專利名稱：單順反子基因表達試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域中的基因工程技術，具體涉及一種單順反子基因表達試劑盒及其制備方法。
背景技術：
在轉基因動物中外源基因的高效表達必須依賴好的表達載體。影響外源基因高效表達的因素很多，如啟動子、甲基化、基因本身結構、插入位點、調控序列(增強子、絕緣子、核基質結合區)等。CAG啟動子是人工構建的組合啟動子，由巨細胞病毒(thecytomegalovirus，CMV)早期增強子(early enhancer element)和雞 β-肌動蛋白(chicken beta-act in)啟動子組成，CAG啟動子是非特異性的組成型啟動子，用于驅動基因在哺乳動物載體的高水平表達。本研究所用初始載體pCAG-1RES2-AcGFPl，是本研究室由pCAGEN載體上的CAG啟動子移植并替換 pCMV-1RES2-AcGFPl 中的 CMV，同時以 pCAGEN載體上 Rabbit globin po IyA 移植并替換pCMV-1RES2-AcGFPl中的SV40polyA而得到的。核基質結合區(MARs)是真核生物染色質中與核基質或核骨架特異結合的一段DNA序列。MARs參與DNA復制調控和轉錄調控等多種核生化過程。我們從牛基因組克隆獲得的MARs序列大小為1203bp，AT含量為62. 31 %，經生物信息學分析發現該序列也含有一個典型的DNA解旋序列(aatatt). —個潛在的T-box(taatcaa)和一個潛在的 TATA-box(tataat)序列結構。研究表明,MARs序列的功能包括邊界因子(boundarye Iement)作用、染色質調節作用、DNA復制起始子的組分、染色體結構組成作用、MARs對轉基因表達的調控作用，鑒于MARs與基因表達間的關系 ，尤其它能顯著地增強轉基因表達、克服位置效應、消除轉基因沉默，它已被作為一種順式調控元件應用到轉基因技術中。基因表達盒研究現狀，利用去除質粒載體主干序列的基因表達盒(僅包括啟動子、編碼區和終止子)作為基因轉移體，也稱為潔凈DNA轉化(clean DNA transformation)，主要是通過基因槍轉化植物，已在水稻、棉花、小麥、葡萄轉化中獲得成功應用，利用花粉管導入法在甜瓜中也成功利用，而很少見在轉基因動物尤其哺乳動物中的構建與應用。本研究中為了提高基因表達盒在哺乳動物中的轉染和整合及表達效率，在基因表達盒的上游和下游各加了一個牛的核基質結合區(MARs)，構建制備成MAR-CAG-FATl-polyA-MAR單順反子基因表達盒，作為基因轉移體，用于轉基因動物尚未見報道。它是潔凈的、安全的基因轉移體，為轉基因動物研究提供新的思路和途徑。
發明內容
本發明的目的在于提供無質粒載體主干序列、無任何選擇標記、具安全性的組成型單順反子基因表達盒，即MAR-CAG-FATl-polyA-MAR，獨立基因轉移體。
本發明的技術方案概述如下以雙順反子質粒載體P MAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-po IyA-MAR為初始質粒載體，經用EcoR I和Not I雙酶切，將FSTN、IRES、AcGFPl切掉，選取剩余部分，與上游引入EcoR I和Hind III兩個酶切位點，下游引入Not I酶切位點的中間序列T連接，構建成中間質粒載體PMAR-CAG-T-PolyA-MA以制備單順反子基因表達盒的母載體，即利用EcoR/IHindI I I和Not I以任一目的基因替換T序列，即獲得單順反子基因表達盒，如用雙酶切以 Hind II1-FATl-Not I 替換 Hind III—T-Not 獲得 pMAR-CAG-FATl-polyA-MAR 質粒載體，用Sacl和AflII雙酶切即分離到MAR-CAG-FATl-polyA-MAR基因表達盒，獨立基因轉移體。本發明的單順反子基因表達試劑盒無主干載體序列和任何選擇標記，避免了它們對轉基因動物以及人類帶來的潛在危害，是具轉基因安全性的基因轉移體。
圖1 :初始質粒載體 P MAR-CAG-FSTN-1 RES-AcGFP1-po I yA-MAR 的結構示意圖；圖2 :中間質粒載體pMAR-CAG-T-Po I yA-MAR結構示意圖；圖3 :單順反子基因表達盒質粒載體pMAR-CAG-FATl-polyA結構示意圖。
具體實施例方式1. MAR-CAG-FATl-polyA-MAR 基因表達盒的構建利用圖1所示的質粒載體pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR作為初始載體構建沒有主干載體序列、沒有抗性基因、沒有熒光標記的安全載體，先用EcoR I和Not I對質粒載體進行雙酶切，將FSTN、IRES、AcGFPl切掉，再插入一段中間序列T，通過此序列引入新的合適的酶切位點，再通過新的酶切位點插入FATl序列。2.中間序列T的獲得通過PCR反應從PMD19T-simple vector上獲得含有HindIII酶切位點的序列，方便外源基因FATl的插入。PCR的引物設計上游引物引入EcoR I和HindIII兩個酶切位點，下游引物引入Not I酶切位點，PCR引物如下所示TPE3 正義鏈5' AATCGgaattcAATCGaagcttTATCCGCCTCCATCCAGTCT 3'TPE4 反義鏈5' AATCGgcggccgcTTCCGTGTCGCCCTTATTCC 3'PCR反應條件(1)95°C 5min(2) 95 °C 30s(3) 60 °C 30s(4) 72°C 50s(5)72。。7min
(2)-(4)重復35個循環通過此反應即可獲得該中間T序列，片斷大小為657bp。測序通過膠回收的方法回收該片段，連接到PMD19T_simplevector上,轉化并涂平板，挑菌并搖菌，通過菌液PCR檢測所挑菌落是否為陽性，最后將陽性菌液送去測序，留一部分保菌。3.將T片斷插入到酶切載體中獲得中間質粒載體測序結果回來后，與原序列進行比對，選擇測序結果正確的菌液進行提質粒，對所提質粒進行EcoR I和Not I雙酶切，獲得的片段通過EcoR I和Not I兩個酶切位點插入到初始的酶切載體中，并進行酶切鑒定和PCR鑒定，以確保外源基因正確插入，獲得的中間載體質粒pMAR-CAG-T-polyA-MAR，其結構示意圖如圖2所示。4.獲得FATl序列哺乳動物自身不能合成ω-3多不飽和脂肪酸，所以通常處于供應不足的狀態，其營養需求必需從攝食中獲得。ω_3多不飽和脂肪酸去飽和酶基因fat-Ι是合成ω-3系列不飽和脂肪酸的關鍵酶。研究表明，fat-Ι基因促使ω-6系列不飽和脂肪酸轉變為相應的ω-3系列不飽和脂肪酸。希望可以生產高表達ω-3系列多不飽和脂肪酸的轉基因家畜。為方便目的片斷插入載體中，上游引物5’端引入一個HindIII酶切位點，下游引物引入一個Not I酶切位點，前面分別添加5個保護堿基，如下所示FAF3 正義鏈5' AATCGaagctt CTGGTTATTGTGCTGTCTCAT 3'FAR4 反義鏈5' AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG 3'使用上述引物從含FATl基因序列的cDNA庫中進行PCR反應，反應條件如下(1)95°C 5min(2) 95 °C 30s(3) 58°C 30s(4) 72°C lmin20s(5) 72 °C 7min(2)-(4)重復35個循環通過此反應即可獲得FATl序列的全長片斷，片斷大小為1182bp。通過膠回收的方法回收該片段,連接到PMD19T_simple vector上,轉化并涂平板，挑選菌株并擴增，通過菌液PCR檢測所挑菌落是否為陽性，最后將陽性菌株進行測序，留一部分保菌。5.將FATl序列插入到載體中測序結果回來后，與原序列進行比對，選擇測序結果正確的菌液進行提質粒，對所提質粒進行HindIII和Not I雙酶切，獲得的片段通過HindIII和Not I兩個酶切位點插入到中間載體中，并進行酶切鑒定和PCR鑒定，以確保外源基因正確插入，得到單順反子質粒載體pMAR-CAG-FATl-polyA-MAR，其結構示意圖如圖3所示。6.獲得 MAR-CAG-FAT1-po IyA-MAR 基因表達試劑盒
pMAR-CAG-FATl-po lyA-MAR質粒載體構建完畢后，用Sac1、AflII雙酶切，即可獲得MAR-CAG-FATl-polyA-MAR基因表達盒，其全序列為SEQ NO.1。轉基因細胞整合與表達的鑒定一、轉基因細胞的獲得通過脂質體轉染的方法獲得轉基因細胞，具體步驟如下1、DNA的準備酶切并回收基因表達盒MARCAGFATlpolyAMAR2、細胞的準備轉染前一天解凍骨髓間充質干細胞，將重懸后的細胞按合適密度鋪到24孔板的6個空中(每個孔的密度為70% -80% )，每孔加500微升細胞培養液(成分為DMEM+10% FBS)對細胞進行培養。3、轉染(I)轉染試劑的配制每孔需加200微升轉染試劑，其成分為200微升opti-MEM+2微升LTX+0. 67微升plus+500 納克 DNA。配制過程如下向opt1-MEM加入適量的DNA，徹底混勻；再向其中加入適量的plus輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；最后向其中加入適量的LTX，徹底混勻后室溫靜置30分鐘。(2)待轉染細胞的處理在轉染試劑靜置30分鐘的過程中可以對待轉染的細胞進行處理，處理過程如下將孔中原有的細胞培養液吸走，用500微升的DPBS洗兩遍，再用500微升的opt1-MEM洗一遍，將原有培養液中的FBS徹底去除。(3)轉染待轉染試劑靜置30分鐘后，用移液器吹吸7-8次混勻，將孔中的opt i-MEM去除，吸取200微升轉染試劑逐滴緩慢地加入到孔中，將培養板輕輕前后晃動幾次，確保轉染試劑均勻覆蓋在細胞表面，放入培養箱中進行培養。(4)換液轉染4-6小時后，將每個孔中的轉染試劑去除，加入500微升的DMEM+10FBS，繼續培養。二、外源基因整合檢測轉染后的細胞繼續培養三天后，此時外源基因已經穩定整合，消化三個孔的細胞進行基因組DNA的提取，以其為模版，通過PCR的方法檢測外源基因的整合情況。上游引物在FATl 5'端，下游引物在MAR序列3'端，PCR產物3000bp。將PCR的結果進行凝膠電泳，電泳結果顯示，三個樣品所對應的泳道在3000bp附近均有目的條帶，說明這三個孔的轉基因細胞中外源基因在DNA水平已經正常整合。三、外源基因表達檢測轉染后的第四天，對剩余三個孔的細胞進行總RNA提取，隨即對總RNA進行反轉錄，以反轉后的cDNA為模版進行RT-PCR，從而檢測外源基因在RNA水平是否表達。所用引物為外源基因FATl的全長擴增引物，因此PCR產物長度為1258bp。將RT-PCR的結果進行凝膠電泳，電泳結果顯示，三個樣品所對應的泳道在1258bp附近均有目的條帶，說明這三個孔的轉基因細胞中外源基因在RNA水平已經正常表達。
上述實驗結果表明，本發明所構建的MAR-CAG-FATl-polyA-MAR獨立基因轉移體可以有效地進行轉染、整合與表達，且無任何質粒載體主干序列和任何選擇性抗性基因及標志基因，是安全有效的新型基因轉移體。當理解的是，本發明的具體實施例僅僅是出于示例性說明的目的，其不以任何方式限定本發明的保護范圍，本領域的技術人員可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.單順反子基因表達試劑盒，其含有獨立基因轉移體MAR-CAG-FATl-polyA-MAR，其中MAR為牛核基質結合區；CAG為啟動子；FAT1為n_3去飽和酶基因；polyA為終止區；所述的獨立基因轉移體無主干載體序列和任何選擇標記。
2.根據權利要求1所述的單順反子基因表達試劑盒，所述獨立基因轉移體的全序列為SEQ NO. lo
3.權利要求1或2所述的單順反子基因表達試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟 利用圖1所示的質粒載體pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR作為初始載體構建沒有主干載體序列、沒有抗性基因、沒有熒光標記的安全載體，先用EcoR I和Not I對質粒載體進行雙酶切，將FSTN、IRES、AcGFPl切掉，再插入一段中間序列T，通過此序列引入新的酶切位點,再通過新的酶切位點插入FATl序列。
4.根據權利要求3所述的制備方法，所述的新的酶切位點是HindIII酶切位點。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的FATl序列通過如下引物進行PCR獲得 FAF3正義鏈5' AATCGaagctt CTGGTTATTGTGCTGTCTCAT 3' FAR4反義鏈 5' AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG 3'。
6.根據權利要求3-5任意一項所述的制備方法，其特征在于插入FATl序列通過Sac1、Afl II雙酶切獲得MAR-CAG-FATl-polyA-MAR單順反子基因表達盒。
全文摘要
本發明公開了一種單順反子基因表達試劑盒及其制備方法，其含有獨立基因轉移體MAR-CAG-FAT1-polyA-MAR，其中MAR為牛核基質結合區；CAG為啟動子；FAT1為n-3去飽和酶基因；polyA為終止區。本發明的單順反子獨立基因轉移體無主干載體序列和任何選擇標記，避免了它們對轉基因動物以及人類帶來的潛在危害，是具轉基因安全性的獨立基因轉移體。
文檔編號C12N15/63GK103031324SQ20121055493
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者李光鵬, 胡曉明, 楊磊, 諶顏, 于超然, 扈廷茂 申請人:內蒙古大學