專利名稱：一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌及其應用。
背景技術：
膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的重要物質，尤以腦及神經組織中最為豐富，不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸、維生素D及留體激素的原料，膽固醇在體內有著廣泛的生理作用。但是，現在隨著人們生活水平的提高，高膽固醇含量膳食的攝入也逐漸增多，但隨之而來的負面影響卻是動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等心腦血管疾病的發病率不斷提高。高脂血癥是動脈粥樣硬化和冠心病的主要原因，每年動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等心腦血管疾病的發病率不斷提高。目前，心血管疾病已成為引起人類死亡的主要殺手，血清中的膽固醇則被認為是誘發冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要因素。因此，降低血清中膽固醇的水平直接關系到人類的健康，人體膽固醇濃度與膳食脂質攝入之間有著 密切的關系，因此降低食品中的膽固醇關系到人類的健康與長壽。目前，降膽固醇的藥物有(I)主要降總膽固醇兼低密度脂蛋白的藥物主要是他汀類和膽汁酸螯合劑，如洛伐他汀、辛伐他汀，消膽胺、降膽寧，主要是競爭抑制合成膽固醇的限速酶和加速膽汁酸的利用等；(2)降甘油三酯兼極低密度脂蛋白的藥物煙酸類和苯氧酸類，能降低甘油三酯在肝中合成；抑制低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的合成，減少高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的分解；(3)綜合調脂類主要是一些中藥制劑。這些藥物或多或少的有不良反應，最常見的是胃腸道副反應。因此，尋找一種能夠長期使用而且無不良反應的食品或者保健食品是研究工作者和患者所期盼的。國外研究表明，許多乳酸菌在體內和體外都有降低膽固醇的功效。美國和國內的營養和醫學專家推薦食物膽固醇的攝入量標準為不超過250 300mg/d ·人。隨著人民生活水平的提高和膳食營養的增加，膽固醇的攝入量很容易超標。因此研究不限飲食、不影響食品風味、經濟實用的降低食品及人體血清膽固醇水平的方法已成為當前重要的研究課題。乳酸菌大量存在于酸乳及其它相關發酵乳制品中。20世紀70年代，科學家先后通過對大量飲用酸乳等發酵乳制品的非洲Massai人血清膽固醇的研究，對新生兒的研究，對常飲酸乳的美國人的調查以及直接對酸乳的研究等，均發現乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用。大量臨床試驗證實，服用乳酸菌及其相關制品對降低血清膽固醇水平有很好的效果。國內外的學者普遍認為，乳酸菌去除膽固醇的機制有以下幾種(I)與膽固醇共沉淀作用；
(2)乳酸菌的同化作用(菌體的吸收)(3)膽固醇摻入菌體細胞膜；(4)菌體產生膽固醇氧化酶或其他酶系，直接在體外使膽固醇降解。本研究旨在篩選降膽固醇能力強、能夠耐酸、耐膽鹽、并能夠在腸道存活的乳酸菌。乳酸菌是一種可以分解糖類產生乳酸的厭氧、兼性厭氧、無芽孢革蘭氏陽性菌。乳酸菌中的嗜熱鏈球菌被認為是“公認安全性(GRAS)”成分，廣泛用于生產重要的乳制品發酵，如酸奶和奶酪。其對機體具有重要的生理功能在其生長代謝過程中能產生半乳糖苷酶降低乳糖不耐癥的發生，產生的乳酸降低腸道pH，促進腸蠕動防止病原菌定植，抑制病原菌的生長；發酵過程中產生胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS),增加酸奶粘度；縮短酸奶的凝乳時間等等。但大多數乳酸菌不能耐受胃酸和腸道中的膽鹽，作為能夠降低膽固醇的乳酸菌必須通過人體的胃腸道，才能發揮降膽固醇的作用。發明人根據這些特點對乳酸菌進行分離，從而篩選出一株性能優越的微生態制劑生產菌種。
發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌及其應用，并提供了一種具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌制劑。本發明是通過以下技術方案實現的一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌，其分類命名為嗜熱鏈球菌BLST·(Streptococcus thermophilusBLST),已于2012年07月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為:CCTCC NO M 2012282。所述嗜熱鏈球菌的菌種生物學特性如下該菌種的細胞大小通常為(0. 4 μ πΓΟ. 7 μ m) X (I. O μ πΓ6. Oum),球狀，部分散在、對生，前期為鏈狀，染色均勻，無莢
膜，無鞭毛，能運動；培養基上的菌落圓形，表面乳白色，革蘭氏陽性，接觸酶陰性，0/F發酵試驗產酸；能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖產酸，生長溫度最高值為42 45°C，10°C以下不生長。經試驗證明，所述嗜熱鏈球菌具有降膽固醇的作用，所以該菌株可以作為或用于制備降膽固醇的藥物或保健品。具體應用時，可以培養嗜熱鏈球菌BLST，得發酵產物，即為降膽固醇的保健品，該發酵產物也能夠作為制備降膽固醇的藥物或保健品的原料。所述培養嗜熱鏈球菌BLST的具體過程如下( i )菌種選用嗜熱鏈球菌BLST ；(ii)斜面培養將凍干粉菌種接種于固體斜面培養基上，在37 °C 42 °C培養26 30h ；(iii) 一級種子培養取培養好的斜面，在無菌條件下接種用接種取兩環于50mL IOOmL種子液體培養基中，在37°C 42°C條件下，靜置培養20 24h，制得一級種子液；(iv)擴大培養以3%的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培養基中，在37 42°C條件下，靜置培養20 24h，制得二級種子液；(V)發酵罐培養以3%的接種量，將二級種子液接于液體發酵培養基中，于37 42 °C條件下，靜置培養30 36h ；(vi)收集發酵產物待步驟(V )的發酵液的pH值降到4. 5以下，收集發酵液；(Vii)發酵結束后，立即將發酵液12000轉/min離心，得菌泥，向菌泥加保護劑，真空凍干，粉碎得菌粉；所述保護劑的組成及用量為脫脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%，均為相對于菌泥質量的百分數；上述步驟(iii)、(iv)、(V)中所述種子液體培養基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0. 5g/L、硫酸錳0. 2g/L、吐溫-801mL/L，使用時，調節pH至6. O 6. 5，在115°C條件下滅菌20min ;步驟(ii )所述固體斜面培養基為上述種子液體培養基中添加I. 5 2. 0%的瓊脂粉。一種具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌制劑，其特征在于菌制劑百奧脂樂是由以下原料組成的山楂58 62% (商品名稱山楂，實驗室濃縮烘干；生產廠家泰安綠地大藥房)，靈芝孢子粉6 10% (商品名稱靈芝孢子粉，實驗室破壁處理；生產廠家泰安鳳凰靈芝生物科技有限公司)，紅曲米粉I. O 2. 0% (商品名稱紅曲米粉；生產廠家山東巨野晨農天然產物有限公司)，低聚果糖18 22% (商品名稱低聚果糖；生產廠家鄭州弘益泰化工產品有限公司)，低聚木糖4 6% (商品名稱低聚木糖；生產廠家山東龍力生物科技有限公司)，嗜熱鏈球菌BLST 2X 108cfu/g，植物乳桿菌LP-112X 108cfu/g (該菌株命名為Lactobacillus plantarum，已 于2010年06月21日保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO M 2010150，記載在中國專利申請CN201010240725. X中)，各組分按質量百分比；嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌以菌粉的形式加入，菌粉質量要根據凍干菌粉的活菌數來計算，加入凍干菌粉后各組分的質量分數之和不足100%時，由奶粉(商品名稱奶粉；生產廠家內蒙古伊利實業集團股份有限公司)補足至100%，制備時，將各組分混合均勻即可。所述植物乳桿菌是以菌粉的形式加入和存在的，其制備方法記載在中國專利申請CN201010240725. X 中。所述嗜熱鏈球菌BLST是以菌粉的形式加入和存在的，制備菌粉的具體過程同上。本發明的具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌，為經過篩選得到的菌種，其降膽固醇能力強，效果好，可以用于制備降膽固醇的藥物或保健品。本發明的具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌制劑(稱為百奧脂樂)，比單一的中藥組方、合生元效果顯著，比市售國藥準字號產品降脂寧、血脂康效果顯著，是一個降低總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)效果很好的產品，此產品的原料皆為藥食兩用的，無毒副作用，無不良反應，是高血脂患者可以長期服用的最佳
女口
廣叩ο
一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌，其分類命名為嗜熱鏈球菌BLST(Streptococcus thermophilusBLST),已于2012年07月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012282，保藏地址為中國武漢武漢大學，郵編430072。圖I :四株菌在降膽固醇培養基中發酵40h后的效果圖，其中，(a):菌株BJLY發酵前后降膽固醇效果圖；(b):菌株LP發酵前后降膽固醇效果圖；(c):菌株R3發酵前后降膽固醇效果圖；(d)菌株BLST發酵前后降膽固醇效果圖。圖2 :菌株BLST和R3降膽固醇培養基中發酵40h后計數平板示意圖，其中，(a)菌株R3接到降膽固醇的培養基中，37°C發酵40h后，用平板稀釋計數法計數，稀釋度為IO6上37°C培養48h的乳酸菌生長情況，從圖中可以看出在IO6上乳酸菌未見菌落生長；(b):菌株R3稀釋度為IO7乳酸菌未見菌落生長；(c):菌株BLST接到降膽固醇的培養基中發酵40h后計數，稀釋度為106，37°C培養48h后未見菌落生長；(d)菌株BLST稀釋度為107，37°C培養48h后未見菌落生長；圖3 (a):菌株BLST降膽固醇培養基中發酵40h后，鏡檢涂片；圖3 (b):菌株BLST吸附膽固醇后用無水乙醇處理后，鏡檢涂片；試驗結果表明菌體在膽固醇培養基中顯微鏡下未見游離的菌體，菌體外包裹著膽固醇，都與膽固醇結合形成一個個大的顆粒，在平板計數時菌體從外界吸收不到營養而未生長。經無水乙醇處理后，膽固醇溶解，露出菌體。這說明菌體與膽固 醇有吸附作用。圖4:吸附膽固醇后轉入新鮮培養基中培養40h后鏡檢涂片；試驗結果表明將吸附膽固醇的菌體接入新鮮的未加膽固醇的培養基中，膽固醇可以釋放到培養基中露出菌體，這可能是菌體細胞膜能夠調節膜內外濃度差的作用。圖5 :各試驗組對試驗大鼠采食的影響。圖6 :各試驗組對試驗大鼠體重的影響。圖7 :各試驗組TC比較圖。圖8 :各實驗組TG比較圖。圖9 :各試驗組HDL-C的比較圖。圖10 :各實驗組LDL-C的比較圖。圖11 :各實驗組TC比較。圖12 :各實驗組TG比較圖。圖13 :各實驗組對HDL-C比較圖。圖14各實驗組LDL-C比較圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例一、菌種的分離鑒定隨著人們生活水平的提高，高膽固醇含量膳食的攝入也逐漸增多，隨之帶來的高脂血癥、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病已經嚴重危害到人體健康。人體內膽固醇獲得的途徑有外源攝取和內源合成，如何減少外源攝取膽固醇攝入量、降低人體血清膽固醇水平的研究越來越受到廣泛關注。除了限制飲食外，國內外的科學家研究表明，乳酸菌具有降低人體血清膽固醇的作用，采用益生菌來降低膽固醇無毒無副作用、可長期安全食用，是解決人類心血管疾病的一條新途徑。I材料與方法I. I試驗材料酸奶、泡菜購自泰安市中百超市。基礎培養基MRS培養基，篩選培養基MRS加入2%碳酸鈣。體外降膽固醇培養基用無水乙醇將固態膽固醇(真空干燥箱干燥至恒重)和豬膽鹽溶解，配成質量濃度為15mg/mL的膽固醇酒精溶液(含4. 5%的豬膽鹽)，將膽固醇酒精溶液和新鮮配制的MRS溶液按1:14的比例配成約含O. 1%膽固醇MRS培養基(含O. 3%的豬膽鹽)，115°C高壓蒸氣滅菌20min，冷卻后置4°C冰箱備用。試驗儀器電子天平、水浴鍋、微波爐、雙目顯微鏡、高速冷凍離心機等。I. 2試驗方法I. 2. I菌種的分離、篩選、培養。無菌取分離物(酸奶、泡菜)lg，加入到盛有IOOmL滅菌生理鹽水中，震蕩搖勻，然后用接種環蘸取溶液于MRS碳酸鈣瓊脂平板劃線接種，在37 V培養箱中恒溫培養24h，再挑取有鈣圈的菌落繼續劃線，37 °C培養箱中恒溫培養24h，挑取鈣圈明顯的單菌落保存到試管斜面上，做革蘭氏染色，鏡檢。
I. 2. 2種子液制備將上述步驟I. 2. I分離、篩選的菌種斜面，用接種環分別刮取兩環于50-100mLMRS基礎培養基中，37°C培養24h，得發酵液，備用。I. 2. 3耐酸試驗用HCl將生理鹽水的pH值調至I. 8，115°C，滅菌20min。分別取種子液ImL分別加入已滅菌pH值I. 8的生理鹽水，37°C條件下培養20min，取樣測定活菌數，以最初的接入的菌液作為對照，計算其30min后的存活率。I. 2. 4耐膽鹽試驗基礎培養基中添加O. 3%的豬膽鹽，滅菌，接種量為2%，37°C培養Ih后計數，以種子液的活菌數為起始菌數，計算其存活率。I. 2. 4模擬人工胃液試驗種子液按2% (v/v)接種于模擬胃液中，在37°C條件下培養，分別在30min取樣，平板菌落計數，以種子液作為對照，將計數結果取對數。人工胃液配制依照中國藥典2010版附錄。I. 2. 6模擬人工腸液試驗種子液按2% (v/v)接種于模擬腸液中，在37°C條件下培養0h、0. 5h、Ih取樣，平板菌落計數，以種子液作為對照，將計數結果取對數。人工腸液配·制依照中國藥典2010版附錄。I. 2. 7降膽固醇能力篩選將各菌株活化2 3次，分別接種到MRS培養基中，37°C培養24h，按2%(V/V)接種量接種于降膽固醇篩選培養基中，搖勻后立即取樣2mL，4000rpm離心5min，取上清液用鄰苯二甲醛比色法，測定膽固醇含量，37°C靜置培養40h后，用同樣方法測定上清中膽固醇含量，并計算培養基中膽固醇的清除率，重復試驗三次求平均值。I. 2. 8膽固醇含量測定采用直接離心鄰苯二甲醛法(0ΡΑ法)。I. 2. 9膽固醇脫除率的計算膽固醇的脫除率(％)=膽固醇降解量/發酵前膽固醇含量X 100%。I. 2. 10菌種鑒定試驗(生化試驗)按GB/T4789. 35-2010，伯杰氏細菌鑒定手冊，配制糖發酵培養基，將純培養菌分別穿刺接種，同時進行氧化及觸酶試驗，產酸產氣等試驗，37°C培養 2d。2結果與分析2. I形態觀察從酸奶中分離純化的5株乳酸菌和從泡菜中分離純化的22株乳酸菌經37 °C，24h培養均生長出乳白色、隆起、邊緣整齊的小菌落，但需氧培養的菌落明顯小于厭氧法。革蘭氏染色為陽性，球菌、鏈球菌及桿菌。2. 2耐酸試驗結果對分離純化的27株乳酸菌進行耐酸試驗，有6株表現出來良好的耐酸性，BLS3菌株的耐酸性最好，在pH值I. 8的生理鹽水中30min其存活率達到了20. 5%, BLST和BLP5次之，分別為9. 2%和5. 6%,其余的3菌株都在2%以上。2. 3耐膽鹽試驗結果將分離純化好的菌株以2%的接種量接種到含O. 3%的豬膽鹽的培養基，37°C培養Ih后計數，其存活率結果表明有5株乳酸菌有較好的耐膽鹽能力，其中BLST耐膽鹽能力最好存活率為56. 8%，其次為BLS3、BLP2、BLP5、BLP8，其存活率分別為43. 5%, 40. 2%, 38. 4%, 30. 7%。結合這幾株的耐酸和耐膽鹽試驗結果，確定BLS3、BLST, BLP5三個株菌作為后備菌種，進行下一步的試驗篩選。2. 4模擬人工胃液試驗三株菌的模擬人工胃液試驗的結果見表I。表I三株菌的耐受人工胃液試驗結果(單位lg cfu/mL)
權利要求
1.一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌，其特征在于其分類命名為嗜熱鏈球菌BLST (Streptococcus thermophilus BLST),已于 2012 年 07 月 11 日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0 M 2012282。
2.權利要求I所述的具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌在作為或制備降膽固醇的藥物或保健品中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于應用時，培養嗜熱鏈球菌BLST，得發酵產物，即為降膽固醇的保健品，或該發酵產物能夠作為制備降膽固醇的藥物或保健品的原料。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于培養的具體過程如下 (i )菌種選用嗜熱鏈球菌BLST ； (ii)斜面培養將凍干粉菌種接種于固體斜面培養基上，在37°C 42°C培養26h 30h ； (iii)一級種子培養取培養好的斜面，在無菌條件下接種，用接種環取兩環于50mL IOOmL種子液體培養基中，在37°C 42°C條件下，靜置培養20h 24h，制得一級種子液； (iv)擴大培養以3%的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培養基中，在37°C 42°C條件下，靜置培養20h 24h，制得二級種子液； (V)發酵罐培養以3%的接種量，將二級種子液接于液體發酵培養基中，于37°C 42 °C條件下，靜置培養30h 36h ； 上述步驟(iii)、(iv)、(v)中所述種子液體培養基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂0. 5g/L、硫酸錳0. 2g/L、吐溫_801mL/L，使用時，調節pH至6. O 6. 5，在115°C條件下滅菌20min ；步驟(ii )所述固體斜面培養基為上述種子液體培養基中添加I. 5 2. 0%的瓊脂粉。
5.一種具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌制劑，其特征在于菌制劑百奧脂樂是由以下原料組成的山楂56 61%，靈芝孢子粉6 9%，紅曲米粉I. O I. 5%，低聚果糖18 22%， 低聚木糖4 6%，嗜熱鏈球菌BLST 2X 108cfu/g，植物乳桿菌LP-112X 108cfu/g，各組分按質量百分比； 所述嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌以菌粉的形式加入，加入菌粉后各組分的質量分數之和不足100%時，由奶粉補足至100% ； 所述嗜熱鏈球菌BLST，已于2012年07月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO M 2012282。
6.根據權利要求5所述的具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌制劑，其特征在于所述嗜熱鏈球菌BLST是以菌粉的形式存在的，制備菌粉的具體過程如下 (i )菌種選用嗜熱鏈球菌BLST ； (ii)斜面培養將凍干粉菌種接種于固體斜面培養基上，在37°C 42°C培養26h 30h ； (iii)一級種子培養取培養好的斜面，在無菌條件下用接種環取兩環于50mL IOOmL種子液體培養基中，在37°C 42°C條件下，靜置培養20h 24h，制得一級種子液； (iv)擴大培養以3%的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培養基中，在37°C 42°C條件下，靜置培養20h 24h，制得二級種子液；(V )發酵罐培養以3%的接種量，將二級種子液接于液體發酵培養基中，于37°C ·42 °C條件下，靜置培養30h 36h ； (vi)收集發酵產物待步驟(V)的發酵液的pH值降到4. 5以下，收集發酵液； (vii)發酵結束后，立即將發酵液12000rpm離心，得菌泥，向菌泥加保護劑，真空凍干，粉碎得菌粉；所述保護劑的組成及用量為脫脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%，均為相對于菌泥質量的百分數； 上述步驟(iii)、(iv)、(v)中所述種子液體培養基配方為葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L、磷酸氫二鉀5g/L、硫酸鎂O. 5g/L、硫酸錳O. 2g/L、吐溫_801mL/L，使用時，調節pH至6. O 6. 5，在115°C條件下滅菌20min ；步驟(ii )所述固體斜面培養基為上述種子液體培養基中添加I. 5 2. 0%的瓊脂粉。··
全文摘要
本發明公開了一株具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌，其分類命名為嗜熱鏈球菌BLST(Streptococcus thermophilus BLST)，已于2012年07月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM 2012282。經試驗證明，本發明的嗜熱鏈球菌具有降膽固醇的作用，所以該菌株可以作為或用于制備降膽固醇的藥物或保健品。具體應用時，可以培養嗜熱鏈球菌BLST，得發酵產物，即為降膽固醇的保健品，該發酵產物也能夠作為制備降膽固醇的藥物或保健品的原料。本發明還提供了一種具有降膽固醇能力的嗜熱鏈球菌制劑，菌制劑百奧脂樂是由以下原料組成的山楂，靈芝孢子粉，紅曲米粉，低聚果糖，低聚木糖，嗜熱鏈球菌BLST菌粉，植物乳桿菌LP-11菌粉。
文檔編號C12N1/20GK102899276SQ20121043926
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月7日 優先權日2012年11月7日
發明者單寶龍, 谷巍, 程秀芳, 翟延慶, 王叢叢, 劉虹, 李丹, 謝莉敏 申請人:山東寶來利來生物工程股份有限公司