專利名稱：一種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法
技術領域：
本發明涉及ー種特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，尤其是指ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法。
背景技術：
DGGE (變性梯度凝膠電泳)和TGGE (溫度梯度凝膠電泳)是兩種基于DNA片段序列差異的電泳技術，早期常用于基因突變的有效檢測，目前已經成為微生物菌群多祥性研究的重要手段。采用這兩項技術可以分離長度相同但序列不同的DNA片段，片段的分離是依靠雙鏈DNA在含有化學變性劑梯度(DGGE)或者溫度梯度(TGGE)的凝膠當中泳動時具有不同的解鏈行為來實現的。為了盡可能有效地檢測序列當中的所有突變，通常在目標片段的 一端加上一段30bp-50bp的高GC片段——由人工合成加在引物的5’端，則經過PCR擴增其產物末端就含有該片段；在進行DGGE或者TGGE分析吋，該高GC區域將使得目標片段在變性梯度環境中不至于完全解鏈，就可以實現對所有可能的單堿基突變進行檢測，此即GC夾板策略。對于菌群結構研究而言，序列各種單堿基差異的有效識別，將有助于菌群多祥性的準確解析。相關研究表明，對于50_1000bp范圍內的片段如果采用天然序列，DGGE只能檢測所有可能的單堿基突變的50% [V. C. Sheffield, D. R. Cox, L. S. Lerman,R. M. Myers. Attachment of a 40-base-pair G + C-rich sequence (GC-ciamp) togenomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improveddetection of single-base changes [J]. Proc. Natl. Acad. ScL USA . 1989,86:232-236.];而采用GC夾板策略，則可以大大提高DGGE/TGGE的突變檢出率，幾乎可以檢測任何可能的單喊基突變[R. M. Myers, S. G. Fischer, T. Maniatis, et al. Nearlyall single base substitutions in DNA iragnents joined to a bC-clamp can bedetected by denaturing gradient gel electrophoresis [J]. Nucleic Acids Res.1985，13 (9) :3131-3145.]，因此目前該策略已被幾乎所有的DGGE或TGGE相關研究(包括菌群結構研究)所采用。然而在進行菌群結構研究吋，需要同時合成包括含有GC夾板的長引物和不含GC夾板的普通引物兩套引物，尤其是含有GC夾板的長引物通常在60bp以上需要較高的成本，此外有時會出現GC長引物擴增效率降低的情況。事實上，在采用某些特定的DNA片段進行DGGE或TGGE分析吋，GC夾板的有無并不會影響到實驗結果。
發明內容
本發明提供了ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段進行的DGGE/TGGE分析無需GC夾板，就可以獲得同帶有GC夾板一致的結果，可以節約實驗成本、減少實驗操作步驟。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案如下ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA遠離ITS序列的末端區域的片段，以SaccharomycescereFisiae標準菌株NCYC 505的18S rDNA序列為參照,所述18S rDNA遠離ITS序列的末端區域相當于其起于第I到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。述DGGE/TGGE分析方法包含如下步驟
a、提取所研究樣品的基因組DNA；
b、擴增特定18SrDNA片段；
C、將步驟b擴增獲得的特定18S rDNA片段進行DGGE或TGGE分析；
d、割膠回收目的條帶并采用同樣的引物對片段進行重新擴增；所述同樣的引物即步驟 b中用于擴增特定18S rDNA片段的引物；
e、對重擴增的片段進行序列測定，測定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank數據庫中進行相似性搜索并根據結果判定序列所對應菌株的種屬。發明采用特定18S rDNA片段進行DGGE分析時，變性劑梯度上限小于40%。本發明的顯著優點本發明提供了ー種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，凡采用特定18S rDNA片段進行的DGGE/TGGE分析無需GC夾板，就可以獲得同帶有GC夾板一致的結果，可以節約實驗成本、減少實驗操作步驟。
圖I是18S rDNA遠離ITS序列的末端區域示意圖；圖中只展示出18S rDNA片段及與其相鄰的ITS片段，其中黒色區帶部分表示的是18S rDNA片段，白色區帶部分表示的是ITS片段，雙箭頭區域表示的是18S rDNA遠離ITS序列的末端區域。圖2是16種真菌的18S rDNA末端區域的序列比對圖譜；圖中ト16表示16種菌的編號，所代表的種屬詳見表I，圖中NSl表不引物；圖中ruler標識的1-160區域為低GC含量片段，而160-280區域含有三個高GC含量片段，分別用三個方框大致標出。引物NSl的靶向位點位于18S rDNA遠離ITS序列的末端區域中。雖然收集到的各真菌的18S rDNA序列在遠離ITS序列的末端起始情況不一，但至少起始于第20位點，為了分析方便，部分真菌的18S rDNA序列末端以引物NSl序列補齊，這樣并不會影響到其低GC含量的序列特性。圖3是引物對NSl-fung和NSl-GCfung擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜。圖4是引物對NSl-fung和NSl-GCfung擴增片段的DGGE分析圖譜。圖5是引物對NSl-fung重擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜；重擴增模板為圖4中的20條DGGE條帶的割膠回收液，圖中的字母代表模板在圖4中的標識。
具體實施例方式一、本發明基于特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析原理
經過對目前已知的各主要真菌種屬的18S rDNA序列進行分析發現，18S rDNA遠離ITS序列的末端區域(參見圖I)具有特殊的序列特性其一端含有180bp左右的低GC區域，相當子 Saccharomyces cereFisiae 標準菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列(Accession Number為Z75578)的1-183位點，其平均GC含量只有35%左右，并且具有極高的可變性；緊鄰低GC區域的另一端含有三個排列緊湊的高GC區域,分別相當于Saccharomyces cerevisiae標準菌株NCYC 505 的 18S rDNA序列(Accession Number 為 Z75578)的 184-202位點、223-244位點和268-291位點，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。這樣就導致18SrDNA遠離ITS序列的末端區域擁有低熔解區和高熔解區，并且兩者之間的熔解性質差異將十分懸殊。因此包含該末端區域的片段可以在低變性梯度的條件下利用低熔解區差異進行分離，剩下的部分相當于高熔解區則不會發生解鏈可以充當GC夾板。述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA遠離ITS序列的末端區域的片段，以Saccharomyces cereFisiae 標準菌株NCYC 505 的 18S rDNA序列為參照，所述 18S rDNA遠離ITS序列的末端區域相當于其第I到第291核苷酸位點范圍的片段。(基于現有的真菌18S rDNA引物，如引物對NSl-fung或引物對NSlm_NS2+10的擴增片段即屬所述特定18SrDNA片段，引物序列如下
NSl (SEQ ID NO. I) :5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’ ；fung (SEQ ID NO. 2) :5’-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3’ ；
GCfung (SEQ ID NO. 3) :5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3’ ；
NSlm (SEQ ID NO. 4) :5’-CCAGTAGTCATATGCTTGTC-3’ ；
NS2+10 (SEQ ID NO. 5) :5’-GAATTACCGCGGCTGCTGGC-3’)。所述18S rDNA遠離ITS序列的末端區域的一端含有的低GC區域，其全長約180個核苷酸，需要說明的是特定18S rDNA片段并不一定要包含該低GC區域全長，以Saccharomyces cereFisiae標準菌株NCYC 505的18S rDNA序列為參照,所述低GC區域可以起于相當于其第I到第30位點范圍內任ー核苷酸。所述低GC區域具有極高的可變性是指對于大多數真菌種屬而言，該區域片段序列是不一樣的。所述三個高GC區域具有良好的保守性是指對于大多數真菌種屬而言，在對應的區域均存在這樣三個高GC含量的片段。其中對于特定的18S rDNA片段，其在DGGE/TGGE中的分離主要取決于低GC區域，因此可以采用低的變性劑梯度范圍。鑒于低GC區域平均GC含量只有35%左右，因此變性劑梯度上限小于40%即可。其中對于特定的18S rDNA片段，與其低熔解區末端相対的的另外ー末端的引物對應區域GC含量不能低于40%，以保證該末端能在低變性梯度條件下不發生解鏈。這一點十分容易達成。(如引物對NSl-fung或引物對NSlm-NS2+10的擴增片段即滿足這一點)。ニ、本發明不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析步驟
a、提取所研究樣品的基因組DNA；
b、擴增特定18SrDNA片段；
c、將步驟b擴增獲得的特定18SrDNA片段進行DGGE或TGGE分析；
d、割膠回收目的條帶并采用同樣的引物對片段進行重新擴增；所述同樣的引物即步驟b中用于擴增特定18S rDNA片段的引物；
e、對重擴增的片段進行序列測定，測定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank數據庫中進行相似性搜索并根據結果判定序列所對應菌株的種屬。下面結合具體實施例對本發明做進ー步說明，但本發明并不限于此。
在本實施例進行之前，以福建紅曲黃酒釀造用曲中的真菌菌群的18S rDNA序列為例，對其遠離ITS序列的末端區域的序列特性進行分析。實驗室前期從四種典型福建紅曲黃酒釀造用曲中分離出23株真菌純菌株，經鑒定共有16種。在Silva數據庫中收集這些真菌種屬的18S rDNA序列，利用clustalx軟件(clustalx I. 8)進行比對,截取引物NSl 對應末端區域的比對結果如圖2所示；對引物NSl對應末端區域的序列熔解特性進行統計分析，結果如表I所示。結合圖2和表I可知，所收集到的18S rDNA序列一端含有160bp 左右的低GC區域,相當于cereFisiae標準菌株NCYC 505的18S rDNA序列(Accession Number為Z75578)的20-183位點，其平均GC含量只有35%左右，并且具有極高的可變性；緊鄰低GC區域的另一端含有三個排列緊湊的高GC區域(圖2方框部分)， 分別相當于cereFisiae 標準菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列(Accession Number為Z75578)的184-202位點、223-244位點和268-291位點，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。這樣就導致18S rDNA遠離ITS序列的末端區域擁有低熔解區和高熔解區，并且兩者之間的熔解性質差異將十分懸殊。因此包含該末端區域的片段可以在低變性梯度的條件下利用低熔解區差異進行分離，剩下的部分相當于高熔解區則不會發生解鏈可以充當GC夾板。經過分析，目前已知的各主要真菌種屬的18S rDNA序列也具有相同的特性。
認Saccharomyces cereFisiae 標準菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列為參照，引物 fung的靶向位點為351-368，也就是說引物對NSl-fung的擴增片段長度約為350bp，包含 18S rDNA遠離ITS序列的末端區域，因此屬于所述特定18S rDNA片段。
表I 16種真菌的18S rDNA末端區域的序列特性信息
權利要求
1.一種不基于GC夾板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于所述特定18S rDNA片段是指包含18S rDNA遠離ITS序列的末端區域的片段，以Saccharomyces cereFisiae 標準菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列為參照,所述 18S rDNA 遠離ITS序列的末端區域相當于其起于第I到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。
2.根據權利要求I所述的一種不基于GC夾板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于所述方法包含如下步驟 a、提取所研究樣品的基因組DNA； b、擴增特定18SrDNA片段； C、將步驟b擴增獲得的特定18S rDNA片段進行DGGE或TGGE分析； d、割膠回收目的條帶并采用同樣的引物對片段進行重新擴增；所述同樣的引物即步驟b中用于擴增特定18S rDNA片段的引物； e、對重擴增的片段進行序列測定，測定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank數據庫中進行相似性搜索并根據結果判定序列所對應菌株的種屬。
3.根據權利要求I或2所述的一種不基于GC夾板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，其特征在于采用特定18S rDNA片段進行DGGE分析時，變性劑梯度上限小于 40% o
全文摘要
本發明提供了一種不基于GC夾板策略的特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析方法，所述特定18SrDNA片段是指包含18SrDNA遠離ITS序列的末端區域的片段，以Saccharomycescerevisiae標準菌株NCYC505的18SrDNA序列為參照，所述18SrDNA遠離ITS序列的末端區域相當于其起于第1到第30位點范圍內任一核苷酸止于第291位點核苷酸的片段。本發明采用特定18SrDNA片段的DGGE/TGGE分析無需GC夾板，就可以在相同條件下獲得同帶有GC夾板一致的結果，因此可以節約實驗成本、減少實驗操作步驟。
文檔編號C12R1/865GK102978292SQ20121057387
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者倪莉, 黃志清, 黃山, 靳爽 申請人:福州大學