專利名稱：環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法
技術領域：
本發明屬于環境水體質量的檢測技術領域，具體涉及一種環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法。
背景技術：
腸道病毒是廣泛存在于水源水及污染水中，不斷引起水媒病毒傳染病的暴發流行。病毒的檢測方法主要有組織培養法、免疫學方法、分子生物學方法等。其中，組織培養法培養周期長，有些病毒缺乏敏感的細胞系來培養或無明顯細胞病變效應；免疫學檢測方法需要較高濃度的病毒樣品，環境水樣濃縮后，也不易達到所需濃度；分子生物學方法多利用核酸的檢測，因其檢測時間短，檢測限低靈敏度高，精確度高，已得到廣泛的應用。環境水體中腸道病毒屬宿主迥異，種類復雜濃度低，現有的關于環境水體中腸道 病毒的PCR檢測方法大多是定性或定量的檢測總腸道病毒，來源于人類分泌物或排泄物的腸道病毒的檢測很少有研究涉及。因環境水體水質復雜同時存在很多PCR反應抑制劑和其他雜質，導致現有檢測方法存在靈敏度不夠高、受雜質干擾影響較大、無法準確定量的缺點。目前還沒有科學的用于對環境水體中人類腸道病毒和非人類腸道病毒含量進行檢測的方法。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法。為此，本發明提供的環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法按下述步驟進行步驟一,樣品處理(I)樣品米集米集待檢測水樣后于4 C條件下保存；(2)病毒濃縮于V mL的待檢測水樣中加入質量百分比為8%的聚乙二醇(PEG-6000)和質量百分比為2. 3%的氯化鈉(NaCl);接著將待檢測水樣在100rpm、4°C條件下攪拌12小時；然后將待檢測水樣在9000g，4°C條件下離心30分鐘，棄上清液，用ImL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50 < V < 250 ;(3) RNA提取使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA ；(4)逆轉錄將5 μ L 的RNA、2 μ L 的 5xgDNA Eraser Buffer、I μ L 的 5xgDNA EraserBuffer和2 μ L的RNase Free dH20在42°C條件下反應2min得到反應液，將該反應液與4 μ L 的5xPrimeScript* Buffer> I μ L 的PrinieScript**' RT Enzyme Mix、I μ L 的 RT PrimerMix和4 μ L的RNase Free dH20混合進行如下反應先在37°C條件下反應15min ;接著在85°C條件下反應5s ;得到cDNA，并將所得cDNA在_80°C條件下保存；步驟二，標準品制備(I)第一輪PCR擴增以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物EVR-Fl和下游引物EVR-Rl進行PCR擴增，得到第一輪擴增后的PCR產物，其中
上游引物EVR-Fl的核苷酸序列為5’ -CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’ ；下游引物EVR-Rl的核苷酸序列為5， -CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3，；(2 )第二輪PCR擴增以第一輪擴增后的PCR產物為模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2進行PCR擴增，得到第二輪擴增后的PCR產物，其中上游引物EVR-F2的核苷酸序列為5， -GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3，；下游引物EVR-R2的核苷酸序列為 5， -ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3，；(3)將所得的第二輪擴增后的PCR產物電泳膠純化回收目的片段，得到目的片段產物，該目的片段產物的長度為m (bp)；(4)首先將目的片段產物與pMD19-T載體連接轉化至大腸桿菌DH5a中，篩選出轉化進插入目的片段的載體的菌落，將該陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養基中于37°C條件下培養12 16小時得到菌液，其中卡那霉素的質量濃度為50μ g/mL ;然后用質粒提取試劑盒從菌液中提取質粒；接著采用雙脫氧終止法對得到的質粒的核苷酸序列進行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經BLAST比對，當所測得的核苷酸序列與人類腸道病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質粒為標準品；當所測得的核酸序列與人類腸道病毒基因相似度小于90%時，重復步驟(4)，直至提取的質粒為標準品；(5 )檢測標準品的OD26tl值η ；(6)利用(式I)計算標準品濃度C (copies/ μ L)
權利要求
1.一種環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法，其特征在于，方法按下述步驟進行 步驟一，樣品處理 (1)樣品米集米集待檢測水樣后于4C條件下保存； (2)病毒濃縮于VmL的待檢測水樣中加入質量百分比為8%的聚乙二醇(PEG-6000)和質量百分比為2. 3%的氯化鈉(NaCl);接著將待檢測水樣在100rpm、4°C條件下攪拌12小時；然后將待檢測水樣在9000g，4°C條件下離心30分鐘，棄上清液，用ImL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50≤V≤250 ; (3)RNA提取使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA ；(4)逆轉錄將5 μ L 的 RNA、2 μ L 的 5X gDNA Eraser Buffer、I μ L 的 5X gDNA EraserBuffer和2 μ L的RNase Free dH20在42°C條件下反應2min得到反應液，將該反應液與.4 μ L 的5XPrimeSerifJt* Buffer、I μ L 的PrimeScript RT Enzyme Mix、I μ L 的 RT PrimerMix和4 μ L的RNase Free dH20混合進行如下反應先在37°C條件下反應15min ;接著在85°C條件下反應5s ;得到cDNA，并將所得cDNA在_80°C條件下保存； 步驟二，標準品制備 (1)第一輪PCR擴增以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物EVR-Fl和下游引物EVR-Rl進行PCR擴增，得到第一輪擴增后的PCR產物，其中 上游引物EVR-Fl的核苷酸序列為5’ -CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’ ； 下游引物EVR-Rl的核苷酸序列為5’ -CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ ； (2)第二輪PCR擴增以第一輪擴增后的PCR產物為模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2進行PCR擴增，得到第二輪擴增后的PCR產物，其中 上游引物EVR-F2的核苷酸序列為5’ -GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3’ ； 下游引物EVR-R2的核苷酸序列為5’ -ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’ ； (3)將所得的第二輪擴增后的PCR產物電泳膠純化回收目的片段，得到目的片段產物，該目的片段產物的長度為m (bp)； (4)首先將目的片段產物與PMD19-T載體連接轉化至大腸桿菌DH5α中，篩選出轉化進插入目的片段的載體的菌落，將該陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養基中于37°C條件下培養12 16小時得到菌液，其中卡那霉素的質量濃度為50μ g/mL ;然后用質粒提取試劑盒從菌液中提取質粒；接著采用雙脫氧終止法對得到的質粒的核苷酸序列進行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經BLAST比對，當所測得的核苷酸序列與人類腸道病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質粒為標準品；當所測得的核酸序列與人類腸道病毒基因相似度小于90%時，重復步驟(4)，直至提取的質粒為標準品； (5)檢測標準品的OD26tl值η; (6)利用(式I)計算標準品濃度C(copies/ μ L)
2.如權利要求I所述的環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法，其特征在于，步驟二(5)中標準品的OD26tl值采用微量紫外分光光度計檢測。
全文摘要
本發明公開了一種環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒的含量檢測方法。在已建立環境水體中腸道病毒定量檢測方法的基礎上，選擇針對人類腸道病毒的引物和探針，制備重組質粒作為標準品，建立了定量檢測人類腸道病毒的實時熒光定量PCR反應體系，定量檢測環境水體中的人類腸道病毒含量和腸道病毒含量，進一步確定非人類腸道病毒的分布情況。該方法具有良好的特異性，靈敏度高，可對人類腸道病毒，腸道病毒進行準確定量并確立環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒的關系。
文檔編號C12Q1/68GK102888469SQ20121039271
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者周進宏, 王曉昌, 張崇淼, 船水尚行, 佐野大輔 申請人:西安建筑科技大學