專利名稱：以粒毛盤菌胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于粒毛盤菌胞外多糖在制藥領域中的應用技術領域，具體涉及菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用方法。
背景技術：
胃潰瘍是一種常見的消化系統疾病，因其發病率越來越高，臨床癥狀不明顯，潛在危害性較大，因此越來越受到人們的關注。胃潰瘍發病機制各異，如幽門結扎型胃潰瘍是胃酸和胃蛋白酶分泌失調引起的慢性胃潰瘍，而無水乙醇型胃潰瘍則是由于乙醇直接損傷 胃黏膜引起的急性胃潰瘍。目前臨床上通常使用的治療藥物主要有堿性抗酸藥、受體阻斷劑、質子泵抑制劑、胃黏膜保護劑和抗生素等，但上述現有藥物因療程較長，且服藥后易出現不適感和有不同程度的毒副作用，使很多患者無法接受長期治療。因此，挖掘與開發天然的、無毒副作用且可以長期服用的預防胃潰瘍藥物對維護人類健康具有重要的意義。多糖是一類天然高分子化合物，通常幾乎無毒。粒毛盤菌屬(Lachnum Retz.)是分布廣泛的一類腐生性真菌，在液體培養條件下能產生多種生物活性物質，如多糖、多酚、色素等。中國《藥物研究》(2011年第20卷第I期第14-15頁)公開了枸杞多糖對大鼠實驗性胃潰瘍的作用研究，實驗結果表明枸杞多糖具有抗實驗性胃潰瘍的功能，但文獻中涉及的枸杞多糖為植物源多糖，并未提到微生物源多糖的預防胃潰瘍功能；中國專利號ZL201010582408. 6公開了一種粒毛盤菌多糖在制備抗疲勞藥物中的應用。中國專利申請號201110184104. 9中首次公開了菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌及其胞外多糖在降脂利肝藥物中的用途。但至今未見有公開文獻提及以粒毛盤菌胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥的應用方面的報道。
發明內容
本發明提供一種以菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用方法，以滿足人們對預防胃潰瘍藥物的需要。本發明以菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用方法，其特征在于將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌接種于4L發酵罐，培養基配方為葡萄糖37-47g/L，酵母膏10_17g/L，甘氨酸 6-7mg/L，MgSO4 · 7H20 O. 8-1. lg/L，KH2PO4 O. 9-1. IgL，裝料系數體積比為 O. 6-0. 8，接種量按體積比為13-16%，培養溫度為23-37 °C，通氣量為O. 9-1. lL/min，攪拌轉速為170-190r/min，發酵時間為9_11天；將發酵液抽濾、濃縮后，加入其2_4倍體積的質量分數為90% -100%的乙醇于4°C醇沉18-25h，將醇析液以4000_5000r/min離心8_10min，去上清，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌2 3次，然后用蒸餾水溶解，采用賽沃杰法(Sevag法)脫蛋白，在體積百分濃度為30%的H2O2中50-55°C保溫進行脫色處理后，蒸餾水常溫透析20-30小時，_48'50°C冷凍干燥，得到粒毛盤菌胞外多糖粉末；將上述粒毛盤菌胞外多糖粉末用質量百分濃度為O. 9%的生理鹽水配置成劑量為100-400mg/mL的水溶液,給藥體積為9_llmL/kg,灌胃小鼠2_3周,最后一次給藥I小時后用無水乙醇灌胃，劑量為每200g體重給予O. 9-1. ImL無水乙醇，I小時后,摘眼球取血,將小鼠脫頸椎處死，取胃，觀察并測定潰瘍面積，計算胃潰瘍指數，測定小鼠的胃蛋白酶活性、胃液量及胃液總酸度及小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；實驗結果證實，上述粒毛盤菌胞外多糖不僅能有效預防小鼠胃潰瘍，且無毒副作用。本發明以粒毛盤菌胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用方法，其特征在于可配制成如下劑型使用
A、加工成片劑取上述制備的300_600g的粒毛盤菌胞外多糖，與藥用輔料稀釋劑200-250g和助流劑30-60g混勻后，再與250_600mL乙醇混合均勻制得軟材，將該軟材過篩得到的濕顆粒干燥后整粒，最后加入潤滑劑3-10g混勻后壓片，制成片劑1000片；所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤滑劑采用硬脂酸鎂或硬脂酸鋅；或B、加工成膠囊劑取藥用輔料稀釋劑200-270g、助流劑40_70g和潤濕劑3_6g混勻后，與300-600g的粒毛盤菌胞外多糖混合均勻后分裝入1000粒1#空心膠囊內，制得膠囊劑1000粒；所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤濕劑采用十二烷基硫酸鈉或者磺基丁二酸二辛酯。本發明使用菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖為原料作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，所制備的藥物克服了現有堿性抗酸藥、受體阻斷劑、質子泵抑制劑、胃黏膜保護劑以及抗生素等藥物療程較長且具有不同程度的毒副作用等缺點。經本發明的實驗研究證實，上述粒毛盤菌胞外多糖不僅能有效預防小鼠胃潰瘍，且無毒副作用，其制備方法簡單經濟，故可將上述粒毛盤菌胞外多糖應用于制備片劑或膠囊劑型預防胃潰瘍的藥物。
圖I是經不同處理后的小鼠胃的照片比較，其中A為正常組、B為陰性對照組、C為多糖低劑量組、D為多糖中劑量組、E為多糖高劑量組、F為陽性對照組的小鼠胃的照片。
具體實施例方式實施例I :一、粒毛盤菌胞外多糖的制備將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌接種于4L發酵罐，培養基配方為葡萄糖 40g/L，酵母膏 12g/L，甘氨酸 6. 2mg/L, MgSO4 · 7H20 lg/L, KH2PO4 IgL，裝料系數為O. 7，接種量為15% (體積比)，培養溫度為35°C，通氣量為I. OL/min，攪拌轉速為180r/min，發酵時間為10天；將發酵液抽濾、濃縮后，加入其3倍體積的質量分數為95%的乙醇于4°C醇沉24h，將醇析液以5000r/min離心lOmin，去上清，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌2 3次，然后用蒸餾水溶解，Sevag法脫蛋白及30%的H2O2保溫(50°C )脫色處理后，蒸餾水常溫透析24h，-50°C冷凍干燥，即得菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖。二、粒毛盤菌胞外多糖生理鹽水溶液的制備將上述粒毛盤菌胞外多糖粉末用O. 9%生理鹽水分別配置成100mg/mL、200mg/mL和400mg/mL的水溶液,采取的給藥體積為10mL/kg。三、粒毛盤菌胞外多糖對小鼠預防胃潰瘍的作用藥理實驗(I)動物昆明小鼠60只，雌雄各半，體重22 ± 2g，隨機分組。(2)試劑盒超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)，為南京建成生物工程研究所生產的產品；陽性藥物硫糖鋁片，為上海延安萬象藥業有限公司生產的產品。(3)方法小鼠于實驗環境下適應一周后隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組、陰性對照組(百分濃度O. 9%的生理鹽水)、多糖低劑量組(100mg/kg)、多糖中劑量組(200mg/kg)、多糖高劑量組(400mg/kg)、陽性對照組(硫糖招片150mg/kg)。每天上午10 00時分別對各組小鼠進行相應的灌胃處理，按照小鼠體重給予不同體積的受試物，自由攝食和飲水，連續給藥14天，最后一次給藥前小鼠禁食24小時，禁食期間飲水不限，最后一次給藥I小時后用無水乙醇灌胃，劑量為每200g體重給予ImL無水乙醇，I小時后,摘眼球取血，將小鼠脫頸椎處死。
(4)相關指標測定小鼠胃液分泌量、胃酸濃度和胃蛋白酶活性的測定將小鼠剖腹取胃，收集胃液，然后將收集的胃液移至刻度離心管中，記錄胃液總量。以4000r/min離心5min,取上清胃液O. ImL,加酹紅指示劑I滴,用O. 001mol/L NaOH滴定，直至胃液先呈黃色后轉為紅色2秒鐘內不消失為終點，計算耗去的NaOH量即總酸度。取上清胃液，按照試劑盒說明測定胃蛋白酶活性。胃潰瘍抑制率的測定從小鼠幽門處注入3mL百分濃度為4%的甲醛溶液，將胃浸入甲醛溶液中固定30min后，沿胃大彎切開，用干燥的棉球輕輕擦去胃內容物，肉眼觀察小鼠胃粘膜，測量胃黏膜潰瘍長度及寬度(不足Imm的潰瘍點按Imm計)，計算潰瘍面積；考慮到各組小鼠胃面積大小不同，以潰瘍指數衡量多糖對小鼠胃潰瘍的抑制作用。其中胃潰瘍指數=胃潰瘍面積/胃面積X 100% ；潰瘍抑制率=(模型對照組潰瘍指數-給藥組潰瘍指數)/模型對照組潰瘍指數 X 100%O小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的測定8000r/min離心5min,分離血清,嚴格按照試劑盒的說明，測定小鼠血清中MDA及SOD的含量。(5)實驗結果灌胃粒毛盤菌胞外多糖2周后，得到各處理組小鼠胃粘膜照片如圖I中所示。其中A為正常組、B為陰性對照組、C為多糖低劑量組、D為多糖中劑量組、E為多糖高劑量組、F為陽性對照組的小鼠胃的照片。從圖I照片中可見正常組小鼠胃粘膜呈乳紅色，胃完整清晰；陰性對照組小鼠胃粘膜呈紅色，腺胃部紅腫、充血，并有片狀出血及粘膜糜爛；多糖組小鼠胃黏膜紅腫、充血程度明顯減輕，可見點狀和少量條索狀出血；陽性對照組小鼠胃粘膜狀況與正常組小鼠相差不大。表I給出了粒毛盤菌胞外多糖對各組小鼠相關指標的影響表I粒毛盤菌胞外多糖對各組小鼠相關指標的影響
組別胃潰，指數胃蛋=活性■量(ml)胃液總^ SOD (U/ml) . M°f· n (%)(U)(m mol/L)(n mol/ml)
正常組20.14±1.34 0.29±0.011 7.11±0.197 108.11±2.79 16.18±1.07· 丨巧:秀!寸 46.3±2.62d33.08±2.21d0.56±0.013d9.16±0.04791.49士 3.69d26.75±1.54d
照組
多氏 27.1±1.74bd30.62士 2.50d0.45 士0.039ad9.07 士0.084c101.59±6.9121.31±0.92bd
劑量組
/ 10'53iL2125.08士 1.44bc0.34±0.038b6.49±0.244bd113.95±3.45b17.84 士 0.56b
劑量組
4.43±0.47m 20.30±0.94b0.25±0.014bd3.47±0.181bd128-52±3·0013.57士 0.49bd
劑量組
its 0.88±0.08b21.26士 1.01b0.32 士 0.017b8.39 士0.397106.80±4.07b16.82±0.75b
JiRai_注表I中，ap〈0. 05，與模型對照組相比；bp〈0. 01，與模型對照組相比；ep〈0. 05，與陽性對照組相比；dp〈0. 01，與陽性對照組相比。對表I中的各組指標參數進行比較分析，可以看出粒毛盤菌胞外多糖對各處理組小鼠相關指標的影響。與陰性對照組相比，各劑量多糖均顯著降低了小鼠的胃潰瘍指數，顯示不同程度的潰瘍抑制率。相比于正常組，模型對照組小鼠胃蛋白酶活性、胃液量及胃液總酸度均明顯升高，灌胃粒毛盤菌胞外多糖2周后，低、中、高劑量多糖均使其顯著降低，且呈一定的量效關系。表明此多糖可顯著抑制小鼠胃蛋白酶活性及胃液分泌，降低胃液總酸度，從而降低小鼠的胃潰瘍指數，抑制胃潰瘍的發生。與陰性對照組小鼠相比，各劑量多糖組小鼠血清中SOD活性均顯著提高，MDA含量顯著降低，其中高劑量多糖組小鼠血清中SOD活性提高了 40. 47%,MDA含量降低了 49. 27%，兩者均具有極顯著差異(P〈0. 01)。以上結果表明粒毛盤菌胞外多糖可明顯提高小鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，顯示其預防胃潰瘍功能。上述藥理學實驗分析測定了小鼠胃潰瘍病癥最具代表性的指標，從以上結果可以看出，在給藥劑量為100-400mg/(kg bw)時，菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖具有顯著的預防胃潰瘍作用，可顯著抑制潰瘍小鼠的胃潰瘍指數，提高潰瘍抑制率，降低胃蛋白酶活性、胃液量及胃液總酸度，提高血清中SOD活性，降低MDA含量，表現出明顯的預防胃潰瘍功能。實施例2 先按如下條件和方式制備獲得粒毛盤菌胞外多糖將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌接種于4L發酵罐，培養基配方為葡萄糖 46gL，酵母膏 14g/L，MgSO4 · 7H20 I. lg/L, KH2PO4 I. IgL，裝料系數為 O. 8，接種量為15%，培養溫度為25°C，通氣量為I. OL/min，攪拌轉速為190r/min，發酵時間為9天；將發酵液抽濾、濃縮后，加入其3倍體積的質量分數為95%的乙醇于4°C醇沉18h，將醇析液以5000r/min離心IOmin,去上清,沉淀用無水乙醇、丙酮洗漆2^3次,然后用蒸懼水溶解，Sevag法脫蛋白及30%的H2O2保溫(55°C )脫色處理后，蒸餾水常溫透析28h，_48°C冷凍干燥，即得菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖。然后將上述粒毛盤菌胞外多糖粉末用O. 9%生理鹽水配置成100mg/mL、200mg/mL、400mg/mL的水溶液，給藥體積為10mL/kg。將上述各劑量的粒毛盤菌胞外多糖進行小鼠預防胃潰瘍的作用藥理實驗，所采用的方式步驟和其他條件均與實施例I中相同，也都得到了與實施例I中類似的結果。將本實驗室保存的在申請中國專利申請號201110184104. 9中所制備的菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌胞外多糖樣品按照實施例I的方式步驟和條件進行了實驗，也都得到了與實施例I中基本相同的結果。 上述實施例的實驗說明，菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌的胞外多糖不僅能有效預防小鼠胃潰瘍，且無毒副作用，其制備方法簡單經濟，故可將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌產的胞外多糖應用于制備片劑或膠囊劑型預防胃潰瘍的藥物。實施例3 :粒毛盤菌胞外多糖制劑的加工本發明以菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，具體可配制加工成如下劑型的方式進行使用I、片劑加工將300_600g的粒毛盤菌胞外多糖與藥用輔料稀釋劑200_250g、助流劑30_60g混勻后250-600mL乙醇混合均勻制得軟材，軟材過篩得到濕顆粒，干燥后整粒，最后加入潤滑劑3-10g混勻后壓片，制成1000片片劑。所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤滑劑采用硬脂酸鎂或硬脂酸鋅。本發明推薦的片劑加工的優選例為取過8(Γ100目篩的上述粒毛盤菌胞外多糖500g、稀釋劑糊精240g、助流劑滑石粉50g，混合均勻后加400mL乙醇混合均勻制得軟材，軟材過篩得到濕顆粒，干燥后整粒，最后加入潤滑劑硬脂酸鎂IOg混勻后壓片，制成1000片，片重O. 8g，多糖含量O. 5g/片。2、膠囊劑加工將藥用輔料稀釋劑200-270g、助流劑40_70g、潤濕劑3_6g混勻后與300_600g的粒毛盤菌YM-281胞外多糖混合均勻后裝1#空心膠囊，制得膠囊劑1000粒。所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤濕劑
采用十二烷基硫酸鈉或者磺基丁二酸二辛酯。本發明推薦的膠囊劑加工優選例為取稀釋劑干淀粉250g，助流劑滑石粉45g，潤濕劑十二燒基硫酸鈉5g混合均勻與500g上述粒毛盤菌胞外多糖混合均勻后裝1#空心膠囊1000粒，多糖含量O. 5g/粒。本發明使用菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖為原料作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，所制備的藥物可以克服現有堿性抗酸藥、受體阻斷劑、質子泵抑制劑、胃黏膜保護劑以及抗生素等藥物療程較長且具有不同程度的毒副作用等缺點，且制備方法簡單經濟。
權利要求
1.以菌種保藏編號為CCTCCNo:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用。
2.如權利要求I所述以菌種保藏編號為CCTCCNo:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，特征在于所述粒毛盤菌產胞外多糖，是將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌接種于4L發酵罐，培養基配方為葡萄糖37_47g/L，酵母膏 10-17gL，甘氨酸 6-7mgL，MgSO4 ·7Η20 O. 8-1. IgL, KH2PO4O. 9-1. lg/L，裝料系數體積比為O. 6-0. 8，接種量按體積比為13-16%，培養溫度為23-37°C，通氣量為O. 9-1. lL/min，攪拌轉速為170-190r/min，發酵時間為9-11天；將發酵液抽濾、濃縮后，加入其2_4倍體積的質量分數為90%-100%的乙醇于4°C醇沉18-25h，將醇析液以4000_5000r/min離心8_10min，去上清，沉淀用無水乙醇、丙酮洗滌21次，然后用蒸餾水溶解，采用賽沃杰法脫蛋白，在體積百分濃度為30%的H2O2中50-55°C保溫進行脫色處理后，蒸餾水常溫透析20-30小時，-48^-50V冷凍干燥，所得到的粒毛盤菌胞外多糖。
3.如權利要求I所述以菌種保藏編號為CCTCCNo:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，特征在于加工成片劑取上述制備的300-600g粒毛盤菌胞外多糖，與藥用輔料稀釋劑200-250g和助流劑30-60g混勻后，再與250_600mL乙醇混合均勻制得軟材，將該軟材過篩得到的濕顆粒干燥后整粒，最后加入潤滑劑3-10g混勻后壓片，制成片劑1000片；所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤滑劑采用硬脂酸鎂或硬脂酸鋅。
4.如權利要求I所述以菌種保藏編號為CCTCCNo:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，特征在于加工成膠囊劑取藥用輔料稀釋劑200-270g、助流劑40-70g和潤濕劑3-6g混勻后，與上述制備的300-600g粒毛盤菌胞外多糖混合均勻后分裝入1000粒1#空心膠囊內，制得膠囊劑1000粒；所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤濕劑采用十二烷基硫酸鈉或者磺基丁二酸二辛酯。
全文摘要
本發明公開了一種以粒毛盤菌胞外多糖作為制備預防胃潰瘍藥物的應用，將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌所產胞外多糖粉末用0.9%生理鹽水配置成劑量為100-400mg/mL的水溶液，給藥體積為10mL/kg，灌胃小鼠2周后，取胃，觀察并測定潰瘍面積，計算胃潰瘍指數，測定小鼠的胃蛋白酶活性、胃液量、胃液總酸度及小鼠血清中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量；本發明經實驗證實，菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011196的粒毛盤菌產胞外多糖不僅能有效預防小鼠胃潰瘍，且無毒副作用，其制備方法簡單經濟，故可將粒毛盤菌胞外多糖應用于制備成片劑或膠囊劑型預防胃潰瘍的藥物。
文檔編號C12R1/645GK102949409SQ201210443889
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者葉明 , 袁如月, 盧向中, 吳艷娜, 盧國忠, 葉劉生 申請人:合肥工業大學, 安徽盧氏生態科技有限責任公司