株聞相關基因、育性相關基因等對水稻廣量有很大影響的基因。
【發明內容】
[0003]水稻基因組的成功測序是繼完成人類基因組測序后的又一巨大成功。進行水稻基因組及后基因組研究， 對提升我國農作物育種水平和培育新品種具有重要意義，并將幫助全球解決食物問題。
[0004]實驗材料
本研究材料包括2個高產秈稻恢復系93-11、Τ13與5個優良粳稻品種空育131、彩、加花I號、合江06、Ri22，用于秈稻-粳稻之間特異性分子標記的篩選。
[0005]實驗設計
利用生物信息學的方法，根據粳稻日本晴和秈稻93-11的基因組序列差異來設計InDel標記。日本晴的BAC序列已在染色體上定位，用鳥槍法測序的93-11基因組序列也通過與日本晴的序列比對而被錨定在各個染色體。設計分子標記可按如下操作:
目標區段所包括的日本晴BAC序列
(http://rgp.dna.affrc.g0.jp/cg1-bin/statusdb/irgsp-status.cgi)
I
目標BAC序列與93-11序列比對，篩選特異InDel特異位點 ||(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)
含InDel的日本晴序列(1000bp)
I
軟件設計特異InDel引物(長度200_300bp)
I
設計引物特異性的鑒定(http://rapdb.dna.affrc.g0.jp/tools/blast/)
多態性鑒定，獲得秈稻-粳稻之間特異InDel標記 實驗方法
1、DNA的提取
(1)提取方法
DNA的提取方法有很多種，經典的方法如SDS法，CTAB法等，本研究采用CTAB法進行水稻DNA的提取。將種子在37°C恒溫培養箱中萌發后置于25°C溫室中生長，當植株長出3_4片葉時，每個水稻品種選擇一個單株，取約3g新鮮葉片，分別置于1.5mL的離心管中。將裝有葉片的離心管迅速置于冰上，備用抽提DNA。按照CTAB方法提取DNA，各研究材料的DNA的含量在Bio—Photometer分光光度計(Eppendorf公司)中檢查測定。
(2)所用試劑:
① 2XCTAB
CTAB2g
0.5M EDTA (PH8.0) 8mL IM Tris-Hcl (PH8.0)20mL
Nacl12.3g
加 ddH20 至200mL
(2)10% CTAB` CTAB100g
Nacl40.95g
加 ddH20 至1000mL
(3)CTAB法提取DNA的原理和步驟:
1)將種子在37°C恒溫培養箱中萌發后置于25°C溫室中生長，當植株長出3-4片葉時，取約3g新鮮葉片，加液氮研磨成粉末狀，分別置于1.5mL的離心管中；
2)加入800μ I的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65°C水浴預熱)，每5min輕輕震蕩幾次，20min 后 12000 r/min,離心 15 min ；
3)小心吸取上清液，加入等體積的酚:氯仿(各400μ I)溶液，混勻，4°C，12000 r/min,離心10 min ；
4)小心吸取上清液,加入等體積的氯仿,混勻，4°C,12000 r/min,離心10 min。
[0006]5)重復步驟(4) 1-2次，至蛋白層不出現為止；
6)取上清，-20°C沉淀lh, 4°C, 12000 r/min,離心 10 min ；
7)棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
8)室溫下干燥后(一般干燥5-15 min)，溶于30-50 μ I DEPC去離子水中，于_20°C或者-70°C下保存備用。
[0007]2、PCR反應程序
(I)引物來源
本研究所用引物均來自于自身設計的引物，由英駿生物技術有限公司合成。[0008](2) PCR反應體系
本研究所用反應體系均采用2 X GC、總體積20 μ I進行配置，具體如下:
【權利要求】
1.根據各對引物在(日本晴)染色體上的具體位置等相關信息，構建了水稻第I染色體的InDel分子標記的物理圖譜，該圖譜包括86對InDel分子標記，平均每IcM分布0.47對標記，平均每對引 物的物理間隔為0.52Mb。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725768SQ201210388285
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月15日 優先權日:2012年10月15日
【發明者】不公告發明人 申請人:丁筱玲