專利名稱：一種基于柑橘全爪螨幾丁質基因的rna干擾載體制備方法
技術領域：
本發明屬于RNA干擾載體制備技術領域，尤其涉及一種基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備及應用。
背景技術：
柑橘全爪螨是一種世界性害螨，對柑橘產量和品質影響較大，目前化學防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。化學農藥施用不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗性藥。基于RNA干擾技術獲得抗昆蟲的轉基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。昆蟲幾丁質酶參與昆蟲(螨類)蛻皮、圍食膜降解和防御等重要生命活動。通過柑橘全爪螨幾丁質酶基因構建RNA干擾載體，進而獲得轉基因柑橘材料對柑橘全爪螨進行控制具有廣闊的應用前景。
發明內容
本發明實施例的目的在于提供一種基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備方法，旨在解決利用RNA干擾技術進行育種的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種柑橘全爪螨幾丁質基因的應用方法，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出13條幾丁質酶基因，從中挑選Unigene7021進行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構建的載體轉入農桿菌感受態中，進而將農桿菌侵染植株獲得轉基因相橘材料。
進一步，通過柑橘全爪螨轉錄組搜索，獲得幾丁質酶基因Unigene7021,對該基因序列進行真實性檢測后，在NCBI上比對找出保守序列設計構建dsRNA。進一步，將正向目標基因7021P1F1質粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌，隨機挑選單克隆用通用引物Pl，FlPCR檢測篩選正確的菌株，提取質粒，然后酶切驗證得到“PFGC-7021P1F1”;將得到的“PFGC-7021P1F1”質粒雙酶切，同時相同酶切反向目標基因7021P2F2，T4連接酶連接，轉入大腸桿菌隨機挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段7021P1F1/反向片段 7021P2F2”。進一步，將獲得的農桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進行分子檢測將準備好的外植體分別置于盛有重組質粒的農桿菌的培養血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養基上，培養箱中培養，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養基上培養，誘導芽生長直至可以進行嫁接；提取轉基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進行擴增、電泳檢測。本發明應用幾丁質酶在昆蟲發育過程中的調控作用，通過柑橘全爪螨幾丁質酶基因構建RNA干擾載體，最終獲得含特異dsRNA的轉基因柑橘材料。該轉基因材料在生產上的推廣應用必將對柑橘全爪螨的控制發揮重要作用，同時減少化學農藥使用量，因而具有極其廣闊的市場前景。
圖1是本發明實施例提供的基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備方法的實現流程圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。圖1示出了本發明實施例提供的基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備方法的實現流程。一種基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備方法，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出13條幾丁質 酶基因，從中挑選Unigene7021進行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構建的載體轉入農桿菌感受態中，進而將農桿菌侵染植株獲得轉基因相橘材料。在本發明實施例中，通過柑橘全爪螨轉錄組搜索，獲得幾丁質酶基因Unigene7021，對該基因序列進行真實性檢測后，在NCBI上比對找出保守序列設計構建dsRNAο在本發明實施例中，將正向目標基因7021P1F1質粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌，隨機挑選單克隆用通用引物Pl，FlPCR檢測篩選正確的菌株，提取質粒，然后酶切驗證得到“PFGC-7021P1F1 ” ；將得到的“PFGC-7021P1F1 ”質粒雙酶切，同時相同酶切反向目標基因7021P2F2，T4連接酶連接，轉入大腸桿菌隨機挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段 7021P1F1/ 反向片段 7021P2F2”。在本發明實施例中，將獲得的農桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進行分子檢測將準備好的外植體分別置于盛有重組質粒的農桿菌的培養血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養基上，培養箱中培養，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養基上培養，誘導芽生長直至可以進行嫁接；提取轉基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進行擴增、電泳檢測。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種一種基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出13條幾丁質酶基因，從中挑選Unigene7021進行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構建的載體轉入農桿菌感受態中，進而將農桿菌侵染植株獲得轉基因相橘材料。
2.如權利要求1所述的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，通過柑橘全爪螨轉錄組搜索，獲得幾丁質酶基因Unigene7021，對該基因序列進行真實性檢測后，在NCBI上比對找出保守序列設計構建dsRNA。
3.如權利要求1所述的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，將正向目標基因7021P1F1質粒雙酶切，同時將載體PFGC5941質粒用相同兩個酶酶切；用T4連接酶將其連接，然后將連接產物轉化大腸桿菌，隨機挑選單克隆用通用引物Pl，FlPCR檢測篩選正確的菌株，提取質粒，然后酶切驗證得到“PFGC-7021P1F1”;將得到的“PFGC-7021P1F1”質粒雙酶切，同時相同酶切反向目標基因7021P2F2，T4連接酶連接，轉入大腸桿菌隨機挑選單克隆，酶切驗證，得到“PFGC5941-正向片段7021P1F1/反向片段7021P2F2”。
4.如權利要求1所述的RNA干擾載體制備方法，其特征在于，將獲得的農桿菌LBA4404菌株侵染外植體，并進行分子檢測 將準備好的外植體分別置于盛有重組質粒的農桿菌的培養血中，侵染。將上胚軸水平放置于共培養基上，培養箱中培養，取出莖段漂洗，然后水平放于篩選培養基上培養，誘導芽生長直至可以進行嫁接；提取轉基因柑橘苗和其陰性對照植株的基因組DNA，并采用基于GUS基因序列的特異引進行擴增、電泳檢測。
全文摘要
本發明公開了一種基于柑橘全爪螨幾丁質基因的RNA干擾載體制備及應用方法，通過BLAST搜索，從柑橘全爪螨轉錄組數據庫鑒定出13條幾丁質酶基因，從中挑選Unigene7021進行真實性檢測，然后在NCBI上搜索比對保守序列，合成對應的dsRNA，將正、反向幾丁質酶目的片段先后插入到載體內含子兩端，從而構成反向互補發卡結構的RNAi載體“PFGC-7021P1F1/7021P2F2”，將構建的載體轉入農桿菌感受態中，進而將農桿菌侵染植株獲得轉基因柑橘材料。
文檔編號C12N15/66GK103045644SQ20121049235
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者冉春, 張云飛, 劉浩強, 陳飛, 李鴻筠, 李俊麗, 李曉姣, 岳建書 申請人:冉春