專利名稱：鑒定大豆耐鹽性的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定大豆耐鹽性的分子標記及其應用。
背景技術：
土壤鹽潰化是影響農業生產和生態環境的主要非生物因素之一，全球近1/5的耕地面積已受到鹽潰化的影響。我國耕地面積中有近1/10是鹽潰化土壤，近年來，不合理灌溉和塑料大棚面積擴大等農業措施加劇了土壤次生鹽潰化。栽培大豆[Glycinemax(L.)Merr.]是我國重要的農作物之一，是植物蛋白和食用油的重要來源，屬于中等耐鹽植物。在 鹽潰土地上種植大豆，其品質下降，產量下降甚至絕收。因此選育耐鹽品種對于開發和利用鹽潰化土壤具有重要意義。分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接反映。與其他幾種遺傳標記一形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有大多數分子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。
發明內容
本發明的目的是提供一種鑒定大豆耐鹽性的分子標記及其應用。所述分子標記為如下I)或2)的分子標記I)分子標記A和分子標記B ；2)分子標記A ；所述分子標記A為用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增大豆品種冀豆12號的基因組DNA得到的大小為145bp的分子標記；所述分子標記B為用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增大豆品種冀NF58的基因組DNA得到的大小為166bp的分子標記。所述分子標記A和所述分子標記B是將所述PCR擴增的產物在5 — 7% (如6%)的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離得到的； 所述6%聚丙烯酰胺凝膠是指每配制IOOmL所述聚丙烯酰胺凝膠使用丙烯酰胺57g和雙苯酰亞胺3克。本發明保護上述分子標記在大豆育種中的應用。本發明還提供一種鑒定或輔助鑒定耐鹽大豆的方法，包括用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增待測大豆的基因組DNA，若所述PCR擴增的產物為所述分子標記A，則所述待測大豆為耐鹽大豆或候選為耐鹽大豆；若所述PCR擴增的產物為所述分子標記B，則所述待測大豆為鹽敏感大豆或候選為鹽敏感大丑。
本發明保護上述方法在篩選耐鹽大豆中的應用。
本發明保護上述方法在篩選鹽敏感大豆中的應用。
在上述方法或應用中，所述耐鹽大豆為鹽害指數彡60. 0%的大豆品種或株系；所述鹽敏感大 為鹽吾指數> 60. 0%的大 品種或株系；
所述鹽害指數的計算公式如下
… Σ(故$類別)(某-鹽‘,丨 炎別株數)1ΛΛη/齡數(%) = U........................▲麗巧—_U00%
所述鹽害類別分為5級1級為待測大豆植株有4片以上綠葉，2級為待測大豆植株有3片綠葉，3級為待測大豆植株有2片綠葉，4級為待測大豆植株有I片綠葉，5級為待測大豆植株僅心葉存活或死亡；
所述鹽害類別的鑒定時期如下所述待測大豆植株第一個三出復葉完全展開時置于濃度為150mmol/L NaCl下培養至對照大豆品種Clark完全枯死。
在上述方法或應用中，所述待測大豆為大豆品種冀豆12號、冀NF58或由所述冀豆 12號和異NF58衍生的品種或品系。
在上述方法或應用中，所述由冀豆12號和冀NF58衍生的品種或品系為將所述冀豆12號和冀NF58雜交并繁衍至F2代以上的世代。
在本發明的實施例中，所述由冀豆12號和冀NF58衍生的品種或品系為以冀豆12 號為母本、冀NF58為父本的F6 : n重組自交系群體中的家系。
實驗證明，與苗期鹽害指數鑒定方法相比，用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對，PCR擴增待測大豆(以冀豆12號為母本、冀NF58為父本的F6 : n重組自交系群體的117個家系)的基因組DNA，通過得到的分子標記(分子標記 A和分子標記B)預測上述待測大豆耐鹽性，準確率可達98. 2%。本發明可用于鑒定或篩選大豆品種或株系的耐鹽性，大大提高了育種效率，在實際育種和生產中具有廣闊的應用前景。
圖I為PCR擴增待測大豆的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中，從左自右依次為 大豆品種冀豆12號、冀NF58、以冀豆12號為母本、冀NF58為父本的F6 : n重組自交系群體中的株系 3、7、8、13、17、19、22、25、27、28、30、32、35、36、41、42、43、44、45、46、49、50、56、57、 58、60、64、67、69、70、72、73、74、80、82、83、87、88、89、95、97、100、101、106、110、112、114、 I16、120、121、124、127、128、130、131、134、138、140、141、146、148、150、158、160、165、169、 170、171、174、176。
圖2為PCR擴增待測大豆的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中，從左自右依次為 大豆品種冀豆12號、冀NF58、以冀豆12號為母本、冀NF58為父本的^ : n重組自交系群體中的株系 1、4、5、9、10、14、15、16、24、26、33、37、38、40、48、53、63、71、75、76、78、79、81、 84、86、91、92、94、96、98、102、103、104、105、107、109、113、119、122、125、135、137、143、147、 161、173、175。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。大豆品種冀豆12號耐鹽品種，河北冀豐農產品科技有限公司。大 品種異NF58 :鹽敏感品種，河北異豐農廣品科技有限公司。大豆品種Clark :鹽敏感品種，文獻蔣洪蔚等.大豆導入系群體芽期耐低溫位點的基因型分析及QTL定位.作物學報.2009，7:1268-1273，公眾可從河北省農林科學院糧油作物研究所獲得。 實施例I、利用分子標記測定耐鹽大豆品種冀豆12號和鹽敏感大豆品種冀NF58I、利用SDS法提取耐鹽大豆品種冀豆12號的基因組DNA，以該基因組DNA為模板，用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增，取10 μ I PCR擴增產物，在95°C變性3min，立即放至冰上冷卻，用6%聚丙烯酰胺凝膠(測序膠)在90W恒功率下電泳分尚I. 5小時,獲得大小為145bp的分子標記A。2、利用SDS法提取鹽敏感大豆品種冀NF58的基因組DNA，以該基因組DNA為模板，用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增，取10 μ I PCR擴增產物，在95°C變性3min，立即放至冰上冷卻，用6%聚丙烯酰胺凝膠(測序膠)在90W恒功率下電泳分尚I. 5小時，獲得大小為166bp的分子標記B。上述步驟I和2的PCR擴增反應體系及反應條件如下反應體系(20μ1):4μ I 模板 DNA(30ng/y 1)，0·6μ I 引物(10 μ Μ)，I. 5 μ I dNTPs(2. 5mM),2. 0μ I 10XPCR Buffer (含 15mM Mg2+)，O. 2 μ I Taq 酶(5U/yl)和 11·7μ1ddH20。反應條件94°C預變性5min，循環階段94°C變性30s ;47°C退火30s ;72°C延伸30s，循環35次，最后72°C延伸5min，PCR產物于4°C保存。6%聚丙烯酰胺凝膠(測序膠)57克丙烯酰胺(Acrylamide),3克雙苯酰亞胺(Bis),420克尿素(Urea)，100毫升10XTBE緩沖液(溶劑為水，溶質及其濃度為tris108g/L、硼酸 55g/L、EDTA 7. 43g/L)，加 ddH20 至 1000 毫升。實施例2、利用分子標記預測冀豆12號和冀NF58衍生品系的耐鹽性I、待測大豆 大 品種異 12號和異NF58的衍生品系以異 12號為母本、異NF58為父本的F6 π重組自交系群體的117個家系；對照耐鹽大豆品種冀豆12號和鹽敏感大豆品種冀NF58。2、分子標記檢測及耐鹽性預測分別取步驟I待測大豆的葉片(每個株系取10個單株的葉片混合)，利用SDS法提取基因組DNA,犾得119個待測大 的DNA樣品,用序列表序列I所不的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對分別進行PCR擴增(方法同實施例1)，各取10μ I PCR擴增產物，在95°C變性3min，立即放至冰上冷卻，在6%聚丙烯酰胺凝膠上90W恒功率下電泳分離I. 5小時，銀染、顯影后拍照，結果如圖I和圖2所示，記錄數據(若為分子標記A，則判斷該待測大豆為耐鹽大豆，記為“A” ；若為分子標記B，則判斷該待測大豆為鹽敏感大豆，記為“B”)，結果如表I所示。
3、鹽脅迫處理及耐鹽性鑒定
I)鹽脅迫處理
將步驟I待測大豆的每個株系取10粒種子播種于盛有砂土的花盆中，每個株系種植3盆(為I次重復)，并將花盆移至盛有l/2Hoagland營養液的平底塑料盒中，按照隨機區組實驗設計，在每個塑料盒中盛放8個花盆。10天后，待真葉完全展開，每個花盆中留取5 株長勢一致的幼苗。待第一個三出復葉完全展開時，用含150mmol/LNaCl的1/2 Hoagland 營養液進行處理，每3天更換I次營養液，以鹽敏感大豆品種Clark作為對照。試驗設3次重復。
上述1/2 Hoagland 營養液的配方如下0. 5mmol/L Ca(NO3)2 · 4Η20、0· 5mmol/ LKN03、0. 2mmol/L NH4H2PO4 和 0. 25mmol/L MgSO4 · 7H20，0. 02mmol/L FeSO4 · 7H20 和 0. 02mmol/L Na2EDTA, 46 μ mol/L H3BO3>9 μ mol/L MnCl2 · 4H20、I μ mmol/L ZnSO4 · 7H20、 0. I μ mol/L (NH4) 6Mo7024 · 4H20 和 0. 4 μ mol/L CuSO4 · 5H20。
2 )苗期耐鹽性評定(苗期鹽害指數法)
經步驟I)的鹽脅迫處理20天后，鹽敏感大豆品種Clark完全枯死，此時對待測大豆植株進行鹽害癥狀調查，計算鹽害指數(取三個重復的平均值)，再根據鹽害指數判斷大豆的耐鹽性，將鹽害指數彡60. 0%的大豆品種或株系定義為耐鹽大豆(記為“ + ”)，將鹽害指數> 60. 0%的大豆品種或株系定義為鹽敏感大豆(記為結果如表I所示。
上述鹽害指數的計算公式
Σ(鹽汲類別1某.鹽古炎別株數)鹽山4| I m%) =;—■■■■■7；—P;■■■■■■■■■■■■H■■■■■—I-X100%株數X 5
其中，鹽害類別分為5級I級為待測植株有4片以上綠葉，2級為待測植株有3片綠葉，3級為待測植株有2片綠葉，4級為待測植株有I片綠葉，5級為待測植株僅心葉存活或死亡。
表I.待測大豆的耐鹽性預測結果
權利要求
1.一種用于鑒定或輔助鑒定大豆耐鹽性的分子標記，其特征在于所述分子標記為如下I)或2)的分子標記 1)分子標記A和分子標記B； 2)分子標記A； 所述分子標記A為用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增大豆品種冀豆12號的基因組DNA得到的大小為145bp的分子標記； 所述分子標記B為用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增大豆品種冀NF58的基因組DNA得到的大小為166bp的分子標記。
2.根據權利要求I所述的分子標記，其特征在于所述分子標記A和所述分子標記B是將所述PCR擴增的產物在5 — 7%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離得到的。
3.權利要求I或2所述分子標記在大豆育種中的應用。
4.一種鑒定或輔助鑒定耐鹽大豆的方法，包括用序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的弓I物對PCR擴增待測大豆的基因組DNA，若所述PCR擴增的產物為所述分子標記A，則所述待測大豆為耐鹽大豆或候選為耐鹽大豆；若所述PCR擴增的產物為所述分子標記B，則所述待測大豆為鹽敏感大豆或候選為鹽敏感大豆。
5.權利要求4所述方法在篩選所述耐鹽大豆中的應用。
6.權利要求4所述方法在篩選所述鹽敏感大豆中的應用。
7.根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于所述待測大豆為大豆品種冀豆12號、冀NF58或由所述冀丑12號和冀NF58衍生的品種或品系。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述由冀豆12號和冀NF58衍生的品種或品系為將所述冀豆12號和冀NF58雜交并繁衍至F2代以上的世代。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定大豆耐鹽性的分子標記及其應用。所述分子標記為用序列表序列1所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增大豆品種冀豆12號的基因組DNA得到的大小為145bp的分子標記A；和/或，用序列表序列1所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成的引物對PCR擴增大豆品種冀NF58的基因組DNA得到的大小為166bp的分子標記B。本發明所提供的分子標記可用于大豆品種或株系的耐鹽性鑒定或篩選，大大提高了育種效率，在實際育種和生產中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102978289SQ20121053863
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者張孟臣, 史曉蕾, 閆龍, 閆瑋雯, 楊春燕 申請人:河北省農林科學院糧油作物研究所