專利名稱：一種誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法。
背景技術：
在不利環境下，多種細菌會進入一種活的非可培養(viable butnonculturable，VBNC)狀態。該狀態是非芽孢細菌的一種休眠形式，可以提高細菌在不利環境下的存活能力。目前已知60多種細菌都能進入活的非可培養狀態，其中絕大部分為致病菌。雖然活的非可培養狀態細菌仍然具有代謝活性，但在該菌常用的非選擇性培養基上不能生長或形成菌落，因此常規細菌檢測方法如平板計數法檢測不到活的非可培養狀態細菌的存在，這樣就可能低估檢測樣品中細菌的數量，給人們帶來安全隱患。開展有關活的非可培養狀態細菌的特征及形成機制等方面的研究對有效殺滅活的非可培養狀態細菌至關重要。但由于獲得活的非可培養狀態細菌需要很長的時間，因此限制了對其研究的進度。目前誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法主要是寡營養結合低溫的方法。但該方法所需的誘導時間長，通常要一個月以上，從而限制了對活的非可培養狀態細菌的研究進度。
發明內容
本發明的目的是提供一種誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法。本發明提供的誘導目的細菌進入活的非可培養狀態的方法，包括如下步驟將目的細菌經高壓二氧化碳處理，使其進入活的非可培養狀態。上述方法中，所述高壓二氧化碳處理的條件如下壓力為5_7MPa、溫度為25-37°C、時間為 5-60min。上述方法中，所述高壓二氧化碳處理的條件如下壓力為5MPa、溫度為25°C、時間為40min ；或壓力為5MPa、溫度為31°C、時間為30min ；或壓力為5MPa、溫度為37°C、時間為25min。 在本發明的實施例中，所述高壓二氧化碳處理為將目的細菌用高壓二氧化碳裝置進行高壓二氧化碳處理，在本發明的實施例中，高壓二氧化碳裝置型號CAU-HPCD-I (高密度二氧化碳殺菌裝置，在專利ZL200520132590. X中公開)，具體步驟將20mL待誘導菌液(細菌懸浮液)裝入玻璃瓶中，用封口膜封好；將菌液放入反應釜中，對菌液進行HP⑶處理，處理壓力為5MPa，處理溫度為25°C，保壓時間為40min ;達到上述處理參數后立即卸壓；得到誘導后菌液。上述方法中，在所述高壓二氧化碳處理前還包括如下步驟將所述目的細菌洗滌、懸浮，得到細菌懸浮液。上述方法中，所述洗滌和所述懸浮均采用生理鹽水，所述生理鹽水具體為O. 85%(質量百分含量)NaCl水溶液。上述方法中，所述目的細菌為處于對數期的目的細菌。上述方法中，所述目的細菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌具體為Escherichia coli0157:H7。在上述方法中，在高壓二氧化碳處理后，還包括如下步驟檢測經過誘導處理后的目的細菌的活菌數和可培養菌數；若可培養菌數為零而活菌數不為零，則目的細菌進入了活的非可培養狀態；其中，檢測經過誘導處理后的目的細菌活菌數采用PI/SYT09雙染法，檢測經過誘導處理后的目的細菌可培養菌數采用平板計數法。本發明的另一個目的是提供一種細菌培養方法。本發明提供的細菌培養方法，包括上述方法的步驟。
本發明的實驗證明，本發明開發一種誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法，利用高壓二氧化碳技術處理細菌，可促使細菌在Ih之內快速進入活的非可培養狀態；本發明的方法加快了活的非可培養狀態細菌的制備，提高了有關活的非可培養狀態細菌的研究進度。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下面結合實施例對本發明做進一步說明，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。實施例I、誘導細菌進入活的非可培養狀態一、高壓二氧化碳誘導I、細菌懸浮液制備采用O. 85% (質量百分含量)NaCl水溶液洗滌對數生長期的E. coli 0157:H7 (菌株編號NCTC12900)菌體兩次，然后用O. 85% (質量百分含量)NaCl水溶液重懸菌體，使菌體濃度約為108cfu/mL，作為待誘導菌液(細菌懸浮液)；2、高壓二氧化碳處理實驗組用自行設計的高壓二氧化碳殺菌機(型號CAU-HP⑶-1，高密度二氧化碳殺菌裝置，在專利ZL200520132590. X中公開)對菌液進行高壓二氧化碳處理；具體步驟將20mL待誘導菌液(細菌懸浮液)裝入玻璃瓶中，用封口膜封好；將菌液放入反應釜中，對菌液進行HP⑶處理，處理壓力為5MPa，處理溫度為25°C，保壓時間為40min ;達到上述處理參數后立即卸壓；得到誘導后菌液。對照組待誘導菌液不進行高壓二氧化碳處理，只在25°C放置40min。二、檢測活菌數測定方法采用PI/SYT0 9雙染法；具體步驟將配比好的染料混合物(PI SYTO 9體積比為I: I)與誘導后菌液按照3:1000的比例混合，混合均勻后在室溫下避光孵育15min ;孵育完成后，在熒光顯微鏡下觀察(1000X)并計數，通常需要選擇10個視野，而且一個樣品要做兩次重復。可培養菌數測定方法采用平板計數法；具體步驟參照GB 4789. 2-2010方法，將誘導后菌液用O. 85%NaCl進行10倍逐級稀釋，根據預實驗吸取3個連續稀釋度的稀釋樣ImL于滅菌平皿中，倒入約20mL TSA培養基搖勻，待培養基凝固后倒置于37°C培養箱中培養24h，然后記錄菌落數。采用上述方法分別檢測實驗組和對照組的活菌數和可培養菌數，從而計算活的非可培養狀態菌數(活菌數-可培養菌數)。以檢測細菌是否進入了活的非可培養狀態，當可培養菌數為零而活菌數不為零時就認為細菌進入了活的非可培養狀態。結果如下實驗組誘導后菌液的活菌數為106 79cfu/mL ;誘導后菌液的可培養菌數為O ;進入了活的非可培養狀態的菌數為106 79cfu/mL。
對照組的可培養菌數仍約為108cfu/mL，基本認為沒有活的非可培養狀態的菌。因此，可以看出，本發明的方法在高壓二氧化碳誘導40min時獲得了活的非可培養狀態的E. coli 0157:H7。而目前采用的寡營養結合低溫法需要I個月的時間，因此本發明的方法可以誘導細菌快速進入活的非可培養狀態。實施例2、誘導細菌進入活的非可培養狀態一、高壓二氧化碳誘導I、細菌懸浮液制備與實施例I中的一的步驟I的方法相同。2、高壓二氧化碳誘導與實施例I中的一的步驟2的方法基本相同，僅將處理溫度變為31 °C，保壓時間變為30min ;得到誘導后菌液。二、檢測與實施例I中的二的方法相同。結果如下實驗組誘導后菌液的活菌數為106 89cfU/mL ;誘導后菌液的可培養菌數為O ;因此進入了活的非可培養狀態的菌數為106 89cfu/mL。對照組的可培養菌數仍約為108cfu/mL，基本認為沒有活的非可培養狀態的菌。因此，可以看出，本發明的方法在高壓二氧化碳誘導30min時獲得了活的非可培養狀態的 E. coli 0157:H7。本實施例同實施例I相比，高壓二氧化碳使E. coli 0157:H7進入活的非可培養狀態的誘導時間更加縮短，而且獲得的活的非可培養狀態的菌數與實施例I接近。實施例3、誘導細菌快速進入活的非可培養狀態一、高壓二氧化碳誘導I、細菌懸浮液制備與實施例I中的一的步驟I的方法相同。2、高壓二氧化碳誘導與實施例I中的一的步驟I的方法基本相同，僅將處理溫度變為37°C，保壓時間變為25min ;得到誘導后菌液。結果如下實驗組誘導后菌液的活菌數為IO5 72CfVmL ;誘導后菌液的可培養菌數為O ;因此進入了活的非可培養狀態的菌數為105 72cfu/mL。對照組的可培養菌數仍約為108cfu/mL，基本認為沒有活的非可培養狀態的菌。因此，可以看出，本發明的方法在高壓二氧化碳誘導25min時獲得了活的非可培養狀態的 E. coli 0157:H7。本實施例同實施例I和2相比，高壓二氧化碳使E. coli 0157:H7進入活的非可培 養狀態的誘導時間更短，但獲得的活的非可培養狀態的菌數要低于實施例I和2。
權利要求
1.一種誘導目的細菌進入活的非可培養狀態的方法，包括如下步驟將目的細菌經高壓二氧化碳處理，使其進入活的非可培養狀態。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述高壓二氧化碳處理的條件如下壓力為 5-7MPa、溫度為 25-37°C、時間為 5_60min。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述高壓二氧化碳處理的條件如下 壓力為5MPa、溫度為25°C、時間為40min ； 或壓力為5MPa、溫度為31°C、時間為30min ； 或壓力為5MPa、溫度為37°C、時間為25min。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于在所述高壓二氧化碳處理前還包括如下步驟將所述目的細菌洗滌、懸浮，得到細菌懸浮液。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述洗滌和所述懸浮均采用生理鹽水，所述生理鹽水具體為O. 85% (質量百分含量)NaCl水溶液。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述目的細菌為處于對數期的目的細菌。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述目的細菌為大腸桿菌，所述大腸桿菌具體為 Escherichia coli 0157:H7。
8.—種細菌培養方法，包括權利要求1-7任一所述方法的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟將目的細菌經高壓二氧化碳處理，使其進入活的非可培養狀態。本發明的實驗證明，本發明開發一種誘導細菌進入活的非可培養狀態的方法，利用高壓二氧化碳技術處理細菌，可促使細菌在1h之內快速進入活的非可培養狀態；本發明的方法加快了活的非可培養狀態細菌的制備，提高了有關活的非可培養狀態細菌的研究進度。
文檔編號C12N1/04GK102899272SQ20121039252
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者廖小軍, 趙鳳 申請人:中國農業大學