專利名稱：一種pcr檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學檢測鑒定領域，具體涉及一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法。
背景技術：
森林蔥蝸牛nemoralis (Linnaeus)是國際植物檢疫中倍受關注的危險性有害生物，其貝殼與同屬的花園蔥蝸牛CfeAaea hortensis Miiller等近似種極為相似，往往難以區分，且只有資深的陸生貝類學分類專家才能鑒別，卵粒和幼螺的鑒定則更為困難。由于歷史的原因，目前國境口岸的植物檢疫員多為植物保護專業，對陸生軟體動物的分類知之甚少，這種局面給我國的實際檢疫工作造成了被動，也是世界各國檢驗檢疫部門共同面臨的技術難題。最近二十多年來，分子系統學飛速發展，即由基因序列的比較可以厘清 物種的分類學與系統學地位。因此可以將形態和分子特征結合起來，對森林蔥蝸牛及其近似種的分類學進行更為深入而詳盡的研究，為森林蔥蝸牛的快速準確鑒定提供新的技術手段。而PCR技術在國境口岸檢疫部門已經相當普及，如果能設計出特異性引物用PCR擴增方法進行初篩或鑒定，這個難題就迎刃而解。本發明建立了一種PCR方法檢測鑒定森林蔥蝸牛的技術，以適應當前國境口岸檢疫工作的需要。
發明內容
本發明針對傳統形態學鑒定技術所存在的不足開展研究，旨在提供一種準確性好、靈敏度高、成本低廉的檢測方法，應用于森林蔥蝸牛的快速檢測鑒定。本發明提供了一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法，所述方法是應用特異性引物對森林蔥蝸牛的分子特征進行識別，所述引物為
上游引物為 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，，
下游引物為 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。本發明的PCR反應體系總體積為25 μ L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用滅菌ddH20補足。所述PCR 反應的程序為95°C預變性 5min ;95°C 50s，52°C 30s, 72°C 50s，35 個循環；72°C延伸lOmin，結束反應。本發明的顯著優點本發明方法能夠快速、準確地檢測鑒定森林蔥蝸牛。本發明為植物檢疫中對危險性有害生物森林蔥蝸牛的檢測鑒定提供了新的技術手段，對于防止森林蔥蝸牛的傳播和擴散具有重要意義。本發明所提供的一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法具有以下有益效果
I、結果可靠本發明所設計出的一種鑒定森林蔥蝸牛的特異性檢測引物，僅針對森林蔥蝸牛進行檢測，已經對花園蔥蝸牛hortensis ;散大蝸牛aspersa ;蓋罩大蝸牛故;斯文豪大蝸牛AfesioAe/ijr swinhoei ;灰尖巴蝸牛{Acusta) ravida rarit/a ;地中海白蝸rirgaia進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證。2、特異性強所采用的引物是針對森林蔥蝸牛的CO I基因序列設計出的特異性引物，特異性高。3、靈敏度高對森林蔥蝸牛的檢測靈敏度在DNA水平上可達到IOfg/ μ L。4、實用性好當傳統分類學方法難以鑒定森林蔥蝸牛時，本發明方法用分子生物學技術進行彌補，從而得到快速、準確、靈敏度高的檢測鑒定森林蔥蝸牛的PCR方法。因此本方法的實用性強，可滿足對森林蔥蝸牛進行快速可靠的檢測和鑒定的需要。
圖I為森林蔥蝸牛PCR引物特異性試驗結果。其中M為IOObp DNA ladderMarker ;泳道1為森林蔥蝸牛Cepaea nemoralis ;泳道2為花園蔥蝸牛Cepaea hortensis ； 泳道3為散大蝸牛aspersa ;泳道4為蓋罩大蝸牛pomatia ;泳道5為斯文豪大蝸牛Afe1SioAeJijr swinhoei ;泳道6 為灰尖巴蝸牛{Acusta) ravida ravida ；泳道7為地中海白蝸牛virgata。圖2為森林蔥蝸牛PCR檢測靈敏度試驗結果。其中M為IOObp DNA ladderMarker ;泳道 I 為 IOng/ μ L ;泳道 2 為 Ing/ μ L ;泳道 3 為 IOOpg/ μ L ;泳道 4 為 IOpg/ μ L ；泳道5為Ipg/ μ L ;泳道6為IOOfg/ μ L ;泳道7為IOfg/ μ L。
具體實施例方式實施例I:森林蔥蝸牛PCR弓I物特異性試驗
1、材料的準備
供試蝸牛如下森林蔥蝸牛CfeAaea;花園蔥蝸牛Cepaea hortonsis
蝸牛aspersa ;蓋罩大蝸牛pomatia ;斯文豪大蝸牛AfesioAe/ijr swinhoei ;灰尖巴蝸牛 JSraafJrAaezja {Acusta) raFit/a raFit/a ;地中海白蝸牛Virgata0以上供試蝸牛系全國口岸檢疫中截獲,經質檢總局國家軟體動物檢疫鑒定重點實驗室確認后，置于_20°C保存備用。2、PCR方法的建立
2.I、引物的設計合成基于森林蔥蝸牛CO I (線粒體細胞色素C氧化酶亞基I)基因序列，用引物設計軟件Primer 5和Oligo 6設計和分析引物,經NCBIBlast檢驗其特異性后，交由上海生工生物技術服務有限公司合成。引物如下
上游引物為 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，，
下游引物為 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。擴增片段大小為580bp。2. 2、DNA 提取
2.2. I、異硫酸氰胍法將準備好的陽性樣品(森林蔥蝸牛Cepaea nemoralis)和陰性對照樣品(花園蔥蝸牛Cepaea hortensis ;散大蝸牛aspersa ;蓋罩大蝸牛pomatia ;斯文豪大蝸牛Afe1SioAeJix swinhoei ;灰尖巴蝸牛(Acusta) ravidaravida ;地中海白蝸牛剪碎后分置于研缽內，加液氮研磨成粉末取5011^，再加入20(^1^ TE，混勻；加入400 μ L裂解液，渦旋混勻，放置IOmin ;然后加入300 μ LTris-飽和酹和300 μ L氯仿:異戍醇(24:1),劇烈震蕩15s, 13 000r/min離心IOmin ;取上清，加等體積的氯仿異戍醇(24:1),劇烈震蕩15s, 13 000r/min離心IOmin ;取上清,加等體積的氯仿，劇烈震蕩15s, 13 000r/min, IOmin ;取上清,力口 O. 8倍體積的異丙醇，12 OOOr/min, IOmin,棄上清；取沉淀,加入70%的的無水乙醇ImL,離心13 000r/min,棄上清,后于真空干燥儀中干燥2min，再加入100 μ L滅菌ddH20溶解。用核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度，最后用TE溶液將DNA稀釋至IOOng/ μ L，置于_20°C保存備用。2. 2. 2、試劑盒提取法TIANGEN組織基因組DNA提取試劑盒提取，按使用說明書操作提取DNA。用核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度，最后用TE溶液將DNA稀釋至IOOng/μ L,置于-20°C保存備用。2.3、PCR擴增反應體系總體積為25yL，其中2XTaq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用滅菌ddH20補足。混勻后放入PCR擴增儀中進行擴增。
2. 4、PCR擴增反應程序為95°C預變性 5min ;95°C 50s, 52°C 30s, 72°C 50s，35 個循環；72°C延伸lOmin，結束反應。2. 5,PCR產物檢測與鑒定取PCR產物10 μ L在I. 5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上以98V電泳40min，用凝膠成像儀觀察。如果觀察到在580bp的位置出現條帶，則說明所檢測的蝸牛樣品為森林蔥蝸牛。檢測結果表明只有森林蔥蝸牛樣品在580bp的位置擴增出條帶，其他樣品都沒有出現擴增條帶(見圖1)，說明此引物具有很強的特異性。
實施例2 :森林蔥蝸牛PCR檢測靈敏度試驗
采用10倍濃度系列稀釋法將實施例I中提取的森林蔥蝸牛DNA原液(IOOng/μ L)稀釋成 IOng/ μ L, lng/ μ L, 100 pg/ μ L, 10 pg/ μ L, I pg/ μ L, 100 fg/ μ L和 10 fg/ μ L共7個不同濃度梯度。PCR擴增反應體系總體積為25 μ L，其中2 X Taq PCR MasterMix混合液12. 5 μ L，上、下游引物各O. 5 μ L，DNA模板2 μ L，余下用滅菌ddH20補足。混勻后放入PCR擴增儀中進行擴增。PCR 擴增反應程序為95°C預變性 5min ;95°C 50s，52°C 30s, 72°C 50s，35 個循環；72°C延伸lOmin，結束反應。PCR產物檢測與鑒定取PCR產物10 μ L在I. 5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)上以98V電泳40min,用凝膠成像儀觀察。如果觀察到在580bp的位置出現條帶,則說明該濃度可以被檢出。結果(圖2)顯示，在DNA濃度為IOfg/μ L時仍有微弱的條帶，表明此方法具有較高的靈敏度，可達到IOfg/μ L。
權利要求
1.一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法，其特征在于所述方法是應用特異性引物對森林蔥蝸牛的分子特征進行識別；所述引物為 上游引物為 CN-(Pl) :5，- ACCTCCTTCCTTTCTACT -3，， 下游引物為 CN-(P2) :5’ - GTCAACATCTATCCCAAC -3’。
2.根據權利要求I所述的一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法，其特征在于利用權利要求I所述的引物進行PCR反應，PCR反應體系總體積為25yL，其中2XTaq PCRMasterMix混合液12. 5 μ L,上、下游引物各O. 5 μ L,DNA模板2μ L,余下用滅菌ddH20補足。
3.根據權利要求2所述的一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法，其特征在于所述PCR反應的程序為95°C預變性5min ;95°C 50s, 52°C 30s, 72°C 50s，35個循環；72°C延伸IOmin,結束反應。
全文摘要
本發明公開了一種PCR檢測鑒定森林蔥蝸牛的方法，所述方法是應用特異性引物對森林蔥蝸牛的分子特征進行識別；其PCR反應的上游引物為CN-(P1)5’-ACCTCCTTCCTTTCTACT-3’，下游引物為CN-(P2)5’-GTCAACATCTATCCCAAC-3’。PCR反應體系總體積為25μL，其中2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，余下用滅菌ddH2O補足；PCR反應程序為5℃預變性5min；95℃50s，52℃30s，72℃50s，35個循環；72℃延伸10min，結束反應。本發明方法能夠快速、準確地檢測鑒定森林蔥蝸牛。本發明為植物檢疫中對危險性有害生物森林蔥蝸牛的檢測鑒定提供了新的技術手段，對于防止森林蔥蝸牛的傳播和擴散具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102952885SQ201210481179
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月23日 優先權日2012年11月23日
發明者周衛川, 肖瓊, 邵碧英, 林陽武 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心