一株產γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高產γ-聚谷氨酸方法

一株產γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高產γ-聚谷氨酸方法
【專利摘要】本發明公開了一株高產γ-聚谷氨酸的基因工程菌及其發酵生產方法。該基因工程菌株名為枯草芽孢桿菌FRD518，保藏編號為CGMCCNO.6772，其染色體上重組整合了透明顫菌的血紅蛋白基因（vgb），可成功高表達透明顫菌血紅蛋白VHb，顯著提高了重組枯草芽孢桿菌低溶氧條件下對氧的利用率；在發酵過程中，通過流加碳源和谷氨酸鈉、酵母提取物等成分，工程菌能夠高效高產γ-聚谷氨酸，產量達到65g/L以上，比原始野生菌株單批培養時產量提高了147%。該基因工程菌解決了γ－聚谷氨酸生產菌種在高粘、溶氧限制條件下發酵時，產量過低、副產物較多、周期較長及能耗較高等問題，可應用于γ－聚谷氨酸大規模工業化生產中。
【專利說明】一株產Y-聚谷氨酸基因工程菌及其高產Y-聚谷氨酸方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株利用基因工程技術改造的高產Y-聚谷氨酸工程菌株及其利用該工程菌株發酵生產Y -聚谷氨酸的方法，屬于生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]Y -聚谷氨酸(聚- Y-谷氨酸，poly- y -glutamic acid,簡稱PGA)是一種由微生物合成的氨基酸聚合物，由L-或/和D-谷氨酸通過Y -聚谷酰鍵連接而成，其分子量一般在100~1000KDa之間，相當于500到5000個左右的谷氨酸單體。Y-聚谷氨酸具有優良的成膜性、成纖維性、可塑性、粘結性和極其強的吸水性，具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保溫、緩釋、助溶、粘結和強吸水等功能。作為一種生物材料，Y-聚谷氨酸具有生物可降解性好、可食、對人體和環境無毒害等優點，在食品、化妝品、醫藥、農業和水處理等領域具有廣泛的應用前景。
[0003]近來國內外主要選用以芽孢桿菌為代表的微生物發酵法來生產Y-聚谷氨酸。早在1937年由Ivanovics首先在anthracis的莢膜中發現了 Y-聚谷氨酸，此后微生物發酵法生產Y-聚谷氨酸有了一些嘗試性研究。特別是二十世紀九十年代后，在分離篩選以枯草芽孢桿菌為代表的Y-聚谷氨酸高產菌株方面做了大量的科學實驗。Kubota從土壤中分離得到的一株subtil is F921,該菌株在最佳發酵生產條件下可以達到50g/L的最高產量,該菌株已被Mei ji Seika Kaisha公司成功用于工業化大規模生產Y-聚谷氨酸。Ogawa對Bacillus subtil is MR 2^7進行培養條件優化，在30L的發酵罐中可使Y-聚谷氨酸最大產量達到35 g/L ο Ywm Bacilluslicheniformis ATCC9945a采用流加高密度培養的方法，在2.5 L發酵罐中發酵35小時后達到39 g/L的最終產量。國內有研究報道在適量谷氨酸供給條件下，取得產量30 g/L，有望成為生產用株。日本味之素株式會社和臺灣味丹企業已經利用發酵方法方法進行PGA的商業化試生產。
[0004]目前發酵法生產Y-聚谷氨酸過程中，合成代謝途徑較為復雜，發酵液中PGA濃度相對較低，并且發酵液及其粘稠，粘度達到數千毫帕秒，發酵液高粘度顯著降低了發酵液中的溶氧濃度，形成了低氧環境，非常有限的可利用氧成為限制生產菌種生產和代謝的關鍵性因素，極大地影響了菌株的代謝生長，降低了 Y-聚谷氨酸合成分泌量，導致Y-聚谷氨酸產率較低。因此尋找一種能夠增加發酵液中溶氧濃度的方法或是提高微生物在貧氧環境下的攝氧能力，成為目前Y-聚谷氨酸發酵生產中亟待解決的問題。
[0005]透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是由一種專性好氧的革蘭氏陰性菌透明顫菌(K/ treosciIla sp.)的血紅蛋白基因(Ki treosciIla hemoglobingene, vgb)編碼的同型二聚體形式的可溶性血紅蛋白分子，在缺氧條件下合成的一種可溶性血紅蛋白，是原核生物中迄今為止發現的唯一一種血紅蛋白。由于它具有較強的氧傳送能力，可以在貧氧環境中促進細菌生長，因此利用透明顫菌血紅蛋白基因在發酵菌株中的表達血紅蛋白(VHb)，能夠有效地解決好氧微生物發酵過程中的供氧問題，在不增加投資的情況下，達到提高產量的目。本發明正是基于以上的原理，構建了可表達透明顫菌血紅蛋白的Y-聚谷氨酸工程菌株，該工程菌以補料方式發酵培養可高效高產Y-聚谷氨酸。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一株利用基因工程技術改造的高產Y-聚谷氨酸工程菌株及其利用該工程菌株發酵生產Y -聚谷氨酸的方法，改造后經獨特的流加補料方式發酵培養，生產聚谷氨酸能力較改造前提高了 147%。
[0007]本發明以一株產Y-聚谷氨酸的野生枯草芽孢桿菌作為遺傳改造改造對象，經基因工程技術改造后獲得的一株高產Y -聚谷氨酸工程菌FRD518，該基因工程菌為同源重組菌，染色體上重組了含有啟動子P43、同源重組序列amyE和氯霉素抗性篩選標記的透明顫菌血紅蛋白基因vgb等序列的重組載體，重組基因工程菌能成功高表達血紅蛋白活性，提高貧氧條件下該菌的攝氧能力和代謝能力，在較低溶氧水平下，大幅度提高Y-聚谷氨酸的產量。
[0008]本發明所提供的可高產Y-聚谷氨酸的工程菌，是將透明顫菌血紅蛋白基因(.vgb)以重組載體的方式重組到枯草芽孢桿菌基因組上，所述透明顫菌血紅蛋白基因具有GENBANK Aceession Number 為 M30794 的 5’ 端第 142-582 位核苷酸序列。
[0009]本發明所述表達透明顫菌血紅蛋白基因的重組載體中所述透明顫菌血紅蛋白基因的5’端連接有P43啟動子，所述P43啟動子具有GENBANK Aceession Number為K02174的5’端第1-476位核苷酸序列，其可在Y-聚谷氨酸生產菌中啟動下游基因的表達。
[0010]本發明所述表達透明顫菌血紅蛋白基因重組載體中的同源重組序列為淀粉酶(amyE)位點,篩選標記為氯霉素抗性基因。
[0011]本發明將透明顫菌 血紅蛋白基因通過基因工程技術構建成枯草芽孢桿菌重組載體 pBluescriptsk (+)-amyE-P43-cat-vgb_amyE,又名為 pSK_P43_vgb (見附圖1 說明)。重組載體pSK-P43-vgb通過電轉化方法導入Y -聚谷氨酸野生型生產菌株內，經篩選得到高產工程菌株枯草芽孢桿菌UaciJJm 5^ii7i5)FRD5180該基因工程菌株于2012年11月02日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC N0.6772。該基因工程菌經發酵驗證，Y _聚谷氨酸產量由改造前24.6g/L提高至45.2g/L，增幅達到81.4%。
[0012]本發明提供了基因工程菌株枯草芽孢桿菌心仰況iJi^FRDSlS發酵高產Y -聚谷氨酸的方法，根據該工程菌株生長代謝特點，在發酵罐上通過連續流加底物方式控制菌的生產和代謝，促進Y-聚谷氨酸高效生產。分別在不同培養時間流加碳源(蔗糖、葡萄糖、甘油、檸檬酸中任一種或以上混合物)、谷氨酸鈉和酵母提取物等底物發酵培養，IOf 100L發酵罐上Y-聚谷氨產量可達到65 g/L以上，比工程菌株枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis)mmi^單批發酵培養時產量至少提高35%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1 重組載體 pBluescriptsk ( + ) -amyE-P43-vgb-cat- amyE 結構圖
圖2工程菌株subtil is FRD 518與原始菌株搖瓶發酵比較圖3工程菌株subtil is FRD518與原始菌株IOL發酵罐單批發酵比較 圖4工程菌株subti I is FRD518 IOL發酵罐流加補料發酵 圖5工程菌株subti I is FRD518 100L發酵罐流加補料發酵
【具體實施方式】
[0014]下述實施例中所用的方法無特別說明均為常規方法。
[0015]實施例一:表達血紅蛋白基因的pSK (-) -P43-vgb重組載體的構建
采用常規分子生物學技術，將枯草芽孢桿菌淀粉酶基因的5’端第f500和138廣1984位核苷酸序列分別克隆到pBluescriptsk (-)質粒的ZAo I ,HindIII^W Xba I jac及位點之間；所用引物分別為:
AmyEl 5’ ATTGCTCGAGATGTTTGCAAAACGATTCAAA3’
AmyE2 5’ GGATAAGCTTTGTGTGTTTCCATGTGTCCAGT3’
AmyE3 5’ ATTGTCTAGAGCTGTGCTTTATCCTGATGATA3’
AmyE4 5’ ATTACCGCGGTCAATGGGGAAGAGAACCGCT3’
以枯草芽孢桿菌基因組為模板，以
Pl 5’ ATTAGAATTCTGTCGACGTGCATGCAGGC3’
P2 5’ TAGGATCCTATAATGGTACCGCTATCACT3’
為引物進行PCR擴增出P43啟動子基因；插入到pBluescriptsk (-)質粒的I熱BamH /位點之間；
以pUC19-vgb為模板，以
VGBl 5’ ATTGGATCCGGAAGACCCTCATGTTAGA3’
VGB2 5’ ATTATCTAGATTATTCAACCGCTTGAGCGTA3’
為引物進行PCR擴增出vgb基因；插入到pBluescriptsk (-)質粒的I和Xba I位點之間；
以pNZ8148為模板，以
CMl: 5’ AATGAAGCTTACGGCAATAGTTACCCTTATT3’，
CM2: 5’ ACTGGAATTCTGTAATATAAAAACCTTCTTC3’
為引物進行PCR擴增出氯霉素抗性基因(cat),插入到pBluescriptsk (-)質粒的HindIII和EcoR /位點之間，成功構建了重組載體，將載體命名為pSK (-)-P43-vgb (其結構如附圖1)。
[0016]實施例二:高產Y-聚谷氨酸工程菌枯草芽孢桿菌UaciBm仰)FRD518的構建
將實施例一構建的載體pSK (_)-P43-vgb用限制性內切酶ZAo /或fee//線性化；用堿性磷酸酶去磷酸化處理，回收后用于電轉化。具體方法如下:
(1)接種A - SUbtilis于3mlLB培養基中，過夜培養。(2)取2.6ml過夜培養物接入40ml (LB+0.5M 山梨醇)中，37°C，200rpm 培養至 0D600=0.85 ~0.95。(3)將菌液冰水浴10 min，然后5000g，5 min，4°C離心收集菌體。(4)用50ml預冷的電轉培養基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖)，重新吹懸菌體，5000g, 5min，4°C離心去上清，如此漂洗4次。
(5)將洗滌后的菌體吹懸于Iml電轉培養基中，每EP管分裝120。(6)將60 μ I感受態細胞中加入50ngDNA，冰上孵育2min，加入預冷的電轉杯(Imm)中，電擊一次。電轉儀設置:
2.0kv, Imm,電擊I次。(7)電擊完畢取出杯子并立即加入1ml RM (LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇)，371:，200印111，復蘇311后，涂布于含有1(^8/1111氯霉素的LB固體培養基上。37°C培養48~72h。(8)挑取單菌落于LB液體培養基中培養24h，提取基因組，用引物VGBl和VGB2進行PCR驗證，擴增產物為441bp的DNA片段的為陽性菌株。
[0017]實施例三:基因工程菌FRD518高產Y-聚谷氨酸篩選、驗證
挑取生長快速的陽性克隆菌株36株，經搖瓶發酵篩選挑取發酵液粘度最高的一株，命名％ Bacillus subti I is FRD518。將原始菌株和subti I is FRD518 分別接
種到250ml含有50ml種子培養基的三角瓶中，37 °C過夜培養，搖床轉速為210rpm。將培養好的種子以2%的接種量接種于250ml含有50ml發酵培養基的三角瓶中，37°C培養48~72h，搖床轉速為210rpm。發酵結束后取Iml發酵液，稀釋10倍，12000r/min、4°C離心IOmin,取上清液,經微孔濾膜過濾,進行色譜分析,色譜分析條件為:色譜柱:Hypersil BDSC18, 5 μ m, 4.6mmX 250mm ;流動相:磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀，pH6.98 ;流速:lml/min ;柱溫300C ;波長220nm，Agilent高效液相色譜化學工作站進行色譜數據處理。發酵結果如圖2。
[0018]結果表明，相同條件下，發酵72h時，基因工程菌FRD518聚谷氨酸產量達到45.2g/1，生物量達到18.lg/l ;而原始菌株的聚谷氨酸產量僅為24.6g/l，生物量達到13.2g/l，聚谷氨酸產量提高了 83.7%。
[0019]實施例四:基因工程菌FRD518 IOL發酵罐上單批發酵培養高產Y -聚谷氨酸 IOL發酵罐上單批發酵培養基因工程菌FRD518和原始菌，發酵培養基含有:蔗糖100g/
L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物20 g/L，硫酸銨5 g/L，谷氨酸鈉70 g/L，硫酸鎂I g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，裝液量8L。將培養好的種子以5%的接種量接種發酵培養基中，培養72h，發酵培養溫度為36~37°C，發酵過程控制pH為6.0-7.5，通過調節攪拌速度和通氣量控制溶解氧DO在20%以上，罐壓0.05~0.08mPa。發酵結果如圖3。
[0020]結果表明，發酵發酵72 11時，基因工程菌？1?518聚谷氨酸產量達到47.9 g/Ι，而原始菌株的聚谷氨酸產量僅為26.4 g/Ι，改造后基因工程菌FRD518聚谷氨酸產量提高了81.4%。
[0021]實施例五:基因工程菌FRD518 IOL發酵罐上流加補料發酵培養高產Y -聚谷氨酸
在IOL發酵罐上通過連續流加補料的方式發酵生產Y-聚谷氨酸。發酵初始培養基含:鹿糖40 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,硫酸銨5 g/L,谷氨酸鈉20 g/L,硫酸鎂I g/L，磷酸氫二鉀10 g/L，裝液量6L。將培養好的種子以5%的接種量接種發酵培養基中。發酵初始pH為7.0，發酵培養溫度為35~37.5°C，罐壓0.05、.08mPa,調節攪拌速度和通氣量控制溶解氧DO在10%以上。當發酵18h時，糖濃度低于5 g/L，pH上升至7.0以上時，開始連續流加蔗糖、谷氨酸鈉和酵母提取物等，其中50% (w/v)蔗糖溶液流加速度為6mL / (L*h)，流加至60h結束補料，20%酵母提取物(w/v)溶液流加速度為3 mL / (L*h)，流加至50h結束補料，50% (w/v)谷氨酸鈉溶液流加速度為3.2 mL / (L*h)，流加至55h結束補料，補料結束后繼續發酵至73h時，碳源和谷氨酸鈉消耗完結束發酵。發酵結果如圖4。
[0022]結果表明，基因工程菌FRD518流加補料培養時Y -聚谷氨酸產量達到67.5 g/1，比IOL罐單批培養時提高了 40.9%，比原始野生菌株單批培養時產量提高了 156%。[0023]實施例六:基因工程菌FRD518 100L發酵罐上流加補料發酵培養高產Y -聚谷氨
酸
在100L發酵罐上通過連續流加補料的方式發酵生產Y-聚谷氨酸。發酵初始培養基含:碳源60 g/L (葡萄糖:甘油:檸檬酸=3:1:2)，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，硫酸銨5 g/L，谷氨酸鈉20 g/L，硫酸鎂I g/L，磷酸氫二鉀10 g/L，裝液量50L。將培養好的種子以5%的接種量接種發酵培養基中。發酵初始pH為7.0，發酵培養溫度為36~37°C，罐壓0.05、.08mPa，調節攪拌速度和通氣量控制溶解氧DO在10%以上。當發酵12h時，pH上升至7.0以上時，開始連續流加碳源、谷氨酸鈉和酵母提取物等，其中50% (w/v)碳源(葡萄糖:甘油:檸檬酸=3:1:2)溶液流加速度為4.8 mL / (L*h)，流加至60h結束補料，20%酵母提取物(w/v)溶液流加速度為3.5 mL / (L*h)，流加至54h結束補料，50% (w/v)谷氨酸鈉溶液流加速度為3.6 mL / (L*h)，流加至55h結束補料，補料結束后繼續發酵至75h時，碳源和谷氨酸鈉消耗完結束發酵。發酵結果如圖5。
[0024]結果表明，基因工程菌FRD518流加補料培養時Y -聚谷氨酸產量達到65.3 g/1,比IOL罐單批培養時提高了 36.3%`，比原始野生菌株單批培養時產量提高了 147%。
【權利要求】
1.一株高產Y-聚谷氨酸的基因工程菌，該基因工程菌株名為枯草芽孢桿菌(.Bacillus subti I is) FRD518，其特征在于:于2012年11月02日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6772。
2.按照權利要求1所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌心subtilis)mm\S,其特征在于:該基因工程菌為同源重組菌，染色體上重組了含有啟動子P43、同源重組序列amyE和氯霉素抗性篩選標記的透明顫菌血紅蛋白基因vgb重組載體，重組基因工程菌能成功聞表達血紅蛋白活性，提聞貧氧條件下該菌的攝氧能力和代謝能力。
3.按照權利要求1和2所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌{Bacillussub tills )FRD518,其特征在于:含有同源重組載體的基因序列結構為:pBluescriptsk(+)-amyE-P43-cat-vgb-amyE。
4.按照權利要求1、2和3所述的基因工程菌株枯草芽孢桿菌(feci77心subtiI is)FRD518，其特征在于:基因組上含有透明顫菌血紅蛋白基因1?力，其具有GENEBANKAceession Number 為 M30794 的 5'端第 142-582 位核昔酸序列。
5.一種利用基因工程菌株枯草芽孢桿菌)FRD518發酵生產gamma-聚谷氨酸的方法，其特征在于:所述液體發酵培養基含有:蔗糖、葡萄糖、甘油、檸檬酸中任一種或以上混合物30~150g/L，蛋白胨5~30 g/L，酵母提取物5~30 g/L，硫酸銨5~20 g/L，谷氨酸鈉30~100 g/L，硫酸鎂0.2~2 g/L，磷酸氫二鉀2~10 g/L ;發酵培養溫度為33~38°C，發酵過程控制PH為6.0-7.5，通過調節攪拌速度和通氣量控制溶解氧DO在10%以上，罐壓.0.05^0.08mPa。
6.一種利用基因工程菌株枯草芽孢桿菌)FRD518發酵生產gamma-聚谷氨酸的方法，其特征在于:通過連續流加補料的方式發酵生產Y -聚谷氨酸，發酵初始培養基中碳源(碳源為蔗糖、葡萄糖、甘油、檸檬酸中任一種或以上混合物)為3(T50g/L，蛋白胨5~30 g/L，酵母提取物5~15g/L，硫酸銨5~20 g/L，谷氨酸鈉20-40 g/L，硫酸鎂.0.2^2 g/L，磷酸氫二鉀2~10 8/1;發酵初始？!1為7.0，發酵培養溫度為35~37.51:，罐壓.0.05、.08mPa，調節攪拌速度和通氣量控制溶解氧DO在10%以上；當發酵約12~18h時，碳源濃度低于5 g/L，pH上升后，分別開始連續流加碳源、谷氨酸鈉和酵母提取物等，其中50% (w/v)碳源溶液流加速度為4~6 mL /(L*h)，流加至5(T60h結束補料，20%酵母提取物(w/v)溶液流加速度為2.5~5 mL /(L*h)，流加至4(T50h結束補料，50% (w/v)谷氨酸鈉溶液流加速度為2~4 mL /(L*h)，流加至5(T60h結束補料，補料結束后繼續發酵至碳源和谷氨酸消耗完結束發酵。
【文檔編號】C12P13/02GK103881954SQ201210555304
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2012年12月20日
【發明者】李海軍, 蘇移山, 朱希強, 張曉元, 顏震, 王林, 凌沛學 申請人:山東福瑞達生物科技有限公司