專利名稱：一種恩拉霉素高產菌株及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于生產抗生素的菌株，具體地說，涉及一種高產恩拉霉素的菌株及其制備方法和應用。
背景技術：
恩拉霉素是由真殺菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidious)發酵產生的ー種由十幾種氨基酸和不飽和脂肪酸結合而成的環狀多肽類抗生素。以往用于生產恩拉霉素的殺真菌鏈霉菌菌株大多是從野生菌株中篩選得到的，其生產水平較低。中國專利ZL201010528367. 2公開了ー種殺真菌鏈霉菌突變菌株FYFJ03 (保藏號CGMCC No. 4113)，其篩選方法是首先采用5-溴尿嘧啶誘使出發菌株突變，產生突變株，然后采用金黃色葡萄球菌，按照生物效價法對突變株進行篩選，得到高產恩拉霉素的菌株。該方法雖然在一定程度上提高了菌株的生產能力，但是由于僅采用了化學誘變，且篩選方式単一，因此菌株生產能 力的提聞有限。
發明內容
本發明的目的是提供一種高產恩拉霉素的菌株，同時提供上述菌株的篩選方法，以及提供該菌株在恩拉霉素生產中的應用。為實現本發明目的，本發明提供了一種分類名稱是殺真菌鏈霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067 (以下簡稱DCS067)的恩拉霉素高產菌株，其保藏號是CGMCCNo. 6220，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(CGMCC)，保藏日期是2012年6月14曰。本發明所提供的DCS067菌株其微生物學特征如下
單菌落的形態為菌落直徑2-3mm，孢子灰色或白色，豐滿。顯微鏡觀察孢子圓形或橢圓形。本發明提供的DCS067的制備方法，包括以下步驟
a、孢子懸液I的制備取殺真菌鏈霉菌的出發菌株，接種于斜面培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40%-60%條件下培養5_8天，然后加入無菌水，將孢子刮下，混勻，得到孢子懸液I ;
b、有機溶劑處理向孢子懸液I中加入無菌有機溶劑，振蕩后靜置，分層，取水相得到孢子懸液II ;所述振蕩可以采用漩渦振蕩器振蕩15-60 S，靜置時間最好為15-30min。C、紫外誘變將孢子懸液II置于滅菌的培養皿中，于波長為254nm的紫外燈下照射45-60s ;照射吋，最好是在功率為30W的紫外燈下垂直距離30cm處照射。d、抗性篩選將誘變處理后的孢子懸液II涂布在含有抗生素的分離培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40%-60%條件下培養5_8天，生成具有抗生素耐藥性的若干單菌落；培養時最好第一天正置，第二天起倒置培養；分別挑取上述單菌落，接種于斜面培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40%-60%條件下培養5_8天后，接種于種子培養基上，在28. 0±0. 5°C, 200^220 rpm條件下培養26_30h后，接種于發酵培養基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm條件下培養9-12天，得到發酵液，采用HPLC法測定發酵液中恩拉霉素效價，其中，效價最高的發酵液對應的菌株即為本發明所述殺真菌鏈霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067。本發明首先將菌株孢子懸液經過有機溶劑處理，去除了孢子表面的多糖被、蛋白類物質等附著物，有利于后續的誘變和篩選。這是因為菌株細胞在生長繁殖過程中，孢子周圍會形成主要由多糖被以及蛋白類物質組成的附著物，此類附著物不僅能阻擋紫外線的作用，還能防礙抗生素的滲入，同時，多糖被中還含有較高濃度的抗生素降解酶，進一歩阻止了抗生素對深層孢子的影響。去除上述附著物，能夠使孢子更好地暴露于外部環境中。本發明在后續步驟中，采用了紫外誘變和抗生素抗性篩選相結合的方式，克服了以往單ー誘變的不足，進ー步提高了突變菌株的恩拉霉素產率。與出發菌株相比，本發明所述菌株的恩拉霉素產率提高了 47. 80%。本發明a步驟所述孢子懸液I中孢子濃度最好為IOll-IO13個/mL或者是吸光度A6tltl為I. 0-2.0 ;該濃度或吸光度下的孢子懸液，易于除去孢子表面的附著物(多糖被、蛋白類物質)，同時還具有良好的繁殖性能。本發明b步驟所述有機溶劑最好 是經滅菌處理的苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、ニ甲苯中的任意ー種或幾種的混合物。其中，更優選的組合是苯酚和三氯甲烷的混合物；混合物中，苯酚和三氯甲烷的體積比最好為25:4。采用上述混合物對孢子懸液I進行處理時，能夠更好地除去孢子表面的多糖被、蛋白類物質。按質量體積比計算，本發明所述斜面培養基的成分最好為0. 5-1.0%麥芽糖粉，
0.05-0. 10%干酵母粉，0. 05-0. 10%金槍魚膏，0. 06-0. 12%胰蛋白胨，0. 1-0. 5%氯化鈉，
1.8-2. 2%瓊脂，其余為水，所述分離培養中抗生素的含量優選0. ro. 7ug /mL，其余成分及含量與斜面培養基相同，所述斜面培養基和分離培養基均采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至6.7±0. I。本發明所述分離培養基中的抗生素優選鏈霉素。按質量體積比計算，本發明d步驟所述種子培養基成分最好為2.5-4.5%玉米粉，0. 2-0. 8%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%棉籽餅粉，I. 5-2. 5%輕質碳酸鈣，0. 15-0. 35%硫酸銨，
0.02-0. 05%硫酸亞鐵，0. 05-0. 25%磷酸ニ氫鉀，I. 5-3. 5%玉米漿，其余為水，該培養基采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至6. 7±0. I。按質量體積比計算，本發明d步驟所述發酵培養基成分最好為6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%輕質碳酸鈣，0. 2-0. 8%氯化鈉，0. 1-0. 5%硫酸銨，0. 003-0. 012%硫酸亞鐵，0. 007-0. 027%磷酸ニ氫鉀，0. 1-0. 5%尿素，0. 005-0. 015%氯化鋅，0. 05-0. 25%氫氧化鉀，0. 07-0. 15%玉米漿，0. 1-0. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高溫a -淀粉酶，其余為水，該培養基采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至5. 9±0. I。本發明所述菌株能夠用于恩拉霉素的生產。用于恩拉霉素生產時，最好在28. 0±0. 5°C，20(T220 rpm條件下，將DCS067菌株在發酵培養基中發酵9-12天，制得含有恩拉霉素的發酵液；發酵采用的培養基成分最好為6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%輕質碳酸鈣，0. 2-0. 8%氯化鈉，0. 1-0. 5%硫酸銨，
0.003-0. 012%硫酸亞鐵，0. 007-0. 027%磷酸ニ氫鉀，0. 1-0. 5%尿素，0. 005-0. 015%氯化鋅，
0.05-0. 25% 氫氧化鉀，0. 07-0. 015% 玉米漿，0. 1-0. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12% 耐高溫 a -淀粉酶，其余為水，該培養基采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至5. 9±0. I。本發明所述殺真菌鏈霉菌DCS067經菌株復試及穩定性考察結果可知，其具有良好的傳代穩定性，同時用于生產恩拉霉素時，可有效提高恩拉霉素的產率。本發明所述方法其篩選方法，操作簡便，結果可靠。
具體實施例方式下面用具體實施例來進ー步說明本發明的內容，但并不以任何方式意味著對本發明進行限制。下述實施例采用的殺真菌素鏈霉菌的出發菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(編號為4. 1312)。實施例I恩拉霉素高產菌株的篩選
a、制備斜面培養基稱取8g麥芽糖粉,0. 8g干酵母粉,0. 8g金槍魚膏，Ig胰蛋白胨,3g氯化鈉，20g瓊脂，加水定容至1000ml，然后用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至6. 7±0. I,得到混合液A。取上述混合液A,分裝至若干30 mmX200 mm的試管中，依次加棉塞、兩層紗布、兩層牛皮紙包好，在0. ll±0.05MPa、121±l°C條件下滅菌20 min。滅菌完畢后立即搖勻，降溫至手感不燙時，鋪成斜面，凝固后得到斜面培養基。制備孢子懸液I :取殺真菌鏈霉菌的出發菌株(4. 1312)，接種至上述斜面培養基 上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40-60%條件下培養7天，然后加入3mL無菌水，用無菌接種針將孢子刮下，轉入含有數顆玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩，取水層得到孢子懸液I，采用分光光度法檢測，其吸光度為A_=l. 506，孢子濃度為IO12個/mL。b、有機溶劑處理將苯酚、三氯甲烷按照體積比25:4混合后，經0. 22 Um有機微孔濾膜過濾除菌，得到無菌有機溶剤。取5mL步驟a得到的孢子懸液I，加入5mL上述無菌有機溶劑，在漩渦振蕩器上振蕩30 s后，靜置30 min，分層；取水相得到孢子懸液II，采用分光光度法檢測，其吸光度為A_=0. 456。與孢子懸液I相比，孢子懸液II的吸光度明顯下降，外觀上也更加澄明通透，說明孢子表面的多糖被、蛋白類物質與有機溶劑結合后從水相轉移到了有機相。C、紫外誘變取5mL上述孢子懸液II,置于直徑6 cm的無菌培養皿中，培養皿中放有滅菌轉子，將培養皿置于磁力攪拌器上，在攪拌條件下，于波長254nm、30W的紫外燈下垂直距離30cm處照射45s。d、制備含有鏈霉素的分離培養基取a步驟所述混合液A，按200 mL/瓶的用量分裝至容積為500 mL的三角瓶中，然后依次加棉塞、兩層紗布、兩層牛皮紙包裝，在
0.11±0. 05MPa、121 土 1°C條件下滅菌20 min。滅菌后立即搖勻，降溫至手感不燙時，按照每ImL培養基0. 3 U g鏈霉素的添加量，加入鏈霉素水溶液，再次搖勻后倒平板，凝固后得到分離培養基。制備種子培養基稱取35g玉米粉，5g玉米蛋白粉，5g棉籽餅粉，20g輕質碳酸鈣，
2.5g硫酸銨，0. 36g硫酸亞鐵，I. 25g磷酸ニ氫鉀，加入去離子水攪拌均勻后，倒入沸水中進行糊化，降至室溫時加入28g玉米衆,再用去離子水定容至IOOOmL,最后用30%氫氧化鈉溶液調節pH至6. 7±0. I。按照50 mL/瓶的用量，邊充分攪拌邊分裝至若干容積為500 mL的三角瓶中，用棉塞、兩層紗布、ー層牛皮紙封ロ。在0. ll±0.05MPa 121±1°C條件下滅菌30min，冷卻后得到種子培養基。制備發酵培養基稱取120g玉米粉，40g玉米蛋白粉，5g輕質碳酸I丐，5g氯化鈉，3g硫酸銨,0. 07g硫酸亞鐵,0. 17g磷酸ニ氫鉀，3g尿素,0. Ig氯化鋅，I. 5g氫氧化鉀,加入400mL去離子水攪拌均勻后，倒入500mL沸水中進行糊化，然后加入0. 7g耐高溫a -淀粉酶進行液化處理，再加入Ig玉米衆和3g L-乳酸,加水定容至IOOOmL ;最后用30%氫氧化鈉溶液調節pH至5. 9±0. I。按照50 mL/瓶的用量，邊充分攪拌邊分裝至若干容積為500mL的三角瓶中，用八層紗布、ー層牛皮紙封ロ，在0. ll±0.05MPa 121 ± 1°C條件下滅菌30min,冷卻后得到發酵培養基。抗性篩選將c步驟紫外誘變處理后的孢子懸液II稀釋至每ImL含10_4_10_7個孢子，涂布在上述含有鏈霉素的分離培養基上，于28. 0±0. 5°C、相対濕度40-60%條件下培養7天，第一天正置，第二天起倒置培養，生成具有抗生素耐藥性的若干單菌落；分別挑取若干上述單菌落，接種于a步驟制備的斜面培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40-60%條件下培養7天后，用接種鏟挖取約0. 5X0. 5cm2接種于上述種子培養基上，在28. 0±0. 5°C， 200^220 rpm條件下培養28h后，接種于上述發酵培養基上，在28. 0±0. 5°C，20(T220 rpm條件下培養10天，得到發酵液，測定發酵液中恩拉霉素效價，效價最高為10617U/mL，將其所對應的菌株命名為殺真菌鏈霉菌DCS067。測定DCS067的形態學特征，其單菌落的形態為菌落直徑2-3mm，孢子灰色或白色，豐滿。顯微鏡觀察孢子圓形或橢圓形。對DCS067進行砂土保藏向保存有DCS067菌株的斜面培養基中加入2 mL無菌水，用接種針將孢子刮下，搖勻后取0.2 mL轉移至空白砂土管中，注明菌株名稱、制備日期和有效期，在壓強為-750'760 mmHg柱下抽真空4-6 h,密封后置于裝有變色娃膠的干燥器中，于5±3°C保存。其保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 6220，保藏日期2012年6月14日。實施例2恩拉霉素高產菌株的復試及穩定性考察
菌株復試取實施例I中保藏DCS067的砂土管，接種至實施例I制備的斜面培養基上，于28. 0±0. 5°C，相対濕度40-60%條件下培養7天后，用接種鏟挖取約0. 5X0. 5 cm2菌層接種至實施例I制備的種子培養基上，于28. 0±0. 5°C, 220 rpm條件下震蕩培養26-30 h后，轉接至實施例I制備的發酵培養基上，于28. 0±0. 5°C, 220 rpm震蕩培養10天，測定發酵液中恩拉霉素的效價，結果為10079、11034、10604 U/mL、平均10572 U/mL。此結果表明DCS067菌株活性良好，并具有高產恩拉霉素的特性。穩定性考察取實施例I中保藏DCS067的砂土管，接種至上述斜面培養基上，于28. 0±0. 5°C，相対濕度40-60%條件下培養7天后，再次接種于上述斜面培養基上進行培養，如此重復，連續轉接三次后，轉接至上述種子培養基上，于28. 0±0. 5°C，220 rpm條件下震蕩培養26-30 h后，轉接至上述發酵培養基中，于28.0±0. 5°C，220 rpm震蕩培養10天，檢測發酵液中土霉素的效價，結果為10217、9805、10079U/mL，平均10034U/mL。此結果表明DCS067具有傳代穩定性。實施例3對比實施例
以出發菌株為發酵菌株，采用等同于實施例2復試的培養條件進行發酵，檢測發酵液中恩拉霉素的效價，結果為7114、7030、7315U/mL，平均7153U/mL。比較實施例I、實施例3所得發酵液中恩拉霉素效價可知，與出發株相比，本發明所述DCS067菌株的恩拉霉素的產率提高了 47. 80% 。
權利要求
1.ー種恩拉霉素高產菌株，其特征在所述菌株保藏名稱是殺真菌鏈霉菌(Streptomyces fungicidious) DCS067,保藏單位 CGMCC,保藏號是 CGMCC No. 6220,保藏日期2012年6月14日。
2.權利要求I所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在于包括以下步驟 a、制備孢子懸液I:取殺真菌鏈霉菌的出發菌株，接種于斜面培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40-60%條件下培養5_8天，然后加入無菌水，將孢子刮下，混勻，得到孢子懸液I ; b、有機溶劑處理向孢子懸液I中無菌有機溶劑，振蕩后靜置，分層，取水相得到孢子懸液II ； C、紫外誘變將孢子懸液II置于滅菌的培養皿中，于波長254nm的紫外燈下照射45_60s ； d、抗性篩選將誘變處理后的孢子懸液II涂布在含有抗生素的分離培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40-60%條件下培養5_8天，生成具有抗生素耐藥性的若干單菌落；分別挑取上述單菌落，接種于斜面培養基上，在28. 0±0. 5°C、相対濕度40-60%條件下培養5-8天后，接種于種子培養基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm條件下培養26_30h后，接種于發酵培養基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm條件下培養9_12天，得到發酵液，測定發酵液中恩拉霉素效價，選取效價最高的發酵液對應的菌株即為殺真菌鏈霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067。
3.根據權利要求2所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在于，所述孢子懸液I中孢子濃度為1011-1013個/mL或吸光度A600為I. 0-2. 0，所述有機溶劑為苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、ニ甲苯中的任意ー種或幾種的混合物。
4.根據權利要求3所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在干，所述有機溶劑是體積比為25:4的苯酚、三氯甲烷的混合物。
5.根據權利要求2或3所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在干，按質量體積比計算，所述斜面培養基的成分為0. 5-1. 0%麥芽糖粉，0. 05-0. 10%干酵母粉，0. 05-0. 10%金槍魚膏，0. 06-0. 12%胰蛋白胨，0. 1-0. 5%氯化鈉，I. 8-2. 2%瓊脂，其余為水；所述分離培養中抗生素的含量為0. r0.7ug /mL，其余成分及含量與斜面培養基相同，上述斜面培養基和分離培養基均采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至6. 7±0. I。
6.根據權利要求5所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在干，c步驟所述抗生素是鏈霉素。
7.根據權利要求2或3所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在干，按質量體積比計算，d步驟所述種子培養基的成分為2. 5-4. 5%玉米粉，0. 2-0. 8%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%棉籽餅粉，I. 5-2. 5%輕質碳酸鈣，0. 15-0. 35%硫酸銨，0. 02-0. 05%硫酸亞鐵，0. 05-0. 25%磷酸ニ氫鉀，I. 5-3. 5%玉米漿，其余為水，該培養基采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節 pH 至 6. 7±0. I。
8.根據權利要求2或3所述恩拉霉素高產菌株的制備方法，其特征在干，按質量體積比計算，d步驟所述發酵培養基的成分為6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%輕質碳酸鈣，0. 2-0. 8%氯化鈉，0. 1-0. 5%硫酸銨，0. 003-0. 012%硫酸亞鐵，0. 007-0. 027%磷酸ニ氫鉀,0. 1-0. 5% 尿素，0. 005-0. 015% 氯化鋅，0. 05-0. 25% 氫氧化鉀，0. 07-0. 15% 玉米漿，.0.l-o. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高溫a -淀粉酶，其余為水，該培養基采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至5. 9±0. I。
9.權利要求I所述菌株在恩拉霉素生產中的應用。
10.根據權利要求9所述菌株在恩拉霉素生產中的應用，其特征在于，在28.0±0. 5°C，200^220 rpm條件下，將DCS067菌株在發酵培養基中發酵9_12天，制得含有恩拉霉素的發酵液；所述發酵培養基的成分為6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%輕質碳酸鈣，0. 2-0. 8% 氯化鈉，0. 1-0. 5% 硫酸銨，0. 003-0. 012% 硫酸亞鐵，0. 007-0. 027% 磷酸ニ氫鉀，0. 1-0. 5% 尿素，0. 005-0. 015% 氯化鋅，0. 05-0. 25% 氫氧化鉀，0. 07-0. 015% 玉米漿，0.l-o. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高溫a -淀粉酶，其余為水，該培養基采用質量百分含量為30%的NaOH水溶液調節pH至5. 9±0. I。
全文摘要
本發明公開了提供一種高產恩拉霉素的菌株，同時提供上述菌株的篩選方法，以及提供該菌株在恩拉霉素生產中的應用。本發明提供的恩拉霉素高產菌株DCS067保藏號是CGMCCNo.6220，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(CGMCC)，保藏日期是2012年6月14日。本發明所述DCS067菌株將恩拉霉素產率提高了47.80%。
文檔編號C12N1/20GK102864114SQ20121039913
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者王雪峰, 閆彩潔, 劉衛哲 申請人:河北圣雪大成制藥有限責任公司