專利名稱：一種低溫解烴的紅平紅球菌t7-3及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物生物技術和環境生物技術領域，具體地說，它涉及一株紅平紅球菌Rhodococcus erythoropolis T7_3菌株,及其在低溫環境下石油污染生物修復中的應用。
背景技術：
隨著工業的迅猛發展，水污染日益嚴重，而海洋污染更成為令人關注的世界性環境問題。在海洋各種污染物中，石油污染是最普遍和嚴重的一種。石油是當今支撐人類生活的主要能源，并且在可預見的將來其主導地位很難被動搖，因此石油在存儲、運輸和加工過程中造成的環境污染也必將·日趨嚴重。據聯合國國際海事組織(ΙΜ0)統計，全球每年通過各種途經流入海洋的石油及其制品已達1. OX IO8-L 5Χ IO8噸。海洋石油污染主要來源于海上石油生產、海洋運輸、城市污染廢水排放等。其中，造成海洋石油污染的主要途徑是沿海地區含油廢水的排放和海洋石油開發、鉆井泄漏等突發事故的發生。據聯合國有關組織統計，每年海上油井井噴事故和油輪事故造成的溢油量高達2. 2 X IO7噸。石油進入水體后，造成水體污染，改變局部生態環境，使水生生物死亡，給水資源、生物資源和養殖、旅游業帶來巨大損失，造成的污染已引起國家海洋局、國家環保總局和各級地方政府的高度關注。目前，治理海洋石油污染已成為當今世界各國環境專家的研究熱點。在海洋灘涂石油污染生物修復處理的過程中，經常會用到烴降解菌株，它們以自己的方式攝取烴類，然后參與自身代謝，最終生成小分子有機酸。目前所知的微生物細胞對于烷烴的攝取機制有以下幾個方面一是細胞與烴液滴直接作用微生物細胞可吸附到比自己大得多的烴液滴表面，物質的運輸主要靠被動擴散和主動運輸。這些細胞對烷烴具有很高的親和力。通過相差和掃描電鏡可以觀察到不動桿菌可附著于烷烴小液滴的表面，絮凝物的形成也使得細胞可與烷烴保持緊密接觸，從而造成一種微生態環境。當然并非依靠烷烴生長的微生物種群都會附著于烴類，有的細胞與烴的接觸可能是依靠一種非特異性疏水作用引起的。二是細胞與“擬增溶”的小液滴互相作用微生物所產生的胞外的生物表面活性劑和生物乳化劑有增加油水界面之間接觸面積的作用。1895年，日本三好學博士觀察到灰綠色葡萄霉菌能分解葡萄果實表皮的蠟質，被認為是人類第一次發現微生物分解烴，迄今已有百余年歷史。目前國外石油污染水體的生物修復方面研究較為深入并且已將其運用于現場修復。相繼有學者從被石油污染的土壤與海灘中分離出芽孢桿菌、假單胞菌、諾卡氏菌、鏈球菌和紅球菌，其中從被石油污染的土壤中分離得到一株假單胞菌，2天后對石油中的十六烷降解率為95%，對原油的降解率可達60%，在37°C添加碳氮源的情況下好氧培養60d，浙青質的最高降解率為40%。此外，將不同烴類降解菌混合培養形成混合菌群，便可降解多種烴類。如Baltic General Investment公司的一項專利為利用混合菌群(Azotobacter vinelandi1、Pseudomonas sp. >Pseudomonassp.、Pseudomonas sp.和 Acinetobacter calcoaceticus)來促進石油經類的生物降解。同時，利用微生物對一些石油組分的降解是由遺傳物質-質粒所控制的，通過基因工程手段將降解不同組分的質粒整合到一個細胞內，便可構建成“超級細菌”，所得菌株可同時降解直鏈烷烴、輕質芳烴。我國相關研究起步較晚，2003年，中國農業大學從遼河油田的渣油中分離出8株降解能力強的菌株，其中兩株對浙青質的降解率達53%，具有良好的應用前景，經鑒定這兩株分別為微桿菌和假單胞菌。暨南大學從廣州石化污水處理廠廢水中分離出30株除油菌，除油率約在70%左右，最高為83. 67%，且實驗菌株在消除石化廢水的異味方面也有一定的效果。隨著石油工業的發展，石油污染將會日趨嚴重。而面對一些特殊環境，如低溫環境下的石油污染治理，需要使用低溫解烴菌。海洋石油污染治理面臨的是一種低溫的極端環境。近年來，有關嗜冷微生物解烴方面的研究卻并不多見。研究開發以烷烴為碳源的低溫解烴菌，并使其適用于海洋環境等石油污染修復領域，具有很好的發展前景。
發明內容
本發明的目的在于針對海洋灘涂石油污染日益嚴重的問題，提供一種適用于低溫極端環境的低溫解烴紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis)T7-3和該菌在生物修復領域的應用。本發明提供的紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis)T7-3菌株,于2012年5月11日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，其保藏號為CGMCC No. 6104，建議分類命名為紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis)。本發明提供的紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3菌株，是從渤海被石油污染的海底區域采集泥樣中分離得到(緯度坐標為東經118° 26' 36"及北緯38° 50' 30")。以液體石蠟為唯一碳源的石蠟培養基中(液體石蠟含量2%)在15° C反復馴化培養十代而獲得。紅平紅球菌(Rho dococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 的菌落特征在LB平板上培養菌落大小直徑3 5_，菌落圓形，較粘稠，不透明，凸起，有光澤，橙色。紅平紅球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 的細胞形態特征革蘭氏染色陽性，菌體呈短桿狀，不運動，具有典型的八字型排列特征，細胞大小為
0.8 1. O μ mX 2 3 μ m。紅平紅球菌(Rhodococcusery thoropo lis )T7-3CGMCC No. 6104 的生理生化特征耐冷菌，生長溫度4 一 34°C，最適15 — 25攝氏度，生長pH范圍5_10，NaCl耐受性0-7. 5%。觸酶，硝酸鹽還原，脲酶，七葉靈水解，2，3_ 丁二醇，天冬氨酸實驗均為陽性，氧化酶，M. R.，V-P,吲哚，亞硝酸鹽還原，反硝化，明膠液化，淀粉水解，腺嘌呤水解實驗皆為陰性，能夠利用甘露醇，肌醇產酸。降解烷烴和原油，產生生物乳化劑。紅平紅球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 的 16S rRNA 基因序列特征CGMCC No. 6104接種于LB培養基，15°C搖床培養(130rpm)10小時，離心收集菌體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物 1541R(5’_AAGGAGGTGATCCA GCC-3’)，用這對引物對其16S rDNA基因進行PCR擴增，將擴增引物送北京三博公司進行測序。PCR條件為94°C, IOmin ;94°C，45s，55°C，45s，72°C 90s，30 個循環；72°C 10min，4°C保存。16S rDNA 基因序列長度為 1377bp,在 GenBank 中的登錄號為 DQ855406,與 Rhodococcus erythoropolis(GenBank accession No. AY168586)序列相似性為 99. 93%。其 16S rDNA 的序列如序列表所示。參照《Bergey’sMannual of Systematic Bacteriology》Vol. VIII 的內容，根據其形態特征和生理生化特征，以及根據其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索結果，經多項分類鑒定T7-3為紅平紅球菌。紅平紅球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3CGMCC No. 6104 可以在營養培養基，如普通牛肉汁、LB、營養瓊脂中生長，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的無機鹽培養基中生長，也可以以烷烴或原油為碳源生長。菌株在4 34°C之間均可生長。該菌具有很高的降解石油烴的能力，可降解C12 C36的正構烷烴和原油。用T7-3生長細胞進行降解實驗結果表明，該菌在15°C溫度條件下，通過基礎培養基生長繁殖過程能同時降解加入的lg/L的烷烴或5g/L的原油，其基礎培養基組成為(g/L):KH2P043. 5，Na2HPO4L 5,MgSO4O. 7，(NH4) 2S044，酵母粉 0. 01，ρΗ7· 0-7. 2。往復搖床 130rpm轉速培養 72h，降解率均可達70%以上，對不同碳數的烷烴降解率有較好的降解效果，如圖2所示。該菌在海水培養基中以5g/L柴油作為唯一碳源，25 °C，振蕩培養7d降解率為85%。以5g/L原油作為唯一碳源，25°C，振蕩培養7d，對稀油作用7d后降解率97. 05% ;對稠油降解率61. 08%，因此具有很好的海洋生物修復的應用前景。本發明的優點和積極效果本發明提供的CGMCC No. 6104菌在15 30°C最適溫度條件下，能夠以烴為碳源和能源生長，能夠利用12碳 36碳的正構烷烴，對原油(5g/L)的降解率可達65%以上；該菌株及其發酵液在低溫條件下能很好的 乳化烷烴或原油，進而對烷烴和原油進行降解。該菌株及其發酵液應用于海洋石 油污染生物修復試驗，在天然海水配方中通過補加氮磷源，可以對柴油達到85%以上的降解率，對原油達到60%以上的降解率，因此具有海洋環境石油污染生物修復的潛力。
圖1是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)對各鏈長單烷烴的降解效果；圖2是紅平紅球菌T7_3(CGMCC No. 6104)對原油降解的氣相色譜圖(A為作用前，B為作用后)；圖3是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)在生長不同時期的乳化性能和油水界面張力變化曲線；圖4是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)發酵液對柴油和原油的乳化效果；圖5是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)所產乳化劑對不同底物的乳化指數E1-24 ；圖6是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)及混合菌群對柴油的降解情況；圖中，A為未接菌的柴油對照；B是培養3山(是培養5(1，0是培養7(14是培養IOd的降解后柴油組分氣相色譜圖；圖7是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)降解稀油前后的氣相色譜圖(A為降解前；B為降解后)；
圖8是紅平紅球菌T7-3 (CGMCC No. 6104)降解稠油前后的氣相色譜圖(A為降解前；B為降解后)。
具體實施例方式實施例1 :本發明提供的紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3菌株的篩選。取渤海被石油污染的海底區域泥樣(緯度坐標為東經118° 26' 36"及北緯38° 50' 30")，取5g泥樣于IOOmL以2%液體石蠟為唯一碳源的無機鹽培養基中(液體石蠟含量2%)，置于200r/min低溫搖床15°C富集培養7天，劃線得到7株菌的混合菌群命名為T7。吸取5mL富集液移至新鮮的IOOmL液體石蠟培養基中，進行發酵培養，培養條件同上。經過三個周期富集后最終得到主體菌T7-3。將T7-3取一環接入裝有5mL LB培養液的試管內，15°C震蕩培養48h，作為種子液。取ImL種子液接入裝有50mL柴油無機鹽培養基的250mL三角瓶中，15°C震蕩培養7d，檢測菌株對柴油的降解作用。并通過測量乳化指數(E1-24)來驗證對柴油乳化能力的強弱，最終得到一株乳化及降解液蠟和柴油效果最好的菌株紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3。其中無機鹽培養基組成g/L KH2P043. 5，Na2HPO4L 5，MgSO4O. 7，(NH4) 2S044,酵母粉
O.05，ρΗ7· 0-7. 2。蒸餾水，1000ml，121°C滅菌 30min。在 15°C條件下，培養 3 天。乳化指數(E1-24)的測定方法如下取4個刻度試管，分別及加入柴油、原油、二甲苯和甲苯各3ml，每個試管中再加入7ml的發酵液，劇烈振蕩I分鐘，室溫靜置24小時后測量，以乳化層的高度除以有機相的總高度，再乘100%，即E1-24，如果E1-24>50%，則認為該乳狀液是穩定的。實施例2 :本發 明提供的紅平紅球菌Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株的形態特征和生理生化特征。參照《Bergey，sMannual of Systematic Bacteriology)) (Vol. VDD 的實驗方法進行，檢測其革蘭氏染色，菌體大小和形態，有無鞭毛和芽孢，生長溫度，生長pH范圍，NaCl耐受性。觸酶,硝酸鹽還原,脲酶,七葉靈水解,2，3-丁二醇，天冬氨酸，氧化酶，M. R.，V-P,吲哚，亞硝酸鹽還原，反硝化，明膠液化，淀粉水解，腺嘌呤水解實驗以及利用甘露醇，肌醇實驗。結果表明，該菌株革蘭氏染色陽性，菌體呈短桿狀，無鞭毛，不運動，好氧，不產生芽孢，細胞大小2. O 3. Oym(長)X 0.8 Iym(寬)，具有典型的八字形排列。生長溫度
4- 340C，生長pH范圍5-10，NaCl耐受性0-7. 5%。觸酶，硝酸鹽還原，脲酶，七葉靈水解，2，3-丁二醇，天冬氨酸實驗均為陽性，氧化酶，M. R.，V-P，吲哚，亞硝酸鹽還原，反硝化，明膠液化，淀粉水解，腺嘌呤水解實驗皆為陰性，能夠利用甘露醇，肌醇產酸。實施例3 :本發明提供的紅平紅球菌Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株的16S rRNA基因的PCR擴增和序列測定。將該菌株接種于LB培養基，15°C搖床培養(130rpm) 10小時，離心收集菌體，重新懸浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因組DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和反向引物 1541R (5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用這對引物對其16S rDNA基因進行PCR擴增，將擴增引物送北京三博公司進行測序。PCR條件為94°C，IOmin ;94°C，45s，55°C，45s，72t 90s，30 個循環；72°C 10min，4°C保存。16S rRNA 基因序列長度為 1470bp,在 GenBank 中的登錄號為 DQ855406,與 Rhodococcus erythoropolis(GenBank accession No. AY168586)序列相似性為 99. 93%。其 16S rRNA 基因的序列如序列表所示。實施例4 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在30°C對燒烴和原油的降解。將菌株在LB平板上進行活化，取單菌落接入IOOml以乙醇為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，30°C振蕩培養24h至對數生長期，以2%接種量接種至裝有IOOml含有不同烷烴或原油為碳源的無機鹽培養基(培養基組成同實施例1)的三角瓶中，15°C培養7天，用氣相色譜法分析，該菌株對不同碳數烷烴的降解率，用紅外測油儀測定原油的降解率并用高壓氣相色譜法進行殘留原油的氣相色譜分析，結果如圖1，圖2和圖3所示。該菌株在72h乳化活性達到最高值，72h能使油水界面張力降到最低，對C12 C36烷烴的降解率均有一定程度的降解，對原油(5g/L)的降解率可達87. 05%。檢測原油降解率的方法如下將菌落接種至乙醇培養基培養3天左右，作為種子以2% (v/v)比例接入液接入到IOOmLO. 5%原油的無機鹽培養基中，30°C震蕩培養7d后測定原油降解率。油類測定方法采用紅外法，即發酵液用IOOml四氯化碳萃取，用紅外測油儀測定剩余原油的量，降解率(％ ) = (1-剩余原油的量/加入原油的量)X 100%。并采用高壓氣相色譜方法檢測原油的降解情況。實施例5 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株發酵液在15°C條件下對柴油和原油的乳化。Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在以乙醇為碳源的培養基中(同實施例4)生長，15°C振蕩培養3天，用其發酵液對柴油和不同底物進行乳化活性分析，如圖4所示，以乙醇為碳源生長，該菌發酵液能很好的乳化柴油，E1-24為100%。如圖5所示，該菌在以包括正己烷、正壬烷、正十 二烷、正十三烷、正十四烷、正十六烷、苯及二甲苯作為底物進行乳化性能實驗，結果顯示乳化劑對低碳數烷烴和芳香烴的乳化效果比中長鏈烷烴效果好。對中長鏈烷烴，除正十六烷較好外，其它正十二到正十四烷基本相同，均為70% -80%。實施例6 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在25°C對燒烴和原油的降解。將菌株在LB平板上進行活化，取單菌落接入IOOml以乙醇為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，25°C振蕩培養24h至對數生長期，以2%接種量接種至裝有IOOml含有原油為碳源的無機鹽培養基(培養基組成同實施例1)的三角瓶中，25°C培養7天，用氣相色譜法分析，對原油(5g/L)的降解率可達80%。檢測原油降解率的方法同實施例4。實施例7 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在20°C對燒烴和原油的降解。將菌株在LB平板上進行活化，取單菌落接入IOOml以乙醇為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，20°C振蕩培養24h至對數生長期，以2%接種量接種至裝有IOOml含有原油為碳源的無機鹽培養基(培養基組成同實施例1)的三角瓶中，20°C培養14天，用氣相色譜法分析，對原油(5g/L)的降解率可達72%。
檢測原油降解率的方法同實施例4。實施例8 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在15°C對燒烴和原油的降解。將菌株在LB平板上進行活化，取單菌落接入IOOml以乙醇為唯一碳源的無機鹽液體培養基中，15°C振蕩培養24h至對數生長期，以2%接種量接種至裝有IOOml含有原油為碳源的無機鹽培養基(培養基組成同實施例1)的三角瓶中，15°C培養14天，用氣相色譜法分析，對原·油(5g/L)的降解率可達65%。檢測原油降解率的方法同實施例4。實施例9 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在海水培養基中對柴油的降解。將單菌株Π-3以2%接種量或混合菌群按比例接種至IOOmL優化后的天然海水培養基中，并加入5g/L柴油作為唯一碳源，250C，振蕩培養7d,選擇不接菌作為對照，在3d、5d和7d利用氣相色譜法分析菌株T7-3降解柴油的變化。其中，天然海水培養基的配方如下由陳化 7d 的天然海水加入 0. 04% 的(NH4)2SO47O. 204% 的 KH2PO4 和 0. 01% 的 MgSO4, ρΗ7· 2。根據實驗需要加入不同碳源。氣相色譜法使用角鯊烷作為內標。具體方法如下將菌株培養后的培養液或者對照樣品，加入適量正己烷，完全密閉條件下充分振蕩混勻萃取，靜置分層后取出大部分有機相，再向混合體系中加入正己烷進行二次萃取，重復萃取3次，萃取的有機相合并在一起加入角鯊烷至終濃度為0. 006%(w/v)作內標，定溶至所需體積后用Agilent6820氣相色譜儀系統進行分析,色譜柱為SPB _5capillary column(30mX0. 53mm1. d. ,1. 5 μ m thickness) (Supelco)。色譜程序如下進樣口28(TC ；柱溫150°C,5min,15°C /min 程序升溫至 280°C,停留 30min ；檢測器(FID)溫度350°C；載氣(N2):35mL/min ;空氣400mL/min；氧氣(H2):30mL/min ;尾吹(N2):20mL/min。根據未接菌對照和降解后殘余峰面積與加入的角鯊烷內標峰面積的比值來表征底物的降解情況。
對照峰面積/內標峰面積_降解后峰面積/內標峰面積
底物降解率=---^ --X 100%
對照峰面積/內標峰面積結果見圖6所示，圖中A為未接菌柴油對照；B是培養3d時柴油降解情況，可以看到由于剛剛進入對數期，柴油只有少量降解；C是培養5d時柴油的降解情況，可以看到柴油C16以下的低碳數烷烴幾乎降解完全，只有長鏈烷烴仍有較多殘余；D和E是培養7d和IOd的氣相色譜圖，其中低碳鏈烷烴幾乎降解完全，只有姥鮫烷、植烷及一些長鏈烷烴仍有少量殘余。經過7d的降解實驗，菌株T7-3對柴油降解率為85%左右。實施例10 :本發明提供的Rhodococcus erythoropolis T7-3菌株在海水培養基中對原油的降解。將單菌株T7-3以2%接種量接種至IOOmL優化后的天然海水培養基中，并加入5g/L原油作為唯一碳源，250C，振蕩培養7d,選擇不接菌作為對照，在7d后將培養基用20ml正己烷萃取后進行氣相色譜分析。結果見圖7和圖8，菌株T7-3對稀油作用7d后降解率97. 05% ;對稠油降解率 61. 08%，具有很好的海洋生物修復的應用前景。
權利要求
1.一種紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis) T7-3 菌株，保藏號為 CGMCCNo. 6104ο
2.如權利要求1所述的紅平紅球菌(Rhodococcuserythoropolis) T7-3菌株在海洋環境石油污染生物修復中的應用。
全文摘要
一種低溫解烴的紅平紅球菌T7-3及其用途。本發明紅平紅球菌T7-3(CGMCC No.6104)，是從渤海被石油污染的海底區域采集泥樣中分離得到，為耐冷菌，生長溫度4-34℃，最適15-25℃，生長pH范圍5-10，氯化鈉耐受性0-7.5％；可以烷烴或原油為唯一碳源生長。該菌具有很高的降解石油烴的能力，可降解C12-C36的正構烷烴和原油。對加入的1g/L的烷烴或5g/L的原油，降解率均可達70%以上。在25℃，振蕩培養7d，以5g/L柴油作為唯一碳源降解率為85％，以5g/L原油作為唯一碳源，對稀油作用7d后降解率97.05%，對稠油降解率61.08％，因此具有很好的海洋生物修復的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK103045502SQ20121050880
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者馬挺, 黃磊, 李國強 申請人:南開大學