專利名稱：一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法
技術領域：
本發明屬于基因克隆與鑒定技術領域，尤其涉及一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法。該基因參與植物氮素同化、轉移與利用，為通過轉基因方法選育氮高效品種提供了材料。
背景技術：
氮素是影響植物生長發育的主要元素，無論是直接來源于硝酸鹽、氨離子、微生物固定氮還是植物代謝過程中釋放的氨，都必須經過谷氨酰胺合成酶(GS)催化才能同化為氨基酸。大麥、玉米、水稻、擬南芥等許多植物的GS基因已被克隆，GS功能研究已經成為提高氮素利用效率的研究熱點之一。高等植物中有兩類GS，一類定位于胞液中，稱為胞液型GSjP GS1，主要參與種子萌發時儲存氮源的轉運及葉片衰老時氮源的轉移及再利用；另一類定位于質體中，稱為質體型GS，即GS2，主要參與光呼吸、硝酸還原產生的氨(初級氮)的同化過程[。前人研究表明豌豆GSl轉化的煙苗在氮脅迫時能提高葉片的光合速率，增加植株的生物產量，促進氮素的轉移與再利用(Fuentes，2001)。轉GSl基因玉米的穗粒數及千粒重增加，氮素利用率提高(Martin，20006)。高效表達GSl和GS2基因能提高水稻對土壤氮素缺乏的耐性，促進氮的吸收與再利用(孫輝等，2005)。
發明內容
在前期研究工作基礎上，我們設計克隆小麥GSl和GS2基因的全長cDNA引物及相應的PCR循環，得到了 GSl和GS2基因的全長cDNA。并設計特異性引物，利用半定量PCR鑒定GSl和GS2在小麥不同組織中的表達狀態。本發明實施例是這樣實現的，一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，該方法包括以下步驟利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；cDNA合成采用20 ii L反應體系，42 V溫浴Ih ；GSl 全長 cDNA 克隆；GS2 全長 cDNA 克隆；利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達的方法，通過獲得cDNA，利用表I中的弓I物進行PCR擴增，產物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進一步，cDNA合成采用 20 ilL 反應體系為RNA，2u g ;M_MLV，200U ；dNTP,125pmol ；oligodT,IOOpmol ;RNasin,25U。進一步，GSl全長cDNA克隆方法為GSl 全長正向引物GSlQF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物GSlQR :5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循環預變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火61 °C,45s ；延伸72°C，IOmin ;擴增30個循環，4°C，5min。PCR產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶(圖1A)，連接PMD-19載體，轉化大腸桿菌TOP IO，挑選陽性菌落測序鑒定。進一步，GS2全長cDNA克隆方法為GS2 全長正向引物 GS2QF :5，-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’ 和反向引物 GS2QR 5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’ ；PCR 循環:預變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ；擴增30個循環，4°C，5min ；
PCR產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶(圖1B)，連接PMD-19載體，轉化大腸桿菌TOP 10，挑選陽性菌落測序鑒定。進一步，利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達的方法為通過獲得cDNA，利用引物進行PCR擴增預變性94°C，2min，變性94°C，30s ;退火54°C,30s ;延伸72°C，30s ;擴增28個循環，延伸72°C，5min，產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進一步，所述引物設計為(I)GSl全長cDNA的引物設計；正向引物GSlQF :
5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 ' 和反向弓I 物 GSlQR 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'，(2) GS2 全長 cDNA 的弓丨物設計；正向引物 GS2QF 5 ’ -CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3 ’ 和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCITTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’(3) GSl半定量PCR特異性引物。正向引物5' -TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'和反向引物 5' -CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'；(4) GS2 半定量 PCR 特異性引物。正向引物 5' -GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'和反向引物 5' -ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'。本發明首次從普通小麥栽培品種葉片中克隆了 GSl和GS2的全長cDNA，探索了GSl和GS2在小麥不同組織中轉錄與表達特點，不僅為進一步研究其在小麥生長發育過程中的調控方式及在氮素利用中的作用奠定了基礎。更為通過轉基因方法選育氮高效品種提供了材料。
圖I是本發明實施例提供的小麥谷氨酰胺合成酶全長cDNA的PCR擴增圖。A、GS1基因擴增；B、GS2基因擴增。圖2是本發明實施例提供的利用半定量PCR鑒定小麥谷氨酰胺合成酶基因在小麥苗期葉片中的表達特點。A、GS1基因；B、GS2基因。1-6分別表示小麥出苗后2、4、8、20、28及30天。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。在前期研究工作基礎上，我們設計克隆小麥GSl和GS2基因的全長cDNA引物及相應的PCR循環，得到了 GSl和GS2基因的全長cDNA。并設計特異性引物，利用半定量PCR鑒定GSl和GS2在小麥不同組織中的表達狀態。本發明的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定是通過以下技術方案實現的I、利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。2、cDNA 合成采用 20 yL 反應體系(RNA，2u g ;M_MLV，200U ；dNTP, 125pmol ；oligodT, IOOpmol ;RNasin，25U)，42°C溫浴 lh。3、GSl全長cDNA克隆。GSl全長正向引物GSlQF :
5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 ' 和反向弓I 物 GSlQR 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循環預變性 94°C，2mi n ;變性 94°C，45s ;退火61°C，45s ;延伸72°C，IOmin ;擴增30個循環，4°C，5min。PCR產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，連接PMD-19載體，轉化大腸桿菌T0P10，挑選陽性菌落測序鑒定。4、GS2 全長 cDNA 克隆。GS2 全長正向引物 GS2QF :5’ -CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCTITTAATAACGTAGTTCTCCG-3’。PCR 循環預變性 94°C，2min ；變性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ;擴增 30 個循環，4°C，5min。PCR 產物于
I%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，連接PMD-19載體，轉化大腸桿菌T0P10，挑選陽性菌落測序鑒定。5、利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達的方法。通過步驟I和2獲得cDNA，利用表I中的引物進行PCR擴增:預變性94°C，2min，變性94°C，30s ;退火54°C，30s ；延伸72°C，30s ;擴增28個循環，延伸72°C，5min，產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。表I半定量PCR引物
權利要求
1.一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性； cDNA合成采用20 ii L反應體系，42 °C溫浴Ih ； GSl全長cDNA克隆； GS2全長cDNA克隆； 利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達的方法，通過獲得cDNA，利用表I中的引物進行PCR擴增，產物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
2.如權利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，cDNA 合成采用 20 ii L 反應體系為RNA, 2 u g ；M-MLV, 200U ；dNTP, 125pmol ；oligodT,IOOpmol ;RNasin,25U。
3.如權利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，GSl全長cDNA克隆方法為 GSl 全長正向引物 GSl QF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 '和反向引物 GSIQR :5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循環預變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火61。。，45s ;延伸72°C，IOmin ;擴增30個循環，4°C，5min。PCR產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，連接PMD-19載體，轉化大腸桿菌T0P10，挑選陽性菌落測序鑒定。
4.如權利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，GS2全長cDNA克隆方法為 GS2 全長正向引物 GS2QF :5，CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3，和反向引物 GS2QR 5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’ ； PCR 循環:預變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ;擴增30 個循環，4°C，5min ； PCR產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定； 利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，連接PMD-19載體，轉化大腸桿菌T0P10，挑選陽性菌落測序鑒定。
5.如權利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達的方法為 通過獲得cDNA，利用引物進行PCR擴增預變性94°C，2min，變性94°C，30s ;退火54°C，30s ;延伸72°C，30s ;擴增28個循環，延伸72°C，5min，產物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
6.如權利要求5所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，所述引物設計為 (1)GSl全長 cDNA 的引物設計；正向引物 GSlQF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物 GSIQR : 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'， (2)GS2全長cDNA的引物設計；正向引物GS2QF:5’-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’ (3)GSl半定量PCR特異性引物；正向引物5'-TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'和反向引物 5' -CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'； (4 )GS2半定量PCR特異性引物；正向引物5' -GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'和反向引物 5' -ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'。
全文摘要
本發明公開了一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，該方法包括以下步驟利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；cDNA合成采用20μL反應體系，42℃溫浴1h；GS1全長cDNA克隆；GS2全長cDNA克隆；利用半定量PCR鑒定小麥GS1和GS2基因表達的方法，通過獲得cDNA，利用表1中的引物進行PCR擴增，產物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。本發明首次從普通小麥栽培品種葉片中克隆了GS1和GS2的全長cDNA，探索了GS1和GS2在小麥不同組織中轉錄與表達特點，不僅為進一步研究其在小麥生長發育過程中的調控方式及在氮素利用中的作用奠定了基礎。更為通過轉基因方法選育氮高效品種提供了材料。
文檔編號C12Q1/68GK102965383SQ201210492359
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者王小純, 馬新明, 李高飛 申請人:王小純