專利名稱：發酵聯動裝置及發酵聯動的實現方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵技術領域，特別涉及一種發酵聯動裝置及發酵聯動的實現方法。
背景技術：
生物發酵過程是以有生命活力的細胞為主題，給予特定的培養環境條件來生產有價值的目的產物的過程，發酵工藝條件的優化研究對于指導生產過程的順利有效開展起著非常重要的作用，現行的發酵工藝優化研究主要是在特定的發酵罐中通過分批發酵或連續 發酵試驗進行考察，或利用幾個發酵罐同時進行分批實驗考察，有的還對發酵罐裝備了多參數采集系統，來進行發酵過程的優化研究。由于發酵過程中微生物生理代謝特性的復雜性和受環境影響的變異不確定性，使得進行發酵工藝條件優化時批次數據之間的可比較性較差，因此對過程的優化結論帶來了較大的偏差或得到相反的結論，同時對于周期較長的抗生素發酵過程優化，整體優化所需的周期較長，不利于生產進度的推進和生產效益的快速提聞。為此，現有的方法是以不同發酵產品為對象形成了各種或通用的裝置技術系統和應用方法，如中國專利“一種發酵過程優化與放大的方法與裝置”(專利號200810042759.0)，其重點就是設計用于研究的裝置系統，通過發酵過程各種傳感器所獲得的數據以及計算機軟件包數據處理，把生物反應器中復雜的生物過程分解為不同尺度的特性研究，了解不同尺度的事件之間的關系，每個尺度都有不同的學科原理和變化規律，研究它們的量變到質變，以及由此形成的對復雜系統總體的影響，這樣才有可能解決發酵過程優化所面臨的局部與整體的關系，由此形成了一套基于參數相關分析的發酵過程多尺度問題研究的優化技術和發酵過程多參數調整的放大技術。總之，盡可能多的獲得發酵過程各層面的生物信息，然后以多尺度參數相關原理，通過計算機軟件的實時數據處理，在海量數據中找到以參數相關性特征為依據的過程優化關鍵參數，即敏感參數，進而用來指導發酵工藝操作，由此大大推動了發酵過程優化與放大技術的研究進展。但是以上裝置與方法只是從海量數據中找到過程優化依據的關鍵敏感參數，只是帶有方向性的研究工作，真正做到用于實際生產還需要做大量實驗工作，也就是說要在已取得的研究方向上進行細化研究，才能進一步取得優化的工藝操作條件或裝備放大設計。這些細化實驗工作所遇到的最大困難是每批試驗之間的可比性，試驗時要求初始細胞生理狀態一致性、反應器生長環境可比性、數據采集與分析比較的可信性。由于生命過程以及與外界環境之間關系的高度復雜關系，只要一個微小的變化就可能引起過程的差異，這個微小的變化有可能來自菌種的獲得與種子培養、不同的培養基原材料來源、滅菌操作的差異、操作條件的細微差異、不同發酵設備特性的差異、甚至員工的操作習慣等，這些細微變化引起的結果表現在獲得的發酵過程參數趨勢曲線的多樣性、時變性、相關耦合性與不確定性。因此，在如此復雜的多因素研究變化下，又是長達幾十到上百小時的發酵操作實驗，每批之間的數據可比性就成為大問題，為此，整個細化研究周期有時達數月或數年。即使如此，獲得的結果還總是存在各種疑惑，影響了有關生產或工程設計問題的決策。綜上所述，現有技術中的發酵裝置不能保證初始細胞生理狀態的一致性、反應器生長環境的一致性，因此數據采集與分析可信性是不夠的。另外，現有的發酵優化周期長，成本高。
發明內容
發酵過程是一個復雜的生命系統，其過程特征是包括生物信息在內的參數多樣性、參數時變性、參數之間的相關耦合性、以及過程參數變化的不確定性。為適應上述特點的過程研究，達到過程優化與放大的目的，設計聯動并行發酵培養裝置，當對發酵母罐發酵過程一定的階段的工藝控制條件進行優化時，將這個時刻的發酵培養液無菌轉入到并行的發酵子罐中，通過子罐的測控系統把發酵子罐中微生物的初始生理狀態調成與發酵母罐一致后，對發酵子罐進行不同考察因素或不同水平的控制，并對其生理代謝參數的變化進行實時采集，考察一定時間內發酵過程的代謝變化，得到該階段的最優化控制工藝，從而指導 發酵母罐的生產試驗研究。為了促進發酵過程實驗研究更加快速、準確地優化不同階段的發酵工藝條件，急需對不同階段的培養過程進行優化調整試驗，同時要保證在這個階段的影響因素考察時初始的微生物生理狀態具有一致性，且除待考察因素外，其他環境因素盡量保證一致性，這樣才能保證所得數據的可對比性。本發明的第一目的是為了解決現有技術中的問題，提供一種發酵聯動裝置，將發酵母罐中的發酵液在多個發酵子罐中進行優化，以實現其初始細胞生理狀態的一致性，且除待考察因素外，其他環境因素盡量保證一致性，以實現所得的數據具有可比性，同時各發酵母罐、發酵子罐的各控制參數進行集中采集分析，從而保證了得到的有關菌體生理或操作參數數據具有可靠性。本發明的第二目的是提供上述發酵聯動裝置的實現方法，以達到準確地優化發酵母罐不同培養階段的發酵工藝條件。為實現第一目的，本發明的技術方案是
一種發酵聯動裝置，其特征是，包括發酵母罐、發酵子罐、監控系統和分析系統，所述發酵母罐通過管道與所述發酵子罐相連，所述發酵母罐和發酵子罐分別與所述監控系統相連接，所述分析系統對所述監控系統測得的數據進行分析。進一步，所述發酵母罐為I至2個，所述發酵子罐為2至8個，優選4至8個，所述各發酵子罐并聯并通過管道連接到發酵母罐上。進一步，所述發酵子罐的容積為O. 25L至50L，所述發酵母罐的容積為50L至500L。進一步，所述發酵母罐的總容積為發酵子罐的總容積的2. 5至50倍。進一步，所述發酵子罐的容積為5L至50L，所述發酵母罐的容量為500L至120000L。進一步，所述發酵母罐的總容積為發酵子罐的總容積的2. 5至480倍。
進一步，所述每個發酵子罐的幾何形狀、容積和有關配件都相同。進一步，每個發酵子罐和發酵母罐均配有電機、攪拌器、傳感單元、安裝支架、工藝管道系統以及電氣控制柜，所述電氣控制柜通過其內的計算機芯片及電氣元器件對所述發酵子罐和發酵母罐進行控制。進一步，所述的傳感單元包括溫度傳感器、pH傳感器、溶解氧傳感器、全罐稱量傳感器、尾氣分析儀、測速傳感器、壓力傳感器、消泡傳感器和補料稱重傳感器，還包括細胞顯微在線觀察儀、活菌量傳感器、氧化還原電位ORP傳感器、菌濃OD傳感器及空氣流量傳感器中的一個或兩個以上。進一步，所述監控系統為三級計算機控制系統，其中第一級計算機控制系統對所述發酵母罐和發酵子罐形成的各參數的回路進行檢測與控制；第二級計算機控制系統對所述發酵母罐和發酵子罐中的單個罐體的參數進行數據采集、設定值控制與控制回路整定；第三級計算機控制系統對前兩級系統的參數進行參數綜合分析并輸出到終端。 為實現第二目的，本發明的技術方案是
上述發酵聯動裝置的發酵聯動的實現方法，其特征是包括如下步驟
第一步在所述發酵母罐中加入培養基、滅菌、接種和培養；
第二步通過所述分析系統對監控系統從發酵母罐中獲得的發酵過程多尺度參數進行相關分析；
第三步根據分析系統的分析結果確定影響發酵過程的關鍵敏感參數；
第四步將發酵母罐培養到預定階段；
第五步將發酵母罐中的培養液同體積輸送到多個發酵子罐中；
第六步根據發酵母罐確定的影響發酵過程的關鍵敏感參數，確定各子罐相應的控制參數，通過監控系統調節并控制各發酵子罐，并對各發酵子罐進行多參數采集；
第七步通過分析系統對發酵子罐中采集到的多參數進行相關分析，指導發酵母罐生產試驗。進一步，所述第五步之前包括對各發酵子罐及發酵母罐與發酵子罐的連接管道進行滅菌的步驟。進一步，所述第二步中的發酵過程檢測參數為直接參數和間接參數；
其中所述的直接參數包括直接在線檢測參數和離線手工檢測參數；
其中所述的直接在線檢測參數為溫度、攪拌轉速、通氣流量、罐壓、消泡、pH、溶解氧濃度、發酵液重量、補料量、尾氣氧濃度、尾氣二氧化碳濃度；
所述的離線手工檢測參數為菌量、殘糖濃度、比生長速率及NH2-N含量；
所述的間接參數為耗氧率OUR、二氧化碳釋放率CER、呼吸商RQ及體積氧傳遞速率K#。本發明的發酵聯動裝置可用于發酵過程時變操作條件研究(溫度，rpm、通氣、pH、DO、…)、發酵培養基配比與調整研究、發酵過程最佳補料系統與操作研究、菌絲形態與抗剪切研究、微量元素影響與調節、種齡、培養級數與種子質量研究、發酵設備特性研究、恒化特性與多級連續培養研究、菌體生理特性研究、基因工程比生長率與誘導因子研究、基因改造與生物學特性、生物過程轉錄、表達、調控技術與生物信息學研究、系統生物學或合成生物學底盤細胞生理特性研究，等等。本發明的有益效果是通過與發酵母罐相連的多個并行的發酵子罐，可以保證各發酵子罐初始生理狀態一致
性；
通過對各個子罐中除待考察因素外，其他環境因素盡量保證一致性，這樣才能保證所得數據的可對比性，從而保證了優化過程獲得的數據的可信性；
多個發酵子罐可以同時對多個影響敏感參數的因素進行高可信的優化研究，從而縮短研發周期，降低優化的成本；
各個發酵子罐與發酵母罐采用集中控制及數據集中采集與統一綜合分析，從而降低了每罐單獨分析可能造成的人為或軟件分析帶來了誤差，從而具有數據采集與分析比較的可信性。綜上所述，本發明的發酵聯動裝置克服了發酵過程復雜多因素研究變化以及幾十到上百小時的批發酵操作實驗所引起的數據可靠性問題，大大增加了實驗可信性，縮短了 長達數月或數年的過程優化研究周期。
附圖I為發酵聯動裝置示意 附圖2為發酵聯動實現方法的流程 附圖3為發酵聯動框圖。附圖中的標記分別為
I.發酵母罐；2.發酵子罐；
3.攪拌器；4.接種之后的發酵液；
201-207.框圖步驟。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明發酵聯動裝置及發酵聯動的實現方法的具體實施方式
作詳細說明。參見附圖1，發酵母罐I與多個發酵子罐2通過管道進行連接，多個發酵子罐并聯連接后與發酵母罐I相連，形成發酵聯動裝置，各個發酵子罐2與發酵母罐I之間設置閥門等管件來控制發酵子罐2與發酵母罐I之間的連通，并可以對培養液從發酵母罐I輸送至發酵子罐2的過程進行控制，保證發酵子罐2中的接種后的發酵液4和發酵母罐I中的發酵液相同，且各子罐間發酵液的量相同，即保證了各個發酵子罐中的菌體的初始生理狀態的一致性。發酵聯動裝置還包括監控系統和分析系統，發酵母罐I和發酵子罐2分別與監控系統相連接，分析系統對監控系統測得的數據進行分析。多個發酵子罐2的數量為4至8個，發酵母罐一般為一個，也可設置兩個連接在一起。每個發酵子罐2的容積為2L至50L，每個發酵母罐的容積為50L至500L，優選發酵母罐I的總容積為發酵子罐2總容積的I至4倍。為了保證每個發酵子罐2的除待考察環境參數一致性，每個發酵子罐2的幾何形狀、容積和有關配件(圖中只示出了攪拌器3)都相同。發酵母罐I和發酵子罐2均配有相關配件包括電機、攪拌器3、傳感單元、安裝支架、工藝管道系統以及電氣控制柜，電氣控制柜通過其內的計算機芯片及電氣元器件對發酵子罐和發酵母罐進行控制。其中傳感單元包括溫度傳感器、PH傳感器、溶解氧傳感器、全罐稱量傳感器、尾氣分析儀接口、測速傳感器、壓力傳感器、消泡傳感器、補料稱重傳感器、細胞顯微在線觀察儀、活菌量傳感器、氧化還原電位ORP傳感器、菌濃OD傳感器、空氣流量傳感器。電子監控系統包括三級計算機控制系統，其中第一級系統對單回路參數如溫度、轉速、通氣量、pH、DO、補料稱重、罐體稱重等進行檢測與控制；第二級系統對各個單罐參數如溫度，攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，PH，溶解氧濃度，發酵液重量，補料量設定值控制，包括實施數據顯示、電極自動標定、回路整定等參數進行檢測與控制；第三級系統對各個罐的狀態參數集中進行顯示和控制。數據分析系統即為可視化綜合數據分析與過程研究用軟件包(滬DGY-2007-0798)，可以在多終端顯示，并根據研究需要可在不同終端顯示不同畫面。參見附圖2，發酵聯運的實現方法包括步驟如下第一步在所述發酵母罐中加入培養基、滅菌、接種和培養(圖中第201步)；
第二步通過所述分析系統對監控系統從發酵母罐中獲得的發酵過程多尺度參數進行 相關分析(圖中第202步)；
第三步根據分析系統的分析結果確定影響發酵過程的關鍵敏感參數(圖中第203
步)；
第四步將發酵母罐培養到預定階段(圖中第204步)；
第五步將發酵母罐中的培養液同體積輸送到多個發酵子罐中(圖中第205步)；第六步根據發酵母罐確定的影響發酵過程的關鍵敏感參數，確定各子罐相應的控制參數，通過監控系統調節并控制各發酵子罐，并對各發酵子罐進行多參數采集(圖中第206步)；
第七步通過分析系統對發酵子罐中采集到的多參數進行相關分析，指導發酵母罐生產試驗(圖中第207步)。在第二步中的發酵過程多尺度參數包括直接參數和間接參數；
其中所述的直接參數包括直接在線檢測參數和離線手工檢測參數；
所述的直接在線檢測參數為溫度、攪拌轉速、通氣流量、罐壓、消泡、pH、溶解氧濃度、發酵液重量、補料量、尾氣氧濃度、尾氣二氧化碳濃度；
所述的離線手工檢測參數為菌量、殘糖濃度、比生長速率及NH2-N含量；
所述的間接參數為耗氧率、二氧化碳釋放率、呼吸商及體積氧傳遞速率。參見附圖3，聯動實驗過程是，發酵母罐進行滅菌處理后，在發酵母罐中配制培養基并滅菌后接種，經前期發酵獲得影響發酵過程的關鍵敏感參數后移種至已經消過毒的多個發酵子罐中，從而保證了發酵子罐中初始的菌體生理狀態的一致性，調節各發酵子罐的操作參數，對發酵子罐進行除待考察因素外，其他環境因素盡量保證一致性的培養，根據影響發酵過程的關鍵敏感參數的不同條件對各個發酵子罐進行優化培養研究，培養后獲得菌體的宏觀代謝曲線，用于指導發酵母罐生產試驗研究。實施例I :
4個并行的5L發酵子罐、還包括I個50L發酵母罐和電子監測控制系統與數據分析系統，發酵母罐通過管道與發酵子罐的各罐相連，用以實現從母罐內將發酵液輸送到各個子罐中，發酵子罐的各發酵罐和發酵母罐的發酵罐都能夠實現發酵過程中pH、DO、體積、尾碳濃度、尾氧濃度、攝氧率(OUR)、二氧化碳釋放速率(CER)、呼吸商(RQ)、活細胞濃度等參數的在線采集與對比分析。
利用本發明對莢膜紅單胞菌iRhodopseudomonas capsulatus)輔酶QlO生產過程的中試研究；
菌種莢膜紅單胞菌(選用浙江新和成生物醫藥公司的菌種)。具體步驟為
(1)菌種傳代培養基為2%的酵母膏培養基，培養基溫度為30°C，培養時間為72小時，至長出深藍色菌落；
(2)菌種擴大培養將步驟(I)的菌種接入已滅菌的種子罐，進行兩級培養，在無光照的條件下，控制溫度為28 30°C，攪拌100 300rpm，壓力為O. 02 O. 05Mpa，培養20 24小時； (3)發酵補料培養在無菌條件下，將步驟(2)培養出的種子液接入發酵罐，在無光照的條件下，控制發酵溫度28 32°C，攪拌100 300rpm，壓力O. 02 O. 05Mpa，培養時間100 120小時，在發酵過程進行葡萄糖溶液(含O. 15%的磷酸二氫鉀溶液)連續補加維持糖濃度O. 7%、pH用氨水控制在6. 7，發酵培養108h ；
其中步驟(2)中種子罐的培養基配方，按質量百分比計為硫酸銨O. 10 O. 50%、硫酸鎂O. 10 O. 50%、磷酸二氫鉀O. 02 O. 10%、葡萄糖O. 30 I. 00%、玉米漿粉O. 02 O. 10%、碳酸鈣O. 35 O. 90%、維生素BI O. 001 O. 01%，余量為水，pH值6. 8，培養基滅菌溫度為118 121°C，時間為30分鐘；
其中步驟(3)中發酵罐的培養基配方，按質量比計為葡萄糖2. 50 4. 50%、玉米漿粉O. 80 I. 30%、硫酸銨O. 10 O. 50%、磷酸二氫鉀O. 05 O. 30%、硫酸鎂O. 50 2. 00%，余量為水，pH值6. 8，培養基滅菌溫度為118 121°C，時間為30分鐘。通過50L發酵母罐進行發酵實驗，通過參數相關性分析發現影響發酵過程的敏感參數為過程的氧消耗速率(OUR)，氧限制是影響發酵過程產物合成代謝和菌體生長代謝的關鍵。而氧消耗速率受到氧傳遞速率的控制；因此將處于合成期的培養液在4個并行的發酵子罐上進行不同氧傳遞速率控制實驗考察，當培養周期為38h時，將發酵培養液通過無菌管道轉移到4個聯動并行的5L發酵子罐培養系統中(2. 5L/子罐)，發酵子罐調整一致的轉速和總通氣量，通過調整子罐中空氣和純氧的比例，將4個發酵子罐控制在不同的OUR水平(75mmol/L/h, 65mmol/L/h, 55mmol/L/h, 45mmol/L/h),培養 10 小時后考察考察英膜紅單胞菌從生長期轉向合成期是最佳的氧消耗速率控制。實驗結果顯示，發酵子罐能夠很好的進行氧消耗速率OUR等的采集和控制，OUR的控制誤差小于4. 5%，對比試驗測試結果表明，在該階段將OUR控制在55mmol/L/h的水平對促進菌體生長和產物合成最有利，而且轉化率明顯高于其他控制水平，其結果如下表所示參數OUR水平
OUR 1 niinoi+.L 1} 575655545
產率(mg/L/h)28,2 37,4 43.739,8
菌侔比生長速率(g/g)0.0410.029 0.0230.018
糖耗 < g *SHZgO10 )234.3194.8 168.1178.9
最終結果再用于指導50L發酵母罐的生產，在輔酶QlO的發酵過程中，當菌體濃度(在線活細胞)轉入穩定期時，通過攪拌將OUR控制在55±2mmol/L/h，放罐點104小時，產物濃度達到 2780 ±45mg/ml，其產量比對照(2463 ±59mg/ml)提高了 12. 9%。 采用本發明技術方案，充分縮短了分批考察多個OUR控制水平所需的時間，同時保證了考察的菌體初始生理狀態一致性和實驗結果的可對比性，提高了實驗效率。實施例2:
采用8個并行的5L發酵子罐、I個500L發酵母罐組成的實驗裝置，利用該組合可以考察發酵過程中特定階段剪切應力和關鍵因素環境溫度的變化對發酵代謝的影響。本實施例對利福霉素發酵過程的優化研究，生產菌株為地中海諾卡氏菌iNocardia et/iterraflei),其實驗步驟如下
(I)斜面培養基(％ ):蔗糖 3.0，蛋白胨 O. 5，KCl 0.05，FeSO4 0.001，KH2PO4 O. I,MgSO4 · 7H20 O. 05，瓊脂I. 8，pH7. 0，余量為水。將種子劃線接種到裝有斜面培養基的平板中，28°C，培養時間為48小時，相對濕度30—60%，培養周期12 15d。(2)種子培養基):葡萄糖2. 0，豆餅粉I. 0，蛋白胨I. 0，KH2PO4 O. 01，KNO3O. 05，余量為水。培養溫度28°C，培養時間48h。將步驟(2)的菌種接入已滅菌的種子罐，進行兩級培養，控制溫度為28 30°C，攪拌250 400rpm，壓力為O. 02 O. 05Mpa，培養20 24小時；
(3)發酵培養基)葡萄糖11.0，魚粉O. 5，豆餅粉I. O, KNO3 O. 8，KH2PO4 O. 02，CaCO3 O. 5，氯化鈷3 μ g/ml，余量為水。發酵補料培養在無菌條件下，將步驟(2)培養出的種子液接入發酵母罐，在無光照的條件下，控制發酵溫度28 32°C，壓力O. 02 O. 05Mpa,培養時間100 120小時，在發酵過程進行葡萄糖溶液(含O. 15%的磷酸二氫鉀溶液)連續補加維持糖濃度O. 7%、pH用氨水控制在6. 7，發酵培養108h ；
(4)聯動并行實驗裝備，從分裝后開始計時，培養一定周期的時間后，放罐進行過程參數的分析。通過發酵子罐進行多參數采集，同時能更好地實現從過程動態的角度優化關鍵因素的調控工藝。各發酵子罐在不同剪切力(轉速400、500、600、700rpm)的情況下，隨著剪切力的增力口，地中海擬分枝桿菌發酵液中菌球的直徑迅速變小，當轉速高于600rpm時，菌體成散落的絲網狀菌絲存在，盡管溶解氧濃度都在臨界氧濃度35%以上，但產物的合成速率顯著下降,在500rpm的剪切力下的菌體形態產物合成速率最快。
同時溫度也是利福霉素發酵過程中一個關鍵的影響因素，溫度直接影響著菌體胞內代謝活力及對氧的攝取速率，各發酵子罐分別控制26、27、28、29°C，可以看出隨著培養溫度的升高氧消耗速率也隨之升高當溫度控制在28°C時，氧的消耗速率在14. 5mmol/L/h，產物的合成速率最快為125mg/L/h。可見利用8聯并行發酵罐系統進行發酵過程中所得關鍵影響因子最佳控制水平的優化，對于縮短研發時間和科研工作效率起著非常重要的作用。實施例3
4個2L發酵子罐、I個50L發酵母罐組成的實驗裝置，利用該組合可以考察乳酸、乙醇、己酸等微耗氧和厭氧發酵過程不同階段的PH值控制策略優化。將50L或更大的生產罐培養到特定階段的培養液無菌轉接到無菌的2L發酵子罐中，通過調整進氣中空氣和氮氣的比例，并結合采集到的每個發酵子罐和發酵母罐的發酵過程參數信息，控制每個發酵子罐中的菌體狀態與發酵母罐相一致，然后改變子罐中不同的PH控制水平，培養一段時間后，進行多參數相關分析，得到在該階段最優的PH控制策略，用于指導發酵母罐的生產。 實施例4
采用5個50L發酵子罐、I個120噸(體積為120000L)發酵母罐聯動并行發酵試驗，進行葡萄糖酸工業發酵過程優化研究，利用該組合可以考察發酵過程中維持不同糖濃度對過程氧傳遞和發酵代謝的影響研究。培養條件黑曲霉(上海工業微生物研究所黑曲霉M276)。培養基
(I)斜面培養基，按每升計算，葡萄糖8g、酵母膏2g、蛋白胨2g、MgSO4 0.2 g、NaH2PO4O. 19g、KH2PO4 O. lg、MnSO4 0. Olg、瓊脂I. 5g，余量為水。將保藏管中的菌種接種于斜
面培養基上，在培養箱中培養，28 °C，培養3天。(2)種子培養基，按每升計算，葡萄糖 609g、MgSO4 O. 029g、NaH2PO4O. 19g、KH2PO4O. lg、MnSO4 0. Olg，余量為水。在無菌操作臺上用接種環刮下菌體接種于15L搖瓶中，培養24h,轉速420rpm,30°C。采用兩級發酵過程控制。(3)基礎發酵液，按每升計算，葡萄糖 100g、MgS04 O. 03g、KH2P04 O. 2g> (NH4)2HPO4O. 9g, MnSO4 0.06g、CaCO3 2. 69g (單獨滅菌)，余量為水。將步驟(2)中的種子液按10%的接種量到裝有85噸發酵培養基生產罐中，32°C、控制OUR在158的水平，培養32小時。將120噸發酵母罐培養到8小時(菌體生長進入穩定期，產物開始快速合成)的發酵液分別無菌轉接30升到無菌的50升發酵子罐中，通過與發酵母罐生理代謝曲線的對t匕，調整50L發酵子罐中的控制條件，使得達到與發酵母罐一致的代謝狀態，然后通過改變補料糖液的補加速率，使發酵子罐中的糖濃度控制在不同的濃度水平，分別為1±0. 4%、3±0. 6%、7±0. 6%、9±0. 8%、14±0. 9%并控制每個發酵子罐具有相同的溫度、轉速、通氣量和攪拌形式等條件，觀察底物濃度對氧傳遞和菌體代謝的影響。結果表明，初始生理代謝狀態一致的發酵液，在相同的控制條件下，底物葡萄糖濃度的變化對發酵過程氧傳遞速率影響非常顯著，當葡萄糖濃度降到6%以下時，能明顯促進培養液中氧傳遞的效果，溶氧隨著葡萄糖濃度降低呈略微上升趨勢，從而帶來菌體的氧消耗速率OUR大幅度上升。當葡萄糖濃度控制在1±0. 4%時OUR明顯較高，糖消耗速率較快，葡糖糖酸的合成速率達到了 22. 4g/L/h，當葡萄糖濃度控制在3±0. 6%、7±0. 6%、9±0. 8%和 14±0· 9% 時的合成速率分別為 15. 4 g/L/h、12. 2 g/L/h、9. 6 g/L/h 和 9. 4 g/L/h，可見當葡萄糖濃度高于9%時氧傳遞效果明顯較差，而且不再隨葡萄糖的濃度變化而變化。因此在葡糖糖酸的發酵生產中，控制合適的葡萄糖補加策略對提高產率和節能降成本方面非常關鍵。實施例5
采用4個250mL發酵子罐、I個50L發酵母罐聯動并行發酵試驗，進行維生素B12發酵過程優化研究，利用該組合可以考察發酵過程中維持供氧水平對發酵代謝的影響研究。(I)生產菌脫氮假單胞菌(石家莊制藥集團華榮公司AL-0125)。
(2)種子培養基(g/L):蔗糖 40，玉米漿 20，甜菜堿 5，(NH4)2SO4 1，(NH4)2HPO42，MnSO4 · H2O O. 8，CoCl · 6H20 O. 02，MgO O. 3，DMBI O. 01，ZnSO4 · 7H20 O. 01，pH 7. 2-7. 4 ；
(3)發酵培養基(g/L):蔗糖 80，玉米漿 45，甜菜堿 14，(NH4)2SO4 I, KH2PO4 O. 75,CoCl · 6H20 O. 075，MgO O. 5，DMBI O. 05，ZnSO4 · 7H20 O. 08，CaCO3 1，pH 7. 2-7. 4 ；
補料培養基 I (g/L):葡萄糖 500，DMBI O. 15，CoCl · 6H20 O. 15，pH 自然;
補料培養基 2 (g/L):甜菜堿 30，DMBI O. 4，CoCl · 6H20 O. 3，pH6. 2-6. 5。(4)菌懸液制備用無菌水洗滌培養好的斜面，制成菌濃為IO8個細胞每毫升的菌懸液。(5)母瓶種子培養將制好的菌懸液接種2ml到母瓶培養基中，裝量100ml/500ml，32°C，轉速 260rpm，培養 20-22 小時。(6)50L發酵母罐培養將培養好后鏡檢無菌的母瓶種子液1250ml并瓶到無菌的2L三角瓶中，火焰保護接種到裝有25L培養基的50L發酵母罐中，培養條件為二級攪拌漿，32°C，通氣量20L/min，發酵過程中根據菌體生長情況開始連續補加葡萄糖和甜菜堿料液培養基。將50L發酵母罐培養到110小時(菌體處于產物快速合成期)的發酵液分別無菌轉接150ml到無菌的250mL發酵子罐中，通過在線采集參數的對比，通過轉速調節，控制四個平行的發酵子罐處于不同的OUR水平(因為脫氮假單胞菌對氧的高親和力，培養中后期，溶氧濃度一直為O的最低水平，因此OUR的高低就反映了不同的供養水平的高低)，并使得其中2號發酵子罐的OUR水平與50L發酵母罐一致，控制在33±0. 8mmol/L/h，其它三個分別控制在 15±0. 7mmol/L/h、24±0. 9mmol/L/h 和 41 土 I. lmmol/L/h,并控制每個發酵子罐具有相同的溫度、通氣量和攪拌形式等條件，觀察不同供氧水平對菌體代謝的影響。結果表明，初始生理代謝狀態一致的發酵液，不同的供氧水平對發酵代謝變化影響非常顯著，在維持氧消耗速率水平在控制在33±0. 8mmol/L/h的50L發酵母罐和4個250mL的發酵子罐組成的聯動發酵罐中，底物葡萄糖的消耗速率、產物的合成速率、產物對葡萄糖的轉化率都非常一致。在4臺控制不同供氧水平的并行4臺250ml的發酵子罐中的考察結果顯示，當供氧水平調節以維持OUR水平為24±0. 9mmol/L/h時，維生素B12的合成速率、轉化率為最高，而維持OUR水平為15 ± O. 7mmol/L/h情況下糖耗速率明顯降低，產物合成速率比24±0. 9mmol/L/h時低了 29%。隨著供氧水平的繼續增加，糖的消耗速率顯著增力口，但維生素B12的合成速率和轉化率呈現明顯下降的趨勢。不同供氧水平對發酵過程參數的影響
權利要求
1.一種發酵聯動裝置，其特征在于包括發酵母罐、發酵子罐、監控系統和分析系統，所述發酵母罐通過管道與所述發酵子罐相連，所述發酵母罐和發酵子罐分別與所述監控系統相連接，所述分析系統對所述監控系統測得的數據進行集中分析。
2.根據權利要求I所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述發酵母罐為I至2個，所述發酵子罐為4至8個，所述發酵子罐通過管道并聯連接到發酵母罐上。
3.根據權利要求2所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述發酵子罐的容積為O.25L至5L，所述發酵母罐的容積為50L至500L。
4.根據權利要求3所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述發酵母罐的總容積為發酵子罐的總容積的2. 5至50倍。
5.根據權利要求2所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述發酵子罐的容積為5L至50L，所述發酵母罐的容量為500L至120000L。
6.根據權利要求5所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述發酵母罐的總容積為發酵子罐的總容積的2. 5至480倍。
7.根據權利要求2所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述每個發酵子罐的幾何形狀、容積和有關配件都相同。
8.根據權利要求2所述的發酵聯動裝置，其特征在于每個發酵子罐和發酵母罐均配有電機、攪拌器、傳感單元、安裝支架、工藝管道系統以及電氣控制柜，所述電氣控制柜通過其內的計算機芯片及電氣元器件對所述發酵子罐和發酵母罐進行控制。
9.根據權利要求8所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述的傳感單元包括溫度傳感器、PH傳感器、溶解氧傳感器、全罐稱量傳感器、尾氣分析儀、測速傳感器、壓力傳感器、消泡傳感器和補料稱重傳感器。
10.權利要求9所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述的傳感單元還包括細胞顯微在線觀察儀、活菌量傳感器、氧化還原電位傳感器、菌濃傳感器及空氣流量傳感器中的一個或兩個以上。
11.根據權利要求I至10中任一項所述的發酵聯動裝置，其特征在于所述監控系統為三級計算機控制系統，其中第一級計算機控制系統對所述發酵母罐和發酵子罐形成的各參數的回路進行檢測與控制；第二級計算機控制系統對所述發酵母罐和發酵子罐中的單個罐體的參數進行數據采集、設定值控制與控制回路整定；第三級計算機控制系統對前兩級系統的參數進行參數綜合分析并輸出到終端。
12.利用如權利要求I至11中任一項發酵聯動裝置進行發酵聯動的實現方法，其特征在于包括如下步驟 第一步在所述發酵母罐中加入培養基、滅菌、接種和培養； 第二步通過所述分析系統對監控系統從發酵母罐中獲得的發酵過程多尺度參數進行相關分析； 第三步根據分析系統的分析結果確定影響發酵過程的關鍵敏感參數； 第四步將發酵母罐培養到預定階段； 第五步將發酵母罐中的培養液同體積輸送到多個發酵子罐中； 第六步根據發酵母罐確定的影響發酵過程的關鍵敏感參數，確定各子罐相應的控制參數，通過監控系統調節并控制各發酵子罐，并對各發酵子罐進行多參數采集；第七步通過分析系統對發酵子罐中采集到的多參數進行相關分析，指導發酵母罐生產試驗。
13.根據權利要求12所述的發酵聯動的實現方法，其特征在于所述第五步之前包括對各發酵子罐及發酵母罐與發酵子罐的連接管道進行滅菌的步驟。
14.根據權利要求12所述的發酵聯動的實現方法，其特征在于所述第二步中的發酵過程多尺度參數包括直接參數和間接參數； 其中所述的直接參數包括直接在線檢測參數和離線手工檢測參數； 所述的直接在線檢測參數為溫度、攪拌轉速、通氣流量、罐壓、消泡、pH、溶解氧濃度、發酵液重量、補料量、尾氣氧濃度及尾氣二氧化碳濃度； 所述的離線手工檢測參數為菌量、殘糖濃度、比生長速率及NH2-N含量； 所述的間接參數為耗氧率、二氧化碳釋放率、呼吸商及體積氧傳遞速率。
全文摘要
本發明公開了一種發酵聯動裝置及利用該發酵聯動裝置進行發酵聯動的實現方法，所述的發酵聯動裝置包括發酵母罐、發酵子罐、監控系統和分析系統，所述發酵母罐通過管道與所述發酵子罐相連，所述發酵母罐和發酵子罐分別與所述監控系統相連接，所述分析系統對所述監控系統測得的數據進行集中分析。通過本發明的一種發酵聯動裝置對發酵過程的優化可以縮短研發周期，降低優化的成本。
文檔編號C12M1/00GK102965272SQ201210446219
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者王澤建, 張劍坤, 張明, 張嗣良, 儲炬, 莊英萍, 郭美錦, 黃明志, 夏建業, 杭海峰 申請人:華東理工大學, 上海國強生化工程裝備有限公司