專利名稱：2-酮基-l-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及維生素C的制備方法，具體地說是一種2-酮基-L-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝。
背景技術：
目前，我國的維生素C生產廠家均采用二步發酵生產技術。其主要特點是二步發酵過程由兩種菌混合培養完成的。其中普通生酮基古龍酸菌將山梨糖轉化為2-KLG，普通生酮基古龍酸菌俗稱小菌，是產酸菌，另一種菌為巨大芽孢桿菌，促進小菌生長與產酸，巨大芽孢桿菌俗稱大菌，是伴生菌。兩種菌共同作用，將山梨糖轉化為2-KLG。公知的2-KLG發酵的菌種制作技術中:從保藏菌種活化，到種液擴大培養和發酵過程中，大、小菌一直是混合搭配使用。采用混合菌發酵，由于是兩種菌種同時培養，大菌生長過程中產生的酶一方面對小菌有促進作用，另一方面，其本身的生長和代謝也會對小菌生長造成拮抗作用。同時，由于是混合培養，對小菌的遺傳改良、篩選和保藏極為不便，也不利于對菌種培養和發酵過程的無菌度管理。
發明內容
本發明的目的是提供一種2-酮基-L-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝，可以避免原工藝中大、小菌混合培養、發酵時巨大芽孢桿菌對小菌生長的負面影響，有利于對小菌的遺傳改良、篩選、培養、保藏和對菌種生長代謝過程的管理，縮短發酵周期。本發明是這樣實現的:2_酮基-L-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝，其特征在于:在菌種制備和發酵過程中，將巨大芽孢桿菌、普通生酮基古龍酸菌分開培養，先將巨大芽孢桿菌在液體培養基中培養至終點后，制成細胞裂解液，備用；再將單獨保藏的普通生酮基古龍酸菌活化培養，分離篩選，繼續接種到斜面和種液擴大培養，然后接入發酵培養基中發酵。將巨大芽孢桿菌裂解液按3 30%接種量分別加入普通生酮基古龍酸菌各級培養物中，促進普通生酮基古龍酸菌的正`常生長代謝。本發明可以避免原工藝中大、小菌混合培養、發酵時大菌對小菌生長的負面影響，有利于對小菌的遺傳改良、篩選、培養、保藏和對菌種生長代謝過程的管理，縮短發酵周期。
具體實施例方式2-酮基-L-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝，其特征在于:在菌種制備和發酵過程中，將巨大芽孢桿菌、普通生酮基古龍酸菌分開培養，先將巨大芽孢桿菌在液體培養基中培養至終點后，制成細胞裂解液，備用；再將單獨保藏的普通生酮基古龍酸菌活化培養，分離篩選，繼續接種到斜面和種液擴大培養，然后接入發酵培養基中發酵。將巨大芽孢桿菌裂解液按3 30%接種量分別加入普通生酮基古龍酸菌各級培養物中，促進普通生酮基古龍酸菌的正常生長代謝。具體實施時，本發明可以避免原工藝中大、小菌混合培養時大菌對小菌生長的負面影響，有利于對小菌的遺傳改良、篩選、培養、保藏和對菌種生長發酵過程的管理，消除了發酵過程中大菌生長時間，縮短發酵周期。新工藝保留原工藝主要過程，只需要對大菌培養液進行裂解處理，即可實現小菌的單獨培養和發酵，不需要增添新設備，亦不需要改造原設備，菌種不變，操作簡便，易廣泛應用。下面通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1
先將小菌單獨接種到裝量70ml的茄瓶斜面培養基中，同時加入5ml大菌裂解液，培養72小時，將培養好的純小菌斜面用冷凍真空干燥法制作冷凍管保藏，純小菌冷凍管低溫保藏2年后，存活率達85%以上。將保藏的小菌冷凍管通過液體種子培養基活化培養40小時后，將活化種液稀釋至10_7，涂布接種至分離平皿上，培養72小時，生成單個小菌菌落，挑選出若干優良小菌，接種至裝量70ml的茄瓶斜面培養基中，培養72小時，將培養好的純小菌斜面接種到液體種子培養基中，培養24小時，得到純小菌培養液。在以上各級小菌培養物中分別按5%接種量加入大菌裂解液。將培養好的小菌培養液IOml，接入到80ml發酵培養基中，另加入5ml大菌裂解液，發酵搖瓶容積750ml，搖床轉速210rpm，發酵液終點2-KLG含量77.36mg/ml，發酵周期54小時，較混合菌種發酵縮短6小時。實施例2
先將小菌單獨接種到裝量70ml的茄瓶斜面培養基中，同時加入5ml大菌裂解液，培養72小時，將培養好的純小菌斜面用冷凍真空干燥法制作冷凍管保藏，純小菌冷凍管低溫保藏2年后，存活率達85%以上。將保藏的小菌冷凍管通過液體種子培養基活化培養40小時后，將活化種液稀釋至10_7，涂布接種至分離平皿上，培養72小時，生成單個小菌菌落，挑選出若干優良小菌，接種至裝量70ml的茄瓶斜面培養基中，培養72小時，將培養好的純小菌斜面接種到液體種子培養基中，培養22小時，得到純小菌培養液。在以上各級小菌培養物中分別按10%接種量加入大菌裂解液。將培養好的小菌培養液10ml，接入到80ml發酵培養基中，另加入IOml大菌裂解液，發酵搖瓶容積750ml，搖床轉速210rpm，發酵液終點2-KLG含量79.21mg/ml，發酵周期52小時,較混合菌種發酵縮短8小時。顯然，本發明不限于這些公開的實施例，本發明將覆蓋技術方案所描述的范圍，以及權利要求范圍的各種變形和等效變化，在不偏離本發明的技術解決方案的前體下，對本發明所作的本領域技術人員容易實現的任何修改或改進均屬于本發明所要求保護的范圍。
權利要求
1.2-酮基-L-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝，其特征在于:在菌種制備和發酵過程中，將巨大芽孢桿菌、普通生酮基古龍酸菌分開培養，先將巨大芽孢桿菌在液體培養基中培養至終點后，制成細胞裂解液，備用；再將單獨保藏的普通生酮基古龍酸菌活化培養，分離篩選，繼續接種到斜面和種液擴大培養，然后接入發酵培養基中發酵；巨大芽孢桿菌裂解液按3 30%接種量分別加入普通生酮基 古龍酸菌各級培養物中，促進普通生酮基古龍酸菌的正常生長代謝。
全文摘要
2-酮基-L-古龍酸發酵的單菌種制備和發酵工藝，在菌種制備和發酵過程中，將巨大芽孢桿菌、普通生酮基古龍酸菌分開培養，先將巨大芽孢桿菌在液體培養基中培養至終點后，制成細胞裂解液，備用；再將單獨保藏的普通生酮基古龍酸菌活化培養，分離篩選，繼續接種到斜面和種液擴大培養，然后接入發酵培養基中發酵。將巨大芽孢桿菌裂解液按3~30%接種量分別加入普通生酮基古龍酸菌各級培養物中，促進普通生酮基古龍酸菌的正常生長代謝。本發明可以避免原工藝中大、小菌混合培養、發酵時大菌對小菌生長的負面影響，有利于對小菌的遺傳改良、篩選、培養、保藏和對菌種生長代謝過程的管理，縮短發酵周期。
文檔編號C12R1/01GK103114107SQ201210450138
公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者劉杰, 胡少斌, 陳紅, 常芳 申請人:江蘇江山制藥有限公司