一種低溫沼氣固體復合促進劑及其制備方法

專利名稱：一種低溫沼氣固體復合促進劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及農業微生物應用技術領域，具體說，涉及一種用于提高以牛羊糞及秸桿為原料在低溫條件下產沼氣水平的固體復合菌劑及其制備方法的技術領域。
背景技術：
沼氣屬于地面生物質可再生能源，一般含甲烷(CH 4) 60%_70%，二氧化碳(CO2) 25%-40%，H2S、N2、C0、H2等約占5%，主要是通過細菌發酵使植物秸桿和牲畜糞便的有機物還原成氣體；沼氣熱效率比較穩定，使用方便，其技術經濟性僅次于液化石油氣；沼氣的制備主要是通過細菌發酵使植物秸桿和牲畜糞便的有機物還原成氣體的厭氧發酵過程。但由于目前我國大面積推廣的戶用沼氣池幾乎全部采用的是常溫發酵模式，沼氣池的產氣情況受溫度變化的影響很大，而北方地區冬季普遍寒冷漫長，沼氣的生產存在產氣率低、使用率低、原料分解率低、沼氣使用綜合效益差等問題，甚至在冬季會出現凍裂沼氣池。有些地區冬季基本不產氣，沼氣池利用率50%，原料分解不到30%，沼氣使用每年只有3個月。這種狀況在一定程度上限制了北方地區沼氣的發展。使北方沼氣的普及和應用落后于南方地區，為此，在北方寒冷地區如何合理開發利用沼氣是一個亟待解決的問題。目前國內的戶用沼氣池一般是采取一些可提高沼氣池冬季產氣率和發揮綜合效益的越冬保溫增溫措施，主要包括一是日光溫室、養豬暖舍、廁所、沼氣池“四位一體”模式；二是北方一般采用挖防寒溝，溝內填發酵物的方式對農村戶用沼氣池進行保溫；三是調節發酵原料配比，改善微生物的食料結構；四是在使用管理方面做到勤出料、勤進料，每次進出料量要少，進料要適當添加一些熱性原料，如經過慪制的作物秸桿、牛糞、馬糞等，以提高發酵物濃度，采取以料補溫的方法對沼氣池料液升溫；以上這些措施雖有一些效果，但仍難以滿足需要，難以實現戶用沼氣池冬季正常產氣。今后通過為沼氣池提供水解微生物的優勢菌群，強化不產甲烷菌的代謝功能，是提高有機物分解利用率和沼氣產量的一項重要措施。現有技術表明，添加沼氣發酵促進劑在沼氣發酵中主要可以改善微生物營養狀況、加速新陳代謝、改變沼氣微生物占優勢的種類，使產甲烷絲狀菌屬iMethanothrix)過渡為活性更強的產甲燒八疊球菌屬(ifeiAafliosarcifla)；中國專利文件CN1888073 (200510077792. 3)公開了一種復合菌劑預處理秸桿的沼氣發酵方法，復合菌劑為高溫單胞菌、枯草芽孢桿菌、木霉菌和地衣芽孢桿菌，向潤濕后的秸桿加入復合菌劑和作為秸桿堆慪的氮源碳酸氫銨并補加水，用塑料布覆蓋堆慪，然后將堆慪好的秸桿入沼氣池，同時加入碳酸氫氨和產甲烷接種物，密閉2— 7天，即產沼氣；預處理后的秸桿發酵速度和產氣速度快，使初始產氣時間縮短，產氣率提高30%左右，能使所有玉米秸桿、稻草、麥桿等農作物秸桿作為沼氣發酵的原料，適用范圍廣泛。該方法的局限性在于，一是側重于分解秸桿不能解決用戶沼氣池冬季產沼氣問題；二是該復合菌劑只能在預處理秸桿時使用，不能直接投入沼氣池內促沼氣生成，使用方法麻煩，限制了其推廣。經國內專利檢索，尚未見有適用沼氣低溫發酵微生物菌劑及推廣應用的相關產品的報道。

發明內容
針對現有技術 中側重于分解秸桿不能解決用戶沼氣池冬季產沼氣問題，在冬季復合菌劑只能在預處理秸桿時使用，不能直接投入沼氣池內促沼氣生成的現有技術現狀；本發明目的在于提供一種用于低溫沼氣生產中適用的高效固體復合微生物菌劑及其制備方法，解決了沼氣池冬季產沼氣問題，并且能夠在冬季里直接投入沼氣池內促沼氣生成。本發明的主要技術方案選用短小芽孢桿菌(ifeci77i/5· pumilus) CICC10440、乳酸鏈球菌 iStreptococcus lactis) CICC 20711、假單胞菌 iPseudomorms sp. ) CGMCCNo. 4764和成團泛菌agglomerans) CGMCC No. 4765,分別通過純化復壯，并獲得新鮮的純培養發酵液，按質量比1:1:1:1比例混勻，將混合液再與等質量的豆柏和麩皮混合拌勻，豆柏和麩皮按重量比1:1混合，將上述混合物攤放于陰涼干燥環境中陰干，然后添加6%-36%的三氯化鐵和I. 2%-7. 2%的氯化鎳充分拌勻，制備獲得低溫沼氣固體復合促進劑。將上述混合物攤放于陰涼干燥環境中陰干，制成固體復合菌劑，稱重后常溫保存。本發明具體提供一種低溫沼氣固體復合促進劑，通過選用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) CICC10440、乳酸鏈球菌(SirepiococcWs lactis) CICC 20711、假單胞菌sp. ) CGMCC No. 4764 和成團泛菌agglomerans ) CGMCCNo. 4765，分別通過純化復壯，并獲得新鮮的純培養發酵液，將上述四種菌的純培養發酵液按質量比1:1:1:1比例混勻，將混合液再與等質量的豆柏和麩皮混合拌勻，豆柏和麩皮按重量比I :1混合，將上述混合物攤放于陰涼干燥環境中陰干，然后添加6%-36%的三氯化鐵和I. 2%-7. 2%的氯化鎳充分拌勻，制備獲得低溫沼氣固體復合促進劑。本發明采用購自中國工業微生物保藏管理中心的短小芽孢桿菌{Bacilluspumilus) 10440和乳酸鏈球菌Iactis) 20711,本領域技術人員可以通過公眾途徑獲得。本發明米用的假單胞菌sp. )CGMCC No. 4764。通過從羊糞沼氣發酵反應器中進行微生物菌種的培養、分離與篩選，獲得一批細菌，并從中分離篩選出一株產表面活性劑較高的菌株，編號為Rl，菌落呈擴散狀生長，半透明，最佳生長溫度28°C，短桿狀，革蘭氏染色陰性；可在添加1%甲醇的培養基上生長。經形態、微生物學分類和16S rDNA特征序列分析鑒定，屬于假單胞菌(Pseudomonas sp·、。通過對菌株發酵條件及酶學特性進行研究，結果表明R1菌株的最佳生長培養基為PR培養基，在28°C，150rpm,培養48h，其能夠產生一種生物表面活性劑。參照《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》(ABergey，s Manual ofSystematic Bacterio-logy)))第九版和《常用細菌系統鑒定手冊》等對菌株進行形態學測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定編號為Rl菌株為假單胞菌中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏號是CGMCC No. 4764。經過16SrRNA同源分析、系統發育分析和細胞脂肪酸組分分析結果都表明，編號為Rl的菌株為假單胞菌(.Pseudomonas sp.),以下簡稱假單胞菌sp. ) CGMCC No. 4764ο
同時，本發明米用的成團泛菌(/Iaflioea agglomerans) CGMCC No. 4765。通過從羊糞沼氣發酵反應器中進行微生物菌種的培養、分離與篩選，獲得一批細菌，并從中分離篩選出一株產2，3 丁二醇較高的菌株，編號為R4，菌落呈邊緣整齊，表面較濕潤；革蘭氏陽性菌，短桿狀，無芽孢，無莢膜；最佳生長溫度28°C，檸檬酸鹽利用試驗、明膠水解試驗、油脂水解、淀粉水解，尿素酶試驗、硫化氫的產生試驗、硝酸鹽和亞硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗結果均為陰性；已酰甲基甲醇(V-P)試驗陽性；利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，乳糖產酸，利用淀粉產堿。經形態、微生物學分類和16S rDNA特征序列分析鑒定，屬于成團泛菌agglomerans).經搖瓶發酵條件優化試驗研究。結果表明R4菌株的最佳生長培養基為R4F培養基，28°C，150rpm，培養48h，其能夠產生一種生物表面活性劑。參照《伯杰氏系統細菌學鑒定手冊》iiBergey，s Manual of Systematic ifecierio-Jo#》)第九版和《常用細菌系統鑒定手冊》等對菌株進行形態學測定，生理生化檢測、G+C含量測定，確定編號為R4菌株為成團泛菌中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年04月14日，保藏號是CGMCC No. 4765。經過16SrRNA同源分析、系統發育分析和細胞脂肪酸組分分析結果都表明，編號為R4菌株為成團泛菌(Fantoea agglomerans),以下簡稱成團泛菌(Pantoea agglomerans ) CGMCC No. 4765。本發明提供的上述低溫沼氣固體復合促進劑可直接應用于沼氣池；料液溫度保持在大于15°C，以牛羊糞便為主要原料的沼氣池，比不加菌劑的提高30%-50%以上。本領域熟知，沼氣發酵的生物學過程由多菌種聯合作用，可分為三個階段，即水解階段、產酸階段、產氣階段。通過實施本發明具體的發明內容，可以達到以下有益效果
本發明提供的低溫沼氣固體復合促進劑的使用方法簡單，而且使用具有長效性；由于沼氣池常年可以使用，每戶每年平均可節省幾個月的生活用煤；本發明對加該低溫沼氣固體復合促進劑后的沼渣測定結果表明，沼渣中氮、磷、鉀及有機質含量都比較高，是一種很好的有機肥料，特別是對纖維素類農作物秸桿分解的微生物菌劑的制備；以及利用此低溫沼氣固體復合促進劑作為接種菌劑，提供對農作物秸桿進行分解處理，加快發酵產沼氣的應用方法；同時也可以用于對其它有機固體廢物進行生物處理產沼氣。料液溫度保持在大于15°C，以牛羊糞便為主要原料的沼氣池，比不加菌劑的提高30%-50% 以上。


圖I顯示為5L柱羊糞沼氣低溫產氣實驗結果圖。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中涉及到的主要原輔材料和設備有
主要試劑牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、牛肉膏、蔗糖、Na2HP04、NaCL, MgS04 · 7H20、K2HP04、FeS047H20、MnSO4 · H2O, NaNO30
主要儀器5升及10升發酵系統、搖床、PCR擴增儀、冷凍離心機、顯微鏡、生化培養箱、分析天平、超凈工作臺。本發明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。實施例一低溫沼氣固體復合促進劑的制備
本發明用于低溫沼氣固體復合促進劑的制備方法，包括以下步驟
(I)選取短小芽孢桿菌CICC10440、乳酸鏈球菌CICC20711、假單胞菌sp. )CGMCC No. 4764 和成團泛菌 CPaflioea agglomerans )CGMCC No. 4765,分別純化復壯，并獲得新鮮的純培養發酵液。
(2)將步驟(I)四種純培養發酵液按質量比1:1:1:1比例混勻，制成液體復合微生物菌劑。(3)將步驟(2)液體復合菌劑與等質量的豆柏和麩皮混合拌勻，豆柏和麩皮按重量比I :1混合。(4)將步驟(3)制備的混合物攤放于陰涼干燥環境中陰干。(5)將6%_36%的三氯化鐵和I. 2%_7. 2%的氯化鎳充分混合于(4)中制備獲得低溫沼氣固體復合促進劑。(6)將步驟(5)低溫沼氣固體復合促進劑稱重后常溫保存。本發明選取的短小芽孢桿菌CICC10440、乳酸鏈球菌CICC20711、假單胞菌(.Pseudomonas sp. )CGMCC No. 4764 和成團泛菌 CPaflioea agglomerans)CGMCC No. 4765 分別純化復壯，并獲得新鮮的純培養發酵液；將上述四種菌的純化復壯獲得純培養發酵液過程中的工藝及培養條件采用本領域常見培養方法獲得。實施例二 用于沼氣低溫發酵的固體復合菌劑的制備
將短小芽孢桿菌CICC10440、乳酸鏈球菌CICC20711、假單胞菌sp.)CGMCC No. 4764和成團泛菌CPaflioea agglomerans)CGMCC No. 4765四種菌的原始斜面菌株為出發，分別于LB平板上劃線分離得單菌落，挑取健壯典型的單菌落轉接斜面復壯，分別活化斜面轉接液體搖瓶，于30度200轉培養24小時，在10升全自動發酵罐中裝料7升，滅菌后接種液體搖瓶，48小時后鏡檢無污染，下罐，得7升菌液；同法獲得另外兩株菌的菌液，混合共計28升，稱取28千克豆柏和麩皮于場地中間制堆，豆柏和麩皮按各14千克混合，一邊淋撒上述混合液一邊拌料，直至混合液被均勻充分吸收，攤開，每天翻料一次，15天后完全干透，稱取1680克-10080克的三氯化鐵和336g-2016克的氯化鎳研碎后充分混勻于上述混合物中，稱重包裝，于低溫干燥條件下保存，備用。短小芽孢桿菌CICC10440采用蛋白胨5克牛肉膏3克，氯化鈉5克瓊脂15克，蒸餾水1000毫升作為培養基，調pH至7.0，培養芽孢桿菌時，加入5mg MnSO4. H2O則
有利于產生芽孢。乳酸鏈球菌CICC20711采用酪蛋白胨lO.Og，牛肉膏lO.Og，酵母粉5. 0g，葡萄糖 5. 0g，乙酸鈉 5. 0g，檸檬酸二胺 2. 0g, Tween 80 I. 0g, K2HPO4 2. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 2g,MnSO4 · H2O 0. 05g, CaCO3 20. Og,瓊脂 15. Og,蒸餾水 I. OL 作為培養基，ρΗ6· 8。假單胞菌(Aeoi/offioaas sp. ) CGMCC No. 4764采用LB液體培養基培養24小時制備菌種，取菌種200毫升接種至10升PR培養基中；發酵溫度為28°C，并用NH4OH 28%溶液將pH恒定調節至6-8，優選6.8 ;攪拌速率為400 rpm，通氣量設定為O. 4 (V/V);當生物量的濃度達到10g/L-40g/L時停上發酵。成團泛菌iPantoea agglomerans)CGMCC No. 4765 米用 R4F 液體培養基培養 24 小時制備菌種，取菌種250毫升接種至10升R4F培養基中；發酵溫度為28°C，并用NH4OH 28%溶液將pH恒定調節至6-8，優選7.0 ;攪拌速率為100 rpm，通氣量設定為0.2 (V/V);當生物量的濃度達到10g/L-30g/L時停上發酵。R4F培養基每IOOOmL蒸餾水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；O. 05克MgS04 · 7H20 ；0. 5 克 K2HP04 ；0. 05 克 FeSO4 · 7H20 ；0. 05 克 MnSO4 · H2O ；20 克蔗糖；18-20
克瓊脂粉。
實施例三低溫沼氣固體復合促進劑應用于5升沼氣發酵
稱取I. 5千克粉末狀羊糞，投入5升沼氣發酵裝置，加水3. 5升，混勻，密封，溫度在IO0C _25°C條件下，七天后開始收集產氣，于100天后產氣量開始下降時，投加2. 5克上述實施例低溫沼氣固體復合促進劑，混勻，繼續檢測產氣量，同時設空白對照組；產氣變化情況參見附圖I所示。稱取I. 5千克粉末狀羊糞，投入5升沼氣發酵裝置，加水3. 5升，混勻，密封，七天后開始收集產氣，于100天后產氣量開始下降時，投加2. 5克上述固體復合菌劑，混勻，繼續檢測產氣量，同時設空白對照組。產氣變化情況如附圖I所示。實施例四低溫沼氣固體復合促進劑應用于10方沼氣發酵
冬季15°C -20°C氣溫條件下，沼氣池溫度于IOm3農戶家用水壓式沼氣池現場，以采用上述實施例獲得的低溫沼氣固體復合促進劑5千克，用10公斤溫水復溶攪勻，從進料口投加入池，再由出料口取出50公斤發酵液從進料口沖入池內，將發酵液攪勻，其他維護管理如常，記錄投加復合菌劑之后3個月的出氣量累計5. 4-7. 2方，相比以往3個月平均值I. 8方-3. 2方，產氣量提高了 40%以上。
權利要求
1.一種低溫沼氣固體復合促進劑的制備方法，其特征在于，制備方法包括以下步驟通過選用短小芽抱桿菌{Bacillus pumilus) CICC10440、乳酸鏈球菌(StrepiococciAslactis) CICC 20711、假單胞菌(/>51<9"￡/6_9/ <35· sp. ) CGMCC No. 4764 和成團泛菌agglomerans) CGMCC No. 4765，分別通過純化復壯,并獲得新鮮的純培養發酵液，將上述四種菌的純培養發酵液按質量比1:1:1:1比例混勻，將混合液再與等質量的豆柏和麩皮混合拌勻，豆柏和麩皮按重量比I :1混合，將上述混合物攤放于陰涼干燥環境中陰干，然后添加6%-36%的三氯化鐵和I. 2%-7. 2%的氯化鎳充分拌勻，制備獲得低溫沼氣固體復合促進劑。
2.如權利要求I所述低溫沼氣固體復合促進劑的制備方法，其特征在于， 所述的短小芽孢桿菌CICC10440采用蛋白胨5克牛肉膏3克，氯化鈉5克瓊脂15克，蒸餾水1000毫升作為培養基，調pH至7. O,培養芽孢桿菌時，加入5mg MnSO4. H2O ； 所述的乳酸鏈球菌CICC20711采用酪蛋白胨lO.Og，牛肉膏lO.Og，酵母粉5. Og，葡萄糖 5. Og,乙酸鈉 5. 0g，檸檬酸二胺 2. 0g, Tween 80 I. 0g, K2HPO4 2. 0g, MgSO4 · 7H200.2g，MnSO4 · H2O 0. 05g, CaCO3 20. Og,瓊脂 15. Og,蒸餾水 I. OL 作為培養基，ρΗ6· 8 ； 所述的假單胞菌(AeuiZoffioaas sp. ) CGMCC No. 4764采用LB液體培養基培養24小時制備菌種，取菌種200毫升接種至10升PR培養基中；發酵溫度為28°C，并用NH4OH 28%溶液將PH恒定調節至6-8，優選6. 8 ;攪拌速率為400 rpm，通氣量設定為0. 4 (V/V);當生物量的濃度達到10g/L-40g/L時停上發酵； 所述的成團泛菌iPantoea agglomerans)CGMCC No. 4765米用R4F液體培養基培養24小時制備菌種，取菌種250毫升接種至10升R4F培養基中；發酵溫度為28°C，并用NH4OH28%溶液將pH恒定調節至6-8，優選7. O ;攪拌速率為100 rpm,通氣量設定為0. 2 (V/V)；當生物量的濃度達到10g/L-30g/L時停上發酵。
3.如權利要求2所述低溫沼氣固體復合促進劑的制備方法，其特征在于，所述的R4F培養基每IOOOmL蒸餾水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；0. 05克MgS04 ·7Η20 ;0.5克1(2冊04 ；0.05 克 FeSO4 · 7Η20 ；0. 05 克 MnSO4 · H2O ；20 克蔗糖；18-20 克瓊脂粉。
4.如權利要求I至3任意一項所述制備方法獲得低溫沼氣固體復合促進劑。
5.如權利要求4所述的固體復合促進劑在冬季沼氣池中應用。
全文摘要
本發明公開一種低溫沼氣固體復合促進劑及其制備方法，選用短小芽孢桿菌CICC10440、乳酸鏈球菌CICC20711、假單胞菌(Pseudomonassp.)CGMCCNo.4764和成團泛菌(Pantoeaagglomerans)CGMCCNo.4765,分別通過純化復壯，并獲得新鮮的純培養發酵液按質量比1:1:1:1比例混勻，將混合液再與等質量的豆粕和麩皮混合拌勻,豆粕和麩皮按重量比11混合,將上述混合物攤放于陰涼干燥環境中陰干，然后添加6%-36%的三氯化鐵和1.2%-7.2%的氯化鎳充分拌勻，制備獲得低溫沼氣固體復合促進劑，適合低溫沼氣應用，具有廣泛的應用價值。
文檔編號C12N1/20GK102876618SQ20121040378
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者陳競, 馮蕾, 楊新平, 馬彩雯, 史慧鋒, 唐嫻, 秦新政, 王國強 申請人:新疆農業科學院微生物應用研究所