專利名稱：一種利用糖質原料連續發酵生產丁醇的方法
技術領域：
本發明提供了一種利用糖質原料連續發酵生產丁醇的方法，屬于生物工程技術領域。具體涉及米用丙酮丁醇梭菌(Oo1Sirit/i應saccharobutylicum)DSM 13864,以葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液等糖質原料連續發酵生產丁醇的方法。
背景技術：
丁醇作為一種重要的四碳平臺化合物，具有非常廣泛的用途，主要用于醋酸丁酯、鄰苯二甲酸正丁酯(DBP)、丙烯酸丁酯、脂肪二元酸和磷酸類增塑劑等的制造。丁醇還是油月旨、醫藥和樹脂等工業中重要的添加劑，也是香料、染料和印刷工業中常用的溶劑、脫蠟劑
坐寸ο近年來，丁醇被認為是繼生物柴油、生物乙醇之后出現的一種最具發展潛力的生物燃料。與其它生物燃料相比，生物丁醇有許多顯著的優勢丁醇可以和汽油以任意比混合，在不改造汽車發動機的條件下，汽車幾乎可以直接使用丁醇，而乙醇與汽油的摻混比為15%，甲醇為10% ;丁醇的熱值和辛烷值與汽油更接近，能量密度較高，是乙醇的I. 3倍；丁醇的親水性較弱，與汽油混合后蒸汽壓較低、腐蝕性較小，可實現管道便捷輸送；丁醇燃燒時不會有SOx或NOx等傳統化石液體燃料所產生的環境污染廢氣；另外，丁醇也可以作為各種燃料的添加劑。發酵法生產丁醇可以追溯到第一次世界大戰期間，其規模曾僅次于乙醇發酵。傳統的分批發酵法生產丁醇存在產物對菌體有毒害、溶劑總濃度低、生產率和得率低等缺點。在中國，傳統的發酵法生產丙酮丁醇主要是以玉米等糧食類淀粉質原料為底物(ApplMicrobiol Biotechnol, 83:415 - 423，2009)，生產成本較高。為降低生產成本，近年來許多高校和研究機構開始研究采用各種價廉的糖質原料代替糧食淀粉質原料發酵生產丙酮丁醇(Qureshi N, et al, Biomass Bioenergy, 34:559-565，2010 ；Qureshi N, et al, Biofuels, Bioprod. Bioref. 2, 319 - 330,2008 ；ffang L, et al, Process Biochem.46，604 - 607，2011)，這些報道采用的均為分批發酵的操作方式。近年也有關于連續發酵生產丙酮丁醇的研究報道，連續發酵生產率較分批發酵高，但是總溶劑產量往往較低，如Lee等人采用固定化細胞以葡萄糖為原料的連續發酵，當稀釋率為O. 04 時，獲得10_13g/L 丁醇，生產率達到 O. 4 g/(L*h) (Lee SM, et al, Energy Fuels, 22:3459 - 3464,2008)。Richter 等以 67ossaccharoperbutylacetonicum Nl-4 為發酵菌種，丁酸和葡萄糖為底物，采用耦合氣提兩級連續發酵的操作方式，在O. 025 h—1的稀釋率下獲U 15. 7 g/L 的總溶劑，丁醇生產率為 O. 39 g/(L.h) (Richter H, et al, Biotechnol.Bioeng. 109 :913 - 921，2011)。Malaviya 等米用 CViosirii//應 pasteurianum ATCC6103菌株，以甘油為底物，采用細胞循環連續發酵的操作方式，在O. 9 h—1的稀釋率下獲得了 9. 2g/L 的總溶劑，丁醇的生產率為 7. 8 g/(L.h) (Malaviya A, et al, AppI. Microbiol.Biotechnol. 93，1485 - 1494, 2012)。連續發酵通過不斷地補加新鮮的培養基同時排出等量的發酵醪液，使菌體處于穩定的生長狀態，與其它的發酵方式相比可以縮短發酵周期，提高設備利用率，降低溶劑對菌體的毒害作用，提高溶劑的生產率。本發明以saccharobu tyli cum DSM 13864為發酵菌種，采用多級連續發酵的操作模式，發酵的原料采用廉價的糖質原料，如糖蜜和玉米秸桿水解液等，既降低了原料成本又獲得了較高的生產率。到目前為止還沒有利用玉米秸桿水解液或糖蜜連續發酵生產丁醇的工業化生產實例。·
發明內容
本發明的目的在于，為工業化發酵生產丁醇提供一種生產成本低、生產強度高、易于自動化操作的連續發酵生產新方法；為使用廉價原料連續發酵生產丙酮丁醇提供一種方法依據。為實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案一種利用糖質原料連續發酵生產丁醇的方法，采用多個發酵罐串聯組合成多級連續發酵裝置，多級連續發酵裝置的級數N為4-6,步驟為
(1)種子的活化
菌種丙酮丁醇梭菌(CViosirii/itt saccharobuty licum') DSM 13864,購于德國微生物菌種保藏中心。將C saccharobu tyli cum DSM 13864菌株孢子懸液以1%_10%的接種量接入種子培養基(RCM培養基)中，置于真空干燥器中抽真空至O. 065 MPa，于35-38°C下靜置培養 16-18h ；
(2)多級連續發酵
發酵培養基為(/L):總糖 60 g, (NH4) 2S04 1-2 g, K2HPO4 O. 5g，MnSO4 · H2O O. 01 g，玉米漿干粉 10-15 g, CaCO3 2-4 g,以純水配制，pH 6. 0-6. 25 ；
連續發酵過程中新鮮培養基的補加速率與發酵罐中培養基體積的恒定均使用蠕動泵控制，新鮮發酵培養基及前后罐之間發酵液的流加均從各級發酵罐底部補加，發酵液從發酵罐上部流出的操作方式；采用如下三種操作方式中的一種進行；
A、第一種操作方式
連續發酵前，第一級和第二級罐中裝有體積為V的新鮮發酵培養基，后面幾級為空罐。首先，在第一級和第二級發酵罐中按V的2%-8%的接種量接入種子液，培養16-24 h到達產溶劑期，然后按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補加新鮮發酵培養基到第一級發酵罐中，同時第一級發酵罐中的發酵液以相同的速率流入到第二級發酵罐中，第二級發酵罐中的發酵液以相同的速率流入到第三級發酵罐中，待第三級發酵罐中發酵培養基體積積累到V后開始以相同的速率流入到第四級發酵罐中，再繼續以相同的方式將最后一級發酵罐中的發酵液流入收集罐；
B、第二種操作方式
連續發酵前，各個發酵罐中均裝有體積為V的新鮮發酵培養基。首先，對第N-2級(N為多級連續發酵中的發酵罐罐數)及其以后的發酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發酵培養16-24 h;然后前兩級發酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發酵培養16-24 h后，按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補加新鮮發酵培養基至第一級發酵罐中，同時以相同的流速將前一級發酵罐中的發酵液流入后一級發酵罐中，最后一級發酵罐中的發酵液流入收集罐。C、第三種操作方式
連續發酵前，各個發酵罐中均裝有體積為V的新鮮發酵培養基。首先，多個發酵罐中同時按V的2%-8%的接種量接入種子液，發酵培養16-24 h到達產溶劑期，然后按照O. 03-0. 15V/h流速恒速補加新鮮發酵培養基到第一級發酵罐中，同時以相同的流速將前一級發酵罐中的發酵液流入后一級發酵罐中，最后一級發酵罐中的發酵液流入收集罐。連續發酵中各級發酵條件為發酵罐接種前用100% CO2通入罐頂以維持厭氧環境直至菌體產氣，發酵溫度維持在33-40°C，控制每一級發酵罐的稀釋率D為O. 02-0. 2 h—1，攪拌轉速維持在20-100 r/min。稀釋率(D)定義為新鮮發酵培養基的補加速率F (mL/h)與發酵罐中培養基體積 V (mL)的比值。使用的糖質原料為葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液。所使用的多級連續發酵裝置選用包含4個發酵罐。本發明的有益效果與分批發酵相比，本發明的優勢體現在使用廉價的糖質原料可以降低生產成本，并獲得較高的溶劑生產率；只需一次滅菌和接種，節約了反復洗罐、滅菌等非發酵時間，縮短了生產周期，大大提高了設備的利用率；且發酵設備簡單，易于自動化控制，適用于工業化。根據本發明的一種實施方式，以丙酮丁醇梭菌saccharobu tyli cumDSM 13864連續發酵生產丁醇，原料為葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液。以葡萄糖為主要碳源，按照第一種操作方式進行四級連續發酵，當稀釋率為O. 05 h—1時，四級罐中總溶劑最高為11. 57 g/L (其中丁醇7. 29 g/L)，四級發酵罐的總生產率為O. 145 g/(L*h)。以甘蔗糖蜜為主要碳源，按照第二種操作方式進行四級連續發酵時，使用梯度稀釋率(即四個罐的稀釋率分別為O. 15，0. 15，0. 125及0.1 IT1)條件下，第四級罐中總溶劑最高為13. 75 g/L (其中丁醇8. 26 g/L)，四級發酵罐的總生產率為O. 439 g/(L*h)。當以玉米秸桿水解液為主要碳源，采用第三種操作方式進行四級連續發酵時，當稀釋率為O. I IT1時，第四級罐流出液中總溶劑最高為13.44 g/L(其中丁醇9. 29 g/L)，四級發酵罐的總生產率為O. 336 g/(L.h)。
具體實施例方式以下，本發明將以多種實施案例來詳細描述利用糖質原料連續發酵生產丁醇的方法。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅限于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例I、葡萄糖培養基的四級連續發酵
采用四個3 L攪拌式發酵罐串聯組合成四級連續發酵裝置，單罐的裝液量為I L，補料培養基中葡萄糖濃度為60 g/L，使用的培養基組成為葡萄糖60 g/L，玉米漿干粉10 g/L,CaCO3 4 g/L, (NH4)2SO4 2 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MnSO4*H2O 0.01 g/L ;采用第一種或第二種操作方式，四個罐的溫度都控制在37°C，轉速為50 r/min，稀釋率分別控制在O. 03 ^17O. 05IT1及O. I 1Γ1，結果見表I和表2。表I葡萄糖培養基四級連續發酵法生產丁醇(第一種操作方式)
權利要求
1.一種利用糖質原料連續發酵生產丁醇的方法，其特征在于采用多個發酵罐串聯組合成多級連續發酵裝置，N為多級連續發酵中的發酵罐罐數#為4-6，步驟為 (1)種子的活化 菌種丙酮丁醇梭菌(CViosirii/itt saccharobutylicum') DSM 13864,購于德國微生物菌種保藏中心，將C saccharobuty I i cum DSM 13864菌株孢子懸液以1%_10%的接種量接入種子培養基RCM培養基中，置于真空干燥器中抽真空至O. 065 MPa，于35-38°C下靜置培養 16-18h ； (2)多級連續發酵 發酵培養基以 g/L 計為總糖 60，(NH4) 2S04 1-2，K2HPO4 O. 5，MnSO4 · H2O O. 01，玉米漿干粉 10-15，CaCO3 2-4，以純水配制，pH 6. 0-6. 25 ； 連續發酵過程中新鮮培養基的補加速率與發酵罐中培養基體積的恒定均使用蠕動泵控制，新鮮發酵培養基及前后罐之間發酵液的流加均從各級發酵罐底部補加，發酵液從發酵罐上部流出的操作方式；采用如下三種操作方式中的一種進行； A、第一種操作方式 連續發酵前，第一級和第二級罐中裝有體積為V的新鮮發酵培養基，后面幾級為空罐；首先，在第一級和第二級發酵罐中按V的2%-8%的接種量接入種子液，培養16-24 h到達產溶劑期，然后按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補加新鮮發酵培養基到第一級發酵罐中，同時第一級發酵罐中的發酵液以相同的速率流入到第二級發酵罐中，第二級發酵罐中的發酵液以相同的速率流入到第三級發酵罐中，待第三級發酵罐中發酵培養基體積積累到V后開始以相同的速率流入到第四級發酵罐中，再繼續以相同的方式將最后一級發酵罐中的發酵液流入收集罐； B、第二種操作方式 連續發酵前，各個發酵罐中均裝有體積為V的新鮮發酵培養基；首先，對第N-2級及其以后的發酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發酵培養16-24 h ;然后前兩級發酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發酵培養16-24 h后，按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補加新鮮發酵培養基至第一級發酵罐中，同時以相同的流速將前一級發酵罐中的發酵液流入后一級發酵罐中，最后一級發酵罐中的發酵液流入收集罐； C、第三種操作方式 連續發酵前，各個發酵罐中均裝有體積為V的新鮮發酵培養基；首先，各級發酵罐中同時按V的2%-8%的接種量接入種子液，發酵培養16-24 h到達產溶劑期，然后按照O. 03-0. 15V/h流速恒速補加新鮮發酵培養基到第一級發酵罐中，同時以相同的流速將前一級發酵罐中的發酵液流入后一級發酵罐中，最后一級發酵罐中的發酵液流入收集罐； 連續發酵中各級發酵條件為發酵罐接種前從發酵罐頂部通入100% CO2以維持厭氧環境直至菌體產氣，發酵溫度維持在33-40°C，控制每一級發酵罐的稀釋率D為O. 02-0. 2 h—1，攪拌轉速維持在20-100 r/min ； 稀釋率D定義為新鮮發酵培養基的補加速率F與發酵罐中培養基體積V的比值，F的單位為mL/h, V的單位為mL。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于使用的糖質原料為葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所使用的多級連續發酵裝置選用4個發酵罐。
全文摘要
一種利用糖質原料連續發酵生產丁醇的方法，屬于生物工程技術領域。本發明公開了一種采用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)DSM13864，以葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸稈水解液等糖質原料，采用多個發酵罐串聯組合成多級連續發酵裝置，連續發酵生產丁醇的方法。采用多級連續發酵可獲得高的溶劑濃度和溶劑生產率，減少設備清洗次數和滅菌等非生產占用時間，降低勞動強度，提高設備利用率，適用于工業化操作；采用玉米秸稈水解液原料時，平均總溶劑可達13.44g/L(其中丁醇9.29g/L)，總溶劑生產率達到0.439g/(L h)。
文檔編號C12P7/16GK102925495SQ20121047133
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月20日 優先權日2012年11月20日
發明者倪曄, 夏子義, 王云 申請人:江南大學