專利名稱：魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種體外培養的魚類細胞系的方法，屬于生物細胞培養技術領域。
背景技術：
體外培養的魚類細胞系是廣泛應用于病毒學、免疫學、毒理學、發育生物學、腫瘤學基因組學、遺傳學以及資源保護等方面的重要工具。截至目前已相繼建立近280余株不同魚類細胞系，在生理學、病毒學、毒理學、腫瘤及基因工程等領域發揮重要作用。半滑舌鰨semilaevis Gunther)在我國主要分布于渤海、黃海海域，其肉質細膩、鮮美，營養豐富，經濟價值高，自然資源量少。半滑舌鰨自2003年人工繁殖獲得成功后，近年來已經成為我國北方主要的養殖種類，養殖年產值超過10億元。隨著養殖業的快速發展，魚病給養殖業造成巨大損失，病原包括細菌、病毒、寄生蟲等。對半滑舌鰨致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究是從根本上解決病害問題的方法，細胞系作為一種體外培養系統，因其成本低、試驗重復性好、條件可精確控制的優點，是其中必不可少的研究工具。迄今為止，雖然有文獻報道半滑舌鰨胚胎細胞系(中國水產研究院黃海水產研究所，沙珍霞，Acta Oceanologica Sinica · vol. 29. No. 2:81-87)、心肌細胞系(中國水產研究院黃海水產研究所，王賢麗，Fish Physiol Biochem 36:1181 - 1189)、肝臟細胞系(中國水產研究院黃海水產研究所,任國誠,High technology communication. 18 (6):657_660)、精巢細胞系(中國水產研究院黃海水產研究所，張博，Int. J. Biol. 7 (4) : 452-459)等4個細胞系的建立，但是仍未見頭腎來源細胞系的報道。頭腎(又名前腎)是魚類的主要免疫器官，建立半滑舌鰨頭腎來源體外細胞系，可以更有針對性地研究病原在體外培養條件`下的致病機理，也可以為研究免疫抗病基因功能提供細胞平臺。
發明內容
本發明的目的在于提供一種建立魚類頭腎來源細胞系的方法。本發明所要解決的技術問題是通過選擇細胞培養液，選取合適頭腎組織經過原代培養和傳代培養，獲得可以連續傳代，且細胞能維持良好生長狀態的頭腎來源細胞。作為優選的，本發明的魚類是半滑舌鰨。本發明提供的技術方案是一種魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，包括以下步驟
1、頭腎組織的處理將頭腎組織剪成小塊，加入胰蛋白酶進行消化，加入，細胞培養液終止消化，收集經消化處理的組織細胞懸液，離心去除上清；
2、原代培養加入細胞培養液重懸后于培養箱中培養；
3、傳代培養原代培養細胞開始增殖至組織塊周圍細胞暈停止生長后，加入胰蛋白酶消化懸起細胞，利用細胞培養液進行傳代培養；優選地，其中所述魚類為半滑舌鰨。其中，采用的細胞培養液為在基礎細胞培養液中添加胎牛血清、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子，優選進一步含有青霉素和/或鏈霉素。所述基礎培養液優選PH為7. 0-7. 3，更優選為MEM培養基，最佳選用購自GIBCO公司MEM培養基。更具體的是，在使用時向基礎細胞培養液中添加上述各種物質。進一步的，其中胎牛血清添加量為占細胞培養液總體積10-20%的胎牛血清，最佳為20% ;丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子在細胞培養液中的添加量分別達到 O. 1-5 禮、10-100 mMU-20 ng/ml，優選為 I mM、50 mM、10ng/ml。青霉素和 / 或鏈霉素可按常規量添加，通常添加100 U/ml的青霉素，100 U /ml的鏈霉素。上述第2步驟中，所述培養中在24°C培養箱中培養，每隔7天半量更換細胞培養液一次。上述第3步聚傳代培養更優選為原代培養獲得的用添加上述細胞培養液將細胞稀釋至2X IO5細胞/ml濃度進行原瓶傳代培養；當瓶底細胞長至單層后在傳代中以2X 104-2X IO5細胞/ml濃度進行分瓶接種，傳代間隔期為3-7天；傳至11代以后，細胞培養液中的胎牛血清含量減為5%-15%。本發明具有以下有益效果通過本發明方法建立的細胞系可以在大致室溫條件下連續傳代，且細胞能維持良好生長狀態，可以對其進行冷凍保存，能提供大量的頭腎來源細胞。由于于頭腎是魚尤其對于半滑舌鰨而言是重要的免疫器官，因此，所建細胞系為開展病原特性及其致病機理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相關領域的理論與應用研究提供了便利。
圖1 :相差顯微鏡下 傳代培養的半滑舌鰨頭腎來源細胞系
A:第3代半滑舌鰨頭腎來源細胞；B :第21代半滑舌鰨頭腎來源細胞
圖2 :半滑舌鰨頭腎來源細胞系在不同溫度下的生長曲線
圖3 :半滑舌鰨頭腎來源細胞系的染色體核型圖
A :染色體數目分布；B :二倍體中期分相；C :核型
圖4 :半滑舌鰨頭腎來源細胞系感染牙鲆淋巴囊腫病毒圖片
A :細胞感染病毒之前；B :細胞感染病毒5天后；C、D :感染病毒的細胞電鏡切片圖
圖5 :半滑舌鰨頭腎組織的細胞系轉染PEGFP-N3后的熒光圖片。
具體實施例方式 下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。實施例一、半滑舌鰨頭腎來源細胞系的建立方法1、配制細胞培養液取9. 6克GIBCO公司MEM培養基和4. 76克H印es，充分溶解混勻4小時后，用NaOH調節pH為7. 0-7. 3，然后抽濾，分裝，4°C保存保存；使用前加入占總體積10-20%的胎牛血清、ImM的丙酮酸鈉，50mM的2-巰基乙醇，10ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子，100 U/ml的青霉素，100 U/ml的鏈霉素，4°C存放。2、原代培養取體重約250克半滑舌鰨的頭腎組織，置于高壓滅菌處理的玻璃平皿中，PBS沖洗兩次，將腎組織剪成大約I mm3的小塊，加入O. 25%胰蛋白酶1ml，室溫消化20分鐘。加入3 ml細胞培養液終止消化，將經消化處理的組織細胞懸液收集至15 ml離心管中，以2200 rpm離心5分鐘，去上清。加I ml細胞培養液重懸后接種至25cm2的培養瓶中，正置于24°C培養箱中培養。第二天補充細胞培養液至2ml，然后每隔7天半量更換細胞培養液一次。3、傳代培養原代培養細胞開始增殖后，細胞數目增多，當組織塊周圍細胞暈停止生長后，以O. 25%胰酶消化法傳代懸起細胞，用血細胞計數板計數細胞。根據收集到的細胞數量用添加20%胎牛血清的MEM完全培養基將細胞稀釋至2 X IO5細胞/ml濃度進行原瓶傳代培養；當瓶底細胞長至單層后在傳代中以2X 104-2X IO5細胞/ml濃度進行分瓶接種，傳代間隔期為3-7天；傳至11代以后，細胞培養液中血清含量減為總體積的10% ；自接種組織至今，已傳代40多代，細胞已能穩定增值，可定為細胞系，命名為CGHKC。該細胞系主要細胞類型為成纖維樣細胞(如圖1，8所示)。實施例二、半滑舌鰨頭腎組織來源細胞系的鑒定方法1、細胞的凍存與復蘇
O細胞的凍存選取生長旺盛、處于指數生長期的、細胞密度90%以上的一瓶細胞，力口入I ml O. 25%胰蛋白酶消化2分鐘，吸去消化液，用2 ml凍存液(含10% 二甲基亞砜的細胞培養液)懸浮細胞，移至凍存管，4°C放置30分鐘，_80°C冰箱放置12小時，然后移至液氮中保存，并做好記錄。2)細胞的復蘇自液氮中取出保存的凍存管，迅速置于40°C水浴中融化，2200 rpm離心5分鐘，棄上清，加入2 ml細胞培養液懸起細胞，轉移至培養瓶中，放置于培養箱中24°C培養，待細胞貼壁后棄上清，加入2 ml新的細胞培養液。2、細胞生長曲線繪制
為了分析半滑舌鰨頭腎來源細胞系的生長情況，取第9代細胞接種于9個十二孔板，每板7孔，每孔16 X IO4個細胞，每3個十二孔板為一組，將三組孔板分別置于15°C，24°C，30°C的培養箱中培養。在接種后的第2，3，4，5，6，7，8天，在三組孔板中，每組每板各取一孔細胞，以O. 25%胰蛋白酶消化，細胞計數板計數。以培養時間為橫坐標，以每ml細胞數量為縱坐標，繪制生長曲線，如圖2所示。從圖中可見，24°C為半滑舌鰨頭腎來源細胞系的最適生長溫度。3、染色體分析
將22代半滑舌鰨頭腎來源細胞系以I X IO6個/瓶的密度接種于25cm2的培養瓶中，24°C培養24 h后，加入終濃度O. lug/ml的秋水仙素，1. 5h后，消化收集細胞，離心后的細胞沉淀以0.075M KCl溶液37°C處理20分鐘后加入I ml的卡諾固定液(甲醇乙酸=3 :1)，預固定2分鐘,離心后細胞沉淀再次用卡諾固定液固定15分鐘。最后離心,細胞重懸于O. 5ml的卡諾固定液中，_20°C保存過夜。第二天，細胞懸液以冷滴法滴片，風干，5%吉姆薩染色25分鐘，最后用Nikon顯微鏡觀察。半滑舌鰨頭腎組織來源細胞的染色體數目在22-81之間,其中主要的染色體數目為42條，在觀察的100個分裂相細胞中占43% (圖3，A)，染色體核型為2n=42 (參見圖3，B、C)。
4、病毒感染實驗
以21代半滑舌鰨頭腎組織來源細胞系為對象，檢測該細胞牙鲆淋巴囊腫病毒(LCDV)的敏感程度。細胞接種24小時后，將病毒溶液(IO2TCID5cinIr1)加入細胞培養瓶中，I小時后，移去病毒溶液，更換新鮮細胞培養液，繼續培養，約4天后，觀察到細胞病變效應(CPE)后(參見圖4，A，B)，將細胞做電鏡切片觀察。將感染IXDV病毒的CGHKC細胞離心后，用2. 5%戊二醛4°C固定4小時，O.1M PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。1%鋨酸4°C固定2小時，O.1M PBS緩沖液沖洗3次，每次10分鐘。乙醇系列梯度脫水，30%, 50%, 70%, 90%, 100%的乙醇每次10分鐘，其中100%兩次。Epon812環氧樹脂包埋，37°C、45°C、65°C溫箱固化，每級溫度24小時。Ultracut E超薄切片機超薄切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色。JOEL公司JEM-1200EX透射電鏡結果顯示，在半滑舌鰨頭腎組織來源細胞系中觀察到IXDV病毒粒子和凋亡細胞(參見圖4，C，D)。5、GFP報告基因的細胞轉染
轉染前一天，將第9代CGHKC細胞以2 X IO5個/孔的密度接種于六孔板中，24°C培養。轉染時，細胞密度超過80%,以Invitrogen公司的Lipofectamine 2000轉染pEGFP_N3質粒。具體步驟為將5 ul Lipofectamine 2000加入到包含245 ul細胞培養液(不含血清)的1. 5 ml離心管中，另一個離心管中加入10 ul pEGFP-N3 (100 ng/ul)和240 ul不含血清的細胞培養液。5分鐘后，將上述兩管溶液混合，室溫放置25分鐘。500 ul混合液加入到包含2 ml細胞培養液(不含 血清)的六孔板之一孔中，24°C培養4. 5小時，然后，將培養液替換為正常包含血清的細胞培養液。36小時后，用Nikon ECLIPSE TE2000-U熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達，發現約有10%以上的細胞表達較強熒光(具體參見圖5)。上述實施例表明，用本發明方法建立的半滑舌鰨頭腎來源細胞系，其最適生長溫度為24°C，生長曲線正常，染色體為正常的42條，可以進行連續傳代，也可以對其進行冷凍保存。以牙鲆淋巴囊腫病毒轉染細胞系可以檢測到病毒粒子的存在，以PEGFP-N3進行基因轉染實驗，也觀察到較強的綠色熒光，證實半滑舌鰨頭腎組織來源細胞系可以直接應用于病毒感染試驗及外源基因功能研究。本發明半滑舌鰨頭腎組織來源細胞系的建立方法重復性強，染色體鑒定方法可信，配制的培養液營養成分全面，取材的半滑舌鰨體重恰當，該建立方法可以適用于構建其他魚類頭腎來源的魚類細胞系。
權利要求
1.一種魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，包括以下步驟 (1)頭腎組織的處理將頭腎組織剪成小塊，加入胰蛋白酶進行消化，加入，細胞培養液終止消化，收集經消化處理的組織細胞懸液，離心去除上清； (2)原代培養加入細胞培養液重懸后于培養箱中培養； (3)傳代培養原代培養細胞開始增殖至組織塊周圍細胞暈停止生長后，加入胰蛋白酶消化懸起細胞，利用細胞培養液進行傳代培養； 其中，采用的細胞培養液為在基礎細胞培養液中添加胎牛血清、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子。
2.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述的魚類是半滑舌鰨。
3.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述基礎細胞培養液PH為7. 0-7.3。
4.按照權利要求3所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述基礎細胞培養液為MEM培養液。
5.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于在所述基礎細胞培養液進一步添加青霉素和/或鏈霉素。
6.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述基礎細胞培養液中的胎牛血清添加量為占細胞培養液總體積10-20%，優選20%。
7.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述基礎細胞培養液中的添加丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子在細胞培養液中分別達到 O. 1-5 禮、10-100 mMU-20 ng/ml。
8.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述第2步驟中，所述培養中在24°C培養箱中培養，每隔7天半量更換細胞培養液一次。
9.按照權利要求1所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法，其特征在于所述第3步聚傳代培養為原代培養獲得的細胞用添加所述細胞培養液將細胞稀釋至2 X IO5細胞/ml濃度進行原瓶傳代培養；當瓶底細胞長至單層后在傳代中以2X 104-2X IO5細胞/ml濃度進行分瓶接種，傳代間隔期為3-7天；傳至11代以后，細胞培養液中的胎牛血清含量減為5%-15%。
10.按照權利要求1至9任一項所述的魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法獲得的細胞系。
全文摘要
本發明公開了一種魚類頭腎組織來源細胞系的建立方法及其獲得的細胞系。本發明是將處理獲得的頭腎組織進行原代培養和傳代培養獲得，其中所采用的細胞培養液為在基礎細胞培養液中添加胎牛血清、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、人堿性成纖維細胞生長因子。
文檔編號C12N5/07GK103060259SQ20121051878
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月6日 優先權日2012年12月6日
發明者沙珍霞, 陳松林, 鄭媛, 王娜, 謝明樹 申請人:沙珍霞