專利名稱：鹿豬牛羊馬驢兔雞的pcr鑒定用引物體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的PCR鑒定用引物體系及PCR鑒定方法，適用于上述八種動物血液制品的快速檢測及鑒定，尤其適用于鹿血液制品的快速防偽鑒定。
背景技術：
鹿血為鹿科動物的血液，據《本草綱目》記載“鹿血大補虛損，益精血,解痘毒、藥毒”。鹿血作為傳統的珍貴中藥材具有不可替代性，其藥用價值一直以來得到廣泛認可和深入開發，產品系列不斷豐富，包括鹿血酒、鮮鹿血、鹿血晶等，所產生的市場價值和需求十分巨大。在經濟利益的驅使下，不法分子常常會利用其它常見動物血液假冒鹿血，或在鹿血產品中摻入其他常見動物血以次充好來降低成分，常用的動物血液為豬、牛、羊、馬、驢、兔和 雞的血液。但目前鹿血的品質檢測一直沒有很好的手段，傳統目測及理化分析方法無法有效地判別這些性質十分相似的血液樣品。為了確保鹿血的真實度和純度，從源頭上控制鹿血的品質，開發用于鑒別常見物種血液樣品的簡便快速的現代分子生物學檢測技術具有迫切性和必要性。聚合酶鏈式反應(PCR)技術具有響應快速、靈敏度高且特異性好的優點，是當前應用最廣的先進分子生物學技術，該技術利用特異的引物可以從微量樣品中擴增出相應特定的DNA片段，達到放大核酸信號的目的。同時，PCR具有非常高的反應特異性，可以區分少至幾個核苷酸堿基的差異，因此PCR技術在診斷性檢測領域得到廣泛深入的應用。由于在進化過程中不同物種的遺傳物質DNA存在序列上的保守性和多變性，尤其在物種內部具有較高的保守性，而物種之間存在較大的差異性。利用PCR技術上述的高度靈敏性和特異性，可以區分不同物種材料，尤其是具有較高經濟價值的產品。而線粒體DNA相對基因組DNA具有更高的突變率和遺傳多變性，因此線粒體DNA序列的差異常用于不同物種及物種內部的進化分析及診斷檢測。目前國內外針對上述報道的文獻較少，且大多是針對少量物種進行的。如Dalmasso A等人為抑制瘋牛病傳播，防止在其他產品中摻入牛制品，利用多元PCR技術鑒定飼料中動物成分，使用了四對引物分別針對反芻動物、家禽、魚和豬，引物設計時針對的基因為12S rRNA, tRNA Val 及 16S rRNA (Dalmasso A, Fontanella E, Piatti P,Civera Tj Rosati S， Bottero MT， A multiplex PCR assay for the identification ofanimal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes, 2004，18: 81-87. )。Ghovvati，s.等人為鑒定工廠肉制品中是否摻假，防止伊斯蘭教食品中摻入豬肉制品，設計了分別針對反芻動物、家禽及豬的三對引物，引物設計時針對的基因為12S rRNA及16S rRNA(Ghovvati, S. , M. R. Nassirij S. Z. Mirhoseinij A. H. Moussavij A. JavadmanesjFraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay. FoodControl, 2009，20:696-699.)。又如Dai-Ming Zha等人為檢測鹿產品中的摻假情況，設計了四對分別針對牛、羊、家禽和豬的引物，引物設計時針對的基因為tRNA Val和16SrRNA (Dai-Ming Zha, Xiu-Mei Xing, Fu-He Yang, A multiplex PCR assay for fraudidentification of deer products, Food Control, 2010，21:1402-1407.)。但上述方案并未設計針對鹿的引物，因此雖然能測定樣品中是否含有這四類物質，但不能確定是否是
曲女口庇廣口口。由以上具有代表性的研究結果可以看出，這些檢測存在下列不足(1)檢測范圍窄，一次只能檢測少量物種，基本不會大于四個。這是由于在同一個總DNA模板體系中，弓丨物對的數量越多，引物對與總DNA模板之間的相互干擾越嚴重，PCR反應的特異性也越不能保證；(2)沒有建立對大量常見物種的快速且特異性高的引物體系及檢測方法，這也會造成漏檢現象。
發明內容
為了克服上述現有技術中存在的不足，本發明提供了一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系，該引物體系及用該引物體系進行的鑒定方法可快速且特異性高的檢測鹿豬牛羊馬驢兔雞血液制品的真偽及其是否有摻假，尤其適用于鹿血產品鑒定與檢測，其對常見物種的檢測覆蓋面廣泛。
本發明為了解決其技術問題所采用的技術方案是一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系，由下列引物對組成(I)對鹿12S rRNA基因進行擴增生成鹿特異性擴增片段的引物對I :正向引物5’ -GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3 ’反向引物5’ -AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3，；(2)對豬12S rRNA基因進行擴增生成豬特異性擴增片段的引物對II 正向引物5’ -AGCACACCTATAACGGTAGCTCA-3 ’反向引物5’ -CCTAGCTATCGTGTGTCAGGATT-3，；(3)對牛Cytb基因進行擴增生成牛特異性擴增片段的引物對III 正向引物5’ -CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3 ’反向引物5’ -GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3 ’ ；(4)對羊Cytb基因進行擴增生成羊特異性擴增片段的引物對IV 正向引物5’ -CGCCATGCTACTAATTCTTGTTCT-3 ’反向引物5’-TGGAGGAAGGGTACAAGTACTAAG-3’ ；(5)對馬基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對組合，該引物對組合由對馬Cytb基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對V和對馬12S rRNA基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對VI組成引物對V :正向引物5’ -CACAGCCCTGGTAGTCGTACA-3 ’反向引物5’-TGTCCGCCGATTCATGTTAGT-3’ ；引物對VI:正向引物5’ -CGTGTCAAAGACTAATACCAA-3 ’反向引物5’-AGCTATCGTGTAGTCAGAGGTA-3’ ；(6)對驢16S rRNA基因進行擴增生成驢特異性擴增片段的引物對VII
正向引物5’ -TTCAAGCTCAACGTCACACATA-3 ’反向引物5，-TGTGTTGGGTTAACAATAGTCT-3，；(7)對兔12S rRNA基因進行擴增生成兔特異性擴增片段的引物對VDI 正向引物5，-GCGTAAAGCGTGATTAGAATAAAC-3’反向引物5’-TAGCTATCGTGAGTTCGAAGAGT-3’ ；(8)對雞12S rRNA基因進行擴增生成雞特異性擴增片段的引物對IX 正向引物5’ -ATCCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3 ’反向引物5’ -CTATTGAGCTCACTGTTGTTCTTT-3，。 本發明通過分析鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞八種動物線粒體DNA中的遺傳不保守區域基因(包括12S rRNA、16S rRNA和Cytb)，進行序列測定及比對后，根據各序列上的特異堿基位點分別設計了各物種的特異性PCR引物對，其僅對相應的物種總DNA模板有擴增信號，對其他物種沒有目的擴增信號，因此能夠快速準確的對各物種進行定性檢測。本發明的引物對均可通過利用本領域技術人員公知的化學合成方法進行DNA合成技術來獲得。本發明還提供了一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定方法為，以樣品總DNA為模板，利用所述引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、由引物對V和引物對VI組成的弓I物對組合、引物對νπ、引物對珊和引物對IX分別進行PCR擴增實驗，反應結束后根據瓊脂糖凝膠電泳判定結果；所述樣品總DNA模板來自鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞物種血液的混合，或上述各物種血液產品中的一種。所述PCR擴增實驗中的特定PCR反應體系包括下列組分雙蒸水3體積份、10XPCR反應緩沖液I體積份、2. 5mM each的dNTPs O. 8體積份、2. 5υ/μ1的Taq酶O. 2體積份、經稀釋500倍的總DNA模板I體積份、 μΜ正向引物2體積份和 μΜ反向引物2體積份。其最優組分為雙蒸水3μ1、10 XPCR反應緩沖液Ιμ1、2. 5mM each的dNTPs O. 8μ1、2. 5U/μ 的Taq酶O. 2μ1、經稀釋500倍的總DNA模板 μ 、 μΜ正向引物2μ1和 μΜ反向引物2μ1，共計10μ1。所述PCR擴增實驗中特定PCR反應程序為依次進行94°C下預變性5min，94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸45s，進行35次循環，72°C下延伸lOmin，最后在4°C下保持Imin后結束。本發明所述鑒定方法中進行瓊脂糖凝膠電泳結束后判定結果時，判定依據為所述引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、由引物對V和引物對VI組成的引物對組合、引物對νπ、引物對珊和引物對IX分別擴增出的DNA片段大小；其中鹿物種的引物對I擴增出的DNA片段大小為376bp ；豬物種的引物對II擴增出的DNA片段大小為300bp ；牛物種的引物對III擴增出的DNA片段大小為360bp ；羊物種的引物對IV擴增出的DNA片段大小為231bp ；馬物種的由引物對V和引物對VI組成的弓丨物對組合擴增出的DNA片段大小為分別對應為456bp和115bp ；驢物種的引物對YD擴增出的DNA片段大小為232bp ；兔物種的引物對VDI擴增出的DNA片段大小為126bp ；雞物種的引物對IX擴增出的DNA片段大小為299bp。
本發明還提供了一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用試劑盒，包括所述引物對I、引物對II、引物對III、弓I物對IV、由引物對V和引物對VI組成的弓I物對組合、弓I物對νπ、引物對VDI和引物對IX。可以將本發明所述引物體系以及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。其中所述相關試劑可以為本發明中所述的特定PCR反應體系中除了總DNA模板以外的其他試劑；也可以為其他適用的除樣品總DNA模板外的試劑，如用于PCR反應的一些常規試齊U，或由本領域技術人員經有限次實驗得到的常規試劑的組合物等。此外本發明試劑盒中還包括有實施本發明所需的基本用具。本發明試劑盒可以是由多個隔斷所形成，用以容納固定一個或多個如管或小瓶類的容器。這些容器中可以分別裝有本發明中各物種的弓I物對，也可以將各物種的弓I物對按照一定比例混合成引物對混合物后裝于其中，根據實際需要各物種的引物對或引物對混合物可以是凍干形式或者溶于前述相關試劑中的狀態。本發明所述試劑盒用于單物種總DNA模板進行鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的物種鑒定。且所述試劑盒用于多物種混合總DNA模板進行鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的物種 鑒定。所述試劑盒尤其適用于鹿血液產品的真偽及摻假判定。本發明的有益技術效果是通過使用本發明的引物體系，可以一次性檢測多達八個動物物種，達到對常見動物物種基本覆蓋的目的；并且本發明的引物均僅對各自物種的目標片段進行特異性擴增，不會擴增到其它區域且不會與其他物種起反應，因此也能適用于一次PCR反應中導入兩種或兩種以上引物對的多重PCR反應，從而能有效的縮短實驗時間；此外在進行PCR反應時，使用優化的特定PCR反應體系及反應程序，采用統一的PCR檢測方法，簡化了檢測流程，建立了快速高效且特異性高的鑒定方式，從而有效的鑒定鹿血制品的真偽及摻假情況，為鹿血的質量控制提供了現代分子生物學的檢測手段；此外該引物體系還能配合相關試劑制成試劑盒，方便使用，同時為工業化生產及應用提供了可能，其應用前景極好。
圖I是本發明所述八種動物血液提取出的總DNA模板的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2是以本發明所述鹿12S rRNA基因的引物對I作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3是以本發明所述豬12S rRNA基因的引物對II作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4是以本發明所述牛Cytb基因的引物對III作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5是以本發明所述羊Cytb基因的引物對IV作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖6是以本發明所述馬的兩對特異性引物，即馬Cytb基因的特異性引物對V和馬12S rRNA基因的特異性引物對VI共同作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖7是以本發明所述驢16S rRNA基因的引物對VII作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖8是以本發明所述兔12S rRNA基因的引物對VDI作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖9是以本發明所述雞12S rRNA基因的引物對IX作為引物進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；圖10是以本發明所述各物種總DNA樣品按同體積混合后的混合總DNA樣品為模板，使用各物種特異性引物分別與此混合總DNA模板進行PCR擴增所得瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M代表標準核算分子量標簽，圖I中該標簽自上向下依次為2kb、lkb、750bp、500bp、250bp和IOObp ;圖2至圖10中該標簽自上向下依次為500bp、400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、IOObp和50bp ;其中圖I至圖10中編號I 8依次代表鹿、豬、牛 、羊、
馬、驢、兔和雞。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。一、各物種特異性引物的設計針對進化上較不保守的線粒體DNA，利用美國國立生物技術信息中心(NCBI)核酸序列數據庫，對鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞八個常見物種進行DNA序列測定及比對分析，篩選出遺傳多變的特定目標區域，包括12S rRNA、16S rRNA和Cytb 3個基因，針對上述基因各序列上的特異性堿基位點分別設計了各物種的特異性PCR引物對，并經NCBI BLAST數據庫進行在線比對，進一步確認引物的物種特異性，用于PCR擴增目的片段。各引物如下所述對鹿12S rRNA基因進行擴增生成鹿特異性擴增片段的引物對I :正向引物5’-GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3’ (SEQ ID NO. I)反向引物5’-AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3’ (SEQ ID NO. 2)；對豬12S rRNA基因進行擴增生成豬特異性擴增片段的引物對II 正向引物5’-AGCACACCTATAACGGTAGCTCA-3’ (SEQ ID NO. 3)反向引物5’-CCTAGCTATCGTGTGTCAGGATT-3’ (SEQ ID NO. 4)；對牛Cytb基因進行擴增生成牛特異性擴增片段的引物對III 正向引物5’-CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3’ (SEQ ID NO. 5)反向引物5’-GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3’ (SEQ ID NO. 6)；對羊Cytb基因進行擴增生成羊特異性擴增片段的引物對IV 正向引物5’-CGCCATGCTACTAATTCTTGTTCT-3’ (SEQ ID NO. 7)反向引物5，-TGGAGGAAGGGTACAAGTACTAAG-3’(SEQ ID NO. 8)；對馬基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對組合，該引物對組合由對馬Cytb基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對V和對馬12S rRNA基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對VI組成引物對V :正向引物5，-CACAGCCCTGGTAGTCGTACA-3’(SEQ ID NO. 9)反向引物5’-TGTCCGCCGATTCATGTTAGT-3’ (SEQ ID NO. 10)；引物對VI:
正向引物5’-CGTGTCAAAGACTAATACCAA-3’ (SEQ ID NO. 11)反向引物5’-AGCTATCGTGTAGTCAGAGGTA-3’ (SEQ ID NO. 12)；對驢16S rRNA基因進行擴增生成驢特異性擴增片段的引物對YD 正向引物5’-TTCAAGCTCAACGTCACACATA-3’ (SEQ ID NO. 13)反向引物5’-TGTGTTGGGTTAACAATAGTCT-3，(SEQ ID NO. 14)；對兔12S rRNA基因進行擴增生成兔特異性擴增片段的引物對VDI 正向引物5’-GCGTAAAGCGTGATTAGAATAAAC-3，(SEQ ID NO. 15)反向引物5’-TAGCTATCGTGAGTTCGAAGAGT-3’ (SEQ ID NO. 16)；·
對雞12S rRNA基因進行擴增生成雞特異性擴增片段的引物對IX 正向引物5’-ATCCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3’ (SEQ ID NO. 17)反向引物5’-CTATTGAGCTCACTGTTGTTCTTT-3’ (SEQ ID NO. 18)。二、各物種血液總DNA的抽提上述八種動物的血液采集于健康動物活體，使用抗凝試管分裝(lml/管)，凍存于一 80°C，進行血液總DNA抽提前放至室溫。各動物物種血液總DNA(其中包括線粒體DNA)的抽提均采用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini and Blood Mini試劑盒進行，其抽提步驟如下所述(I)吸取20μ1蛋白酶(Protease)至I. 5ml離心管底部；(2)加入200μ1所采集的上述八種動物血液樣品中的一種，輕柔吹打混勻；加入200μ1 AL緩沖液，點震混勻15s ；(3)在56°C溫育10分鐘后，進行短暫離心；(4)加入200 μ 無水乙醇后點震混勻15s，然后進行短暫離心，得到混合液；(5)預先將微量旋轉柱(Mini spin column)置于2ml收集管上,然后將(4)中所得混合液移入Mini spin column,然后在12000r/min下離心lmin,離心結束將Mini spincolumn置于一個新的2ml收集管之上；(6)打開Mini spin column的蓋子，加入500 μ AWl的緩沖液，然后在12000r/min下離心Imin后,將Mini spin column置于一個新的2ml收集管上；(7)打開 Mini spin column 的蓋子,加入 500 μ AW2 緩沖液后在 16000r/min 下離心Imin ；(8)將Mini spin column置于一個剪去蓋子的新I. 5ml收集管上，于16000r/min下離心2min ;然后將Mini spin column再次置于一個剪去蓋子的新I. 5ml收集管上,加入200μ1 AE緩沖液，室溫靜置Imin后，于12000r/min下離心Imin ;最后將洗脫下來的總DNA樣品凍存于-20°C。由上述步驟抽提所得各動物物種的總DNA是否能用于進一步的擴增實驗，需要通過瓊脂糖凝膠電泳實驗進行判定，若得到染色清晰的條帶，則說明抽提所得總DNA可用于進一步的擴增實驗。本發明中將抽提所得的各物種總DNA樣品進行Iwt. %瓊脂糖凝膠電泳實驗，并在凝膠中加入溴化乙錠(EB)進行染色。采用120V電泳40分鐘，當溴酚藍條帶遷移至凝膠邊緣時停止電泳，則凝膠成像。其中各加樣孔上樣量為20μ1。所得結果如圖I所示。由圖I可以看出，本發明所述各動物血液抽提所得的總DNA樣品經電泳染色后，得到非常清晰的條帶，并無彌散不清的情況，說明樣品線粒體DNA完整無降解，質量很好可用于進一步的PCR實驗。三、各物種特異性引物對進行PCR實驗采用步驟一中合成所得各動物物種的特異性引物對進行PCR實驗，所選用的總DNA模板可以為步驟二中各動物物種的總DNA樣品，也可以為將步驟二中所得各動物物種總DNA樣品按一定比例混合后的混合總DNA樣品。在本發明中，針對所述各物種總DNA樣品和混合總DNA樣品均在同樣的PCR反應系統和同樣的PCR反應程序下進行。具體如下所述。實施方式一以所述各物種總DNA樣品為總DNA模板(I)各物種總DNA樣品的處理將所述八種動物的總DNA樣品各取 μ 后稀釋500倍，作為總DNA模板，并將引物稀釋至lMmol/L ； (2)反應體系的配制在PCR薄壁管中加入如下各反應組分，反應體系10μ1/管。雙蒸水3Pl、10XPCR 反應緩沖液 μ1、2. 5mM each 的 dNTPs O. 8μ1、2· 5υ/μ1 的 Taq酶O. 2μ1、(I)中所述總DNA模板 μ1、 μΜ正向引物2μ1和 μΜ反向引物2μ1 ;其中Taq酶為常規Taq酶(參見Tiangen公司的Taq酶說明書)。(3) PCR反應程序的制定依次進行94°C下預變性5min，94°C變性45s，56°C退火45s，72 °C延伸45s，進行35次循環，72°C下延伸lOmin，最后在4°C下保持Imin后結束，得PCR反應產物。(4)2wt. %瓊脂糖凝膠電泳將(3)中所得PCR反應產物進行2wt. %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入溴化乙錠(EB)進行染色，然后再120V下電泳40分鐘，當溴酚藍條帶遷移至凝膠邊緣時停止電泳，則凝膠成像。所得凝膠成像結果如圖2至圖9所示。其中圖2是分別采用八種動物的總DNA模板，以鹿12S rRNA基因的引物對I作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示鹿物種特異引物對I僅對鹿血總DNA模板特異擴增出376bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。圖3是分別采用八種動物的總DNA模板，以豬12S rRNA基因的引物對II作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示豬物種特異引物對II僅對豬血總DNA模板特異擴增出300bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。圖4是分別采用八種動物的總DNA模板，以牛Cytb基因的引物對III作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示牛物種特異引物對III僅對牛血總DNA模板特異擴增出360bp大小的條帶,而其它物種DNA模板無擴增。圖5是分別采用八種動物的總DNA模板，以羊Cytb基因的引物對IV作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示羊物種特異引物對IV僅對羊血總DNA模板特異擴增出23Ibp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。圖6是分別采用八種動物的總DNA模板，以馬的兩對特異性引物，即馬Cytb基因的特異性引物對V和馬12S rRNA基因的特異性引物對VI共同作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示上述兩對馬物種的特異性引物僅對馬血總DNA模板特異擴增出了456bp和115bp大小的兩個條帶,而對其他物種DNA模板無擴增。圖7是分別采用八種動物的總DNA模板，以驢16S rRNA基因的引物對VII作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示驢物種特異引物對VII僅對驢血總DNA模板特異擴增出232bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。圖8是分別采用八種動物的總DNA模板，以兔12S rRNA基因的引物對VDI作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示兔物種特異引物對珊僅對兔血總DNA模板特異擴增出126bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。圖9是分別采用八種動物的總DNA模板，以雞12S rRNA基因的引物對IX作為引物進行PCR擴增得到的DNA條帶。結果顯示雞物種特異引物對IX僅對雞血總DNA模板特異擴增出299bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。通過上述實驗及實驗結果可知，當上述各物種的單對引物(馬為兩對引物)均分別與八種總DNA模板進行PCR實驗時，確定該引物僅對其自身物種的總DNA模板有反應，而對其他七個物種的總DNA模板沒有反應，以單物種DNA模板方式驗證了各物種引物的特異性。
實施方式二以所述各物種總DNA樣品按照一定比例混合后的混合總DNA樣品為模板(I)混合總DNA樣品的處理將所述八種動物的總DNA樣品等體積混合，其中每種各占12. 5vol. %，所得為混合總DNA樣品。取 μ 該混合總DNA樣品并稀釋500倍，作為混合總DNA模板，并將引物稀釋至lMmol/L ；(2)反應體系的配制在PCR薄壁管中加入如下各反應組分，反應體系10μ1/管。雙蒸水3Pl、10XPCR 反應緩沖液 μ1、2. 5mM each 的 dNTPs O. 8μ1、2· 5υ/μ1 的 Taq酶O. 2μ1、( I)中所述混合總DNA模板I μ 、IμΜ正向引物2μ1和IμΜ反向引物2μ1 ;其中Taq酶為常規Taq酶(參見Tiangen公司的Taq酶說明書)。(3) PCR反應程序的制定該反應程序同實施例一中的反應程序。(4) 2wt. %瓊脂糖凝膠電泳該電泳過程及條件同實施例一中的電泳。所得凝膠成像結果如圖10所示。該方法以各物種特異性引物分別與混合總DNA模板進行PCR擴增反應，很好的驗證了復雜總DNA模板條件下各物種特異性引物的有效性和特異性。由圖10可以看出的，各物種特異性引物均能很好的從總DNA混合模板中擴增出其對應物種的特異性大小的條帶。根據上述實施例一和實施例二中所述的PCR反應體系，本發明所述引物體系可以配合相關試劑組裝成不同組合的試劑盒，可用于對鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞物種鑒定，尤其適用于用于鹿血液產品的真偽及摻假判定。
權利要求
1.一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系，其特征在于由下列引物對組成 (1)對鹿12SrRNA基因進行擴增生成鹿特異性擴增片段的引物對I : 正向引物5 ’ -GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3， 反向引物5 ’ -AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3，； (2)對豬12SrRNA基因進行擴增生成豬特異性擴增片段的引物對II 正向引物5 ’ -AGCACACCTATAACGGTAGCTCA-3， 反向引物5 ’ -CCTAGCTATCGTGTGTCAGGATT-3，； (3)對牛Cytb基因進行擴增生成牛特異性擴增片段的引物對III 正向引物5 ’ -CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3， 反向引物5 ’ -GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3，； (4)對羊Cytb基因進行擴增生成羊特異性擴增片段的引物對IV 正向引物5 ’ -CGCCATGCTACTAATTCTTGTTCT-3， 反向引物5 ’ -TGGAGGAAGGGTACAAGTACTAAG-3，； (5)對馬基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對組合，該引物對組合由對馬Cytb基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對V和對馬12S rRNA基因進行擴增生成馬特異性擴增片段的引物對VI組成 引物對V 正向引物5’ -CACAGCCCTGGTAGTCGTACA-3’ 反向引物5’ -TGTCCGCCGATTCATGTTAGT-3’ ； 引物對VI 正向引物5’ -CGTGTCAAAGACTAATACCAA-3’ 反向引物5’ -AGCTATCGTGTAGTCAGAGGTA-3’ ； (6)對驢16SrRNA基因進行擴增生成驢特異性擴增片段的引物對VII 正向引物5’ -TTCAAGCTCAACGTCACACATA-3’ 反向引物5’ -TGTGTTGGGTTAACAATAGTCT-3’ ； (7)對兔12SrRNA基因進行擴增生成兔特異性擴增片段的引物對VDI 正向引物5 ’ -GCGTAAAGCGTGATTAGAATAAAC-3 ’ 反向引物5 ’ -TAGCTATCGTGAGTTCGAAGAGT-3 ’ ； (8)對雞12SrRNA基因進行擴增生成雞特異性擴增片段的引物對IX 正向引物5 ’ -ATCCATCTTAGCCTCAACGATTAA-3 ’ 反向引物5 ’ -CTATTGAGCTCACTGTTGTTCTTT-3 ’。
2.一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定方法，其特征在于以樣品總DNA為模板，利用所述引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、由引物對V和引物對VI組成的弓I物對組合、弓I物對VII、引物對珊和引物對IX分別進行PCR擴增實驗，反應結束后根據瓊脂糖凝膠電泳判定結果；所述樣品總DNA模板來自鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞物種血液的混合，或上述各物種血液產品中的一種。
3.根據權利要求2所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定方法，其特征在于所述PCR擴增實驗中的特定PCR反應體系包括下列組分雙蒸水3體積份、10 X PCR反應緩沖液I體積份、2. 5mM each的dNTPs O. 8體積份、2. 5υ/μ1的Taq酶O. 2體積份、經稀釋500倍的總DNA模板I體積份、I μΜ正向引物2體積份和I μΜ反向引物2體積份。
4.根據權利要求3所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定方法，其特征在于所述PCR擴增實驗中的特定PCR反應體系包括下列組分雙蒸水3Pl、10XPCR反應緩沖液Ιμ1、2. 5mMeach 的 dNTPs O. 8μ1、2· 5υ/μ1 的 Taq 酶 O. 2μ1、經稀釋 500 倍的總 DNA 模板 μ1、 μΜ 正向引物2μ1和 μΜ反向 引物2μ1。
5.根據權利要求2所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定方法，其特征在于所述PCR擴增實驗中特定PCR反應程序為依次進行94°C下預變性5min，94°C變性45s，56°C退火45s，72°C延伸45s，進行35次循環，72°C下延伸lOmin，最后在4°C下保持Imin后結束。
6.根據權利要求2至5所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定方法，其特征在于所述瓊脂糖凝膠電泳結束后判定結果時，判定依據為所述引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、由引物對V和引物對VI組成的弓I物對組合、引物對Vn、引物對VDI和弓I物對IX分別擴增出的DNA片段大小；其中 鹿物種的引物對I擴增出的DNA片段大小為376bp ； 豬物種的引物對II擴增出的DNA片段大小為300bp ； 牛物種的引物對III擴增出的DNA片段大小為360bp ； 羊物種的引物對IV擴增出的DNA片段大小為231bp ； 馬物種的由引物對V和引物對VI組成的引物對組合擴增出的DNA片段大小為分別對應為 456bp 和 115bp ； 驢物種的引物對VII擴增出的DNA片段大小為232bp ； 兔物種的引物對VDI擴增出的DNA片段大小為126bp ； 雞物種的引物對IX擴增出的DNA片段大小為299bp。
7.一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用試劑盒，其特征在于包括所述引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、由引物對V和引物對VI組成的弓I物對組合、弓I物對Vn、弓I物對VDI和引物對IX。
8.根據權利要求7所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用試劑盒，其特征在于所述試劑盒用于單物種總DNA模板進行鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的物種鑒定。
9.根據權利要求7所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用試劑盒，其特征在于所述試劑盒用于多物種混合總DNA模板進行鹿、豬、牛、羊、馬、驢、兔和雞的物種鑒定。
10.根據權利要求7所述的鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用試劑盒，其特征在于所述試劑盒用于鹿血液產品的真偽及摻假判定。
全文摘要
本發明公開了一種鹿豬牛羊馬驢兔雞的PCR鑒定用引物體系及PCR鑒定方法，該引物體系可一次性檢測多達八個動物物種，達到對常見動物物種基本覆蓋的目的；且本發明引物均僅對各自物種目標片段進行特異性擴增，不會與其他物種起反應，因此也能適用于一次PCR反應中導入兩種及以上引物對的多重PCR反應，從能有效縮短實驗時間；此外在進行PCR時，使用優化的特定PCR反應體系及反應程序，采用統一PCR檢測方法，簡化了檢測流程，建立了快速高效且特異性高的鑒定方式，從而有效的鑒定鹿血制品的真偽及摻假情況，為鹿血的質量控制提供了現代分子生物學的檢測手段；此外該引物體系還能配合相關試劑制成試劑盒，方便使用，同時為工業化生產及應用提供了可能，其應用前景極好。
文檔編號C12N15/11GK102876805SQ20121041196
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月25日 優先權日2012年10月25日
發明者周翠霞, 楊彥鵬, 黨平 申請人:蘇州市紅冠莊國藥飲片有限公司