專利名稱：一種棕櫚酸輔酶a的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種酶的制備方法，尤其涉及一種采用發酵方式制備棕櫚酸輔酶A的方法，屬于棕櫚酸輔酶A的制備領域。
背景技術：
棕櫚酸輔酶A是棕櫚酸與輔酶A合成的產物，可以用于生物化學等多重領域。現有的棕櫚酸輔酶A的生產方法主要有化學合成法與酶轉化法。化學合成法存在合成步驟多收率低等缺點，酶轉化法需要用到輔酶A (CoA)、ATP，因為輔酶A (CoA)、ATP價格昂貴，故棕櫚酸輔酶A的酶轉化法的成本很高，有待改進。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有酶轉化法制備棕櫚酸輔酶A的所存在的成本高的缺陷，提供一種成本較低的制備棕櫚酸輔酶A的方法。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的:一種制備棕櫚酸輔酶A的方法，包括以下步驟:(I)克隆編碼乙酰輔酶A合成酶的基因并將其轉化到大腸桿菌細胞中進行表達，獲得表達乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株；(2)將步驟(I)的基因工程菌株種子接入發酵初始培養基進行初始培養直至初始培養基中營養耗盡，溶氧上升至50%以上；
(3)初始培養結束后，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶；(4)誘導培養結束后加入十二烷基磺酸鈉(SDS)至其終濃度為0.05 0.15g/L，進行預轉化培養；預轉化培養完成后流加轉化補料培養基繼續進行轉化培養，得到棕櫚酸輔酶A。其中，步驟(I)中從施氏假單胞菌(ATCC 17588)中克隆得到編碼乙酰輔酶A合成酶的基因，將此基因在大腸桿菌BL21 (DE3)進行表達，獲得表達乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株；所述的編碼乙酰輔酶A合成酶的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。步驟(2)中所述的發酵初始培養基組成包括:磷酸氫二銨6_12g/L、磷酸二氫鉀
3-6g/L、一水檸檬酸0.2-lg/L、硫酸鎂0.3-2 g/L、微量元素母液l_3ml/L、葡萄糖10_20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L ；2M硫酸與氨水做為酸堿調節pH值為6.5-7.3 ；所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到:(1)按以下用量稱取各成分:10gFeSO4.7Η20，2.25g ZnSO4.7H20, Ig CuSO4.5Η20，0.5gMnS04.5H20, 0.23g Na2B4O7.1OH2O, 2gCaCl2.2H20，0.1g (NH4)6Mo7O24 ; (2)將上述各成分溶于IL 5M鹽酸中，即得。步驟(3)中初始培養結束后降溫至28°C，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶；所述的誘導補料培養基的組成為:甘油200_400g/L、乳糖70 _130g/L，硫酸銨100-200g/L ;pH 值為 4.5。步驟(3)中當菌液0D600的值為40-50，酶活為20KU/L時停止誘導培養轉入轉化
培養階段。步驟(4)中所述的預轉化培養的培養條件包括:通氣量為0.5L/L發酵液/min，轉速為200 300rpm，溫度保持在28°C ;使用2M硫酸和氫氧化鈉調節pH值為6.1 6.3 ;步驟(4)中預轉化培養30min后開始流加轉化補料培養基；所述的轉化補料培養基的組成成分包括:甘油50-150 g/L，棕櫚酸鈉100_300g/L ；所述的流加轉化補料培養基的方式包括:流加速度初始時設定為lml/h/L發酵液，Ih后調整為3ml /h/L發酵液，1.5h后調整為5ml/h/L發酵液，2h后調整為7ml/h/L發酵液，保持此流速。步驟(4)的補料過程中，通過調整通氣量將溶解氧含量控制在30%左右。本發明是利用基因工程手段從施氏假單胞菌(ATCC 17588)中克隆得到編碼乙酰輔酶A合成酶的基因、構建基因工程菌株，通過菌體培養、乙酰輔酶A合成酶誘導、棕櫚酸輔酶A轉化三步實現棕櫚酸輔酶A的高效表達，從而摒除了 ATP與輔酶A的使用，降低了成本。本發明使用乙酰輔酶A合成酶重組菌，在比較溫和的條件下，利用生物體本身所能夠產生的ATP、輔酶A等物質(而不是額外添加)，轉化生產高附加值的棕櫚酰輔酶A，其成本遠低于現有的制備棕櫚酸輔酶A的酶轉化方法。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。一、乙酰輔酶A合成酶酶活測定方法(I)酶活定義I個酶活單位等于在以下反應條件下I分鐘內轉化I μ mole棕櫚酸所需要的酶量。(2)試劑配制試劑A的配制配制0.05M, pH 7.5的磷酸鉀緩沖液。在800毫升去離子水中，加入11.34克HEPES，攪拌溶解，用氫氧化鈉在25度下調節pH=7.9，加入0.526克甘油、0.228克苯酚、0.468克氯化鎂、I克疊氮鈉、6.24KU過氧化物酶攪拌溶解，用氫氧化鈉調PH值到7.90 (25°C)，嚴格控制溫度和pH。定容至I升。試劑B的配制在800ml試劑A中依次加入0.6053克ATP *Na2,0.2033克六水氯化鎂，0.8216克輔酶A，調整pH7.5，用試劑A定容到I升。(可按比例配制，輔酶A不穩定，可現用現加)試劑C的配制在800ml水中加入50克Triton X-100和2mM的棕櫚酸，加熱使棕櫚酸完全溶解，冷卻到室溫，用氫氧化鈉調節PH至7.5 (可按比例配制)
試劑D的配制在800ml試劑A中依次加入0.1251克NEM (氮乙酰馬來酰亞胺)，0.505克4-氨基安替吡啉，8KU過氧化物酶，0.25克疊氮鈉，調整pH7.5，用試劑A定容到I升。(可按比例配制)試劑E的配制在800ml水中加入20克苯酚。(可按比例配制)試劑F的配制ACS稀釋液:在IL的pH7.5的IOmM磷酸鉀緩沖液中加入2mM ATP和Ig TritonX-100。(可按比例配制)試劑G的配制 ACOD稀釋液:在IL的pH7.5的25mM磷酸鉀緩沖液中加入0.02mM FAD和0.2g牛血清蛋白。(可按比例配制)試劑H的配制用試劑G配制240KU/L的ACOD (乙酰輔酶A氧化酶)酶液。(3)待測樣品的配制檢測前用臥氏稱量管稱量所需酶，酶稱量時，應至少稱量IOmg的酶，以保證稱量的準確性。用酶稀釋液(試劑F)溶解，定容到配制體積。(4)酶活檢測步驟1、320 μ I試劑B與80 μ I試劑C在37 °C保溫I分鐘。2、加入20 μ I稀釋好的ACS酶液，37°C反應10分鐘。3、加入800 μ I試劑E，37°C溫浴兩分鐘；加入20 μ I試劑H，37°C反應5分鐘。記錄吸光值As。4、重復第1、2、3步驟，用20 μ IACS稀釋液代替20 μ I試劑ACS酶液。記錄空白吸光值Ab。注意:ΛA=As-Ab ≤ 0.300此法酶的最適線性為100-200 U /L0(5)酶活力計算公式
權利要求
1.一種制備棕櫚酸輔酶A的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)克隆編碼乙酰輔酶A合成酶的基因并將其轉化到大腸桿菌細胞中進行表達，獲得表達乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株； (2)將步驟(I)的基因工程菌株種子接入發酵初始培養基進行初始培養； (3)初始培養結束后，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶； (4)誘導培養結束后加入十二烷基磺酸鈉至其終濃度為0.05 0.15g/L進行預轉化培養；預轉化培養完成后流加轉化補料培養基繼續進行轉化培養，得到棕櫚酸輔酶A。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的編碼乙酰輔酶A合成酶的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的發酵初始培養基組成包括:磷酸氫二銨6-12g/L、磷酸二氫鉀3-6g/L、一水檸檬酸0.2_lg/L、硫酸鎂0.3-2 g/L、微量元素母液l_3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L ;pH值為6.5-7.3; 所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到: (I)按以下用量稱取各成分:10g FeSO4.7H20,2.25g ZnSO4.7H20, Ig CuSO4.5H20,0.5gMnS04.5H20, 0.23g Na2B4O7.1OH2O, 2g CaCl2.2H20，0.1g (NH4)6Mo7O24 ；(2)將上述各成分溶于IL 5M鹽酸中，即得。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中初始培養結束后降溫至28°C，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶；當菌液0D600的值為40-50，酶活為20KU/L時停止誘導培養轉入轉化培養階段。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的誘導補料培養基的組成為:甘油200-400g/L、乳糖 70 _130g/L，硫酸銨 100_200g/L ;pH 值為 4.5。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的預轉化培養的培養條件包括:通氣量為0.5L/L發酵液/min，轉速為200 300rpm，溫度保持在28°C ；pH值為6.1 6.3。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中預轉化培養30min后開始流加轉化補料培養基。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的轉化補料培養基的組成成分包括:甘油 50-150 g/L，棕櫚酸鈉 100-300g/L。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的流加轉化補料培養基的方式包括:流加速度初始時設定為lml/h/L發酵液，Ih后調整為3ml/h/L發酵液，1.5h后調整為5ml/h/L發酵液，2h后調整為7ml/h/L發酵液，保持7ml/h/L的流速。
10.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)的補料過程中，通過調整通氣量將溶解氧含量控制在30%左右。
全文摘要
本發明公開了一種制備棕櫚酸輔酶A的方法，該方法包括(1)克隆編碼乙酰輔酶A合成酶的基因并將其轉化到大腸桿菌細胞中進行表達，獲得表達乙酰輔酶A合成酶的基因工程菌株；(2)將基因工程菌株種子接入發酵初始培養基進行初始培養；(3)初始培養結束后，加入誘導補料培養基進行誘導培養產生乙酰輔酶A合成酶；(4)誘導培養結束后加入SDS進行預轉化培養；流加轉化補料培養基繼續進行轉化培養，得到棕櫚酸輔酶A。本發明使用乙酰輔酶A合成酶重組菌，在溫和的條件下，利用生物體本身所能夠產生的ATP、輔酶A等物質，轉化生產高附加值的棕櫚酰輔酶A，其成本遠低于現有的制備棕櫚酸輔酶A的酶轉化方法。
文檔編號C12N15/63GK103074400SQ201210554748
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者不公告發明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司