專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株的制作方法
一種雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株技術領域
本發明屬于疫苗抗原篩選技術領域，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(IB)是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性高度接觸性呼吸道疾病，以氣管啰音、咳嗽、打噴嚏、幼雞流鼻涕、產蛋雞產蛋量減少和蛋的品質下降為特征；患病雞常因為呼吸道、腎臟或消化道感染而引起死亡。本病于1931年首先由 Schalk等報道于美國，1936年由Beach和Hudson確定本病的病原為病毒。至今本病在世界范圍內廣泛流行，給養雞業帶來嚴重危害。在我國，鄺榮祿(1972)在廣東首次發現本病； 到上世紀70年代后期，鄭福榮等在杭州、吳志達等在上海、艾國光等在北京、辛朝安等在廣州分別自種用雞群中分離出IBV。榮駿弓等(1997)在患有腺胃腫大的病雞中分離到腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒D971株，用該毒株回歸SPF雛雞引起典型腎炎及腺胃炎病變，并從人工感染SPF雛雞中回收到雞傳染性支氣管炎病毒。王玉東、范根成等(1998)在山東省某患有腺胃腫大發病雞群中采集病料，通過雞胚連續傳5 6代，經電鏡觀察、動物回歸和免疫保護試驗、用氣管環組織培養進行理化特性測定、毒價測定、中和試驗等，證明目前流行的以腺胃腫大為主要特征的傳染病的病原是冠狀病毒，將該毒株命名為腺胃型雞傳染性支管炎病毒QX株。
在歐洲，分別于2001年在俄羅斯東部及2002年在俄羅斯西部分離到IBV類QX 株(Bochkov et al，2006)，該毒株能引起雞患腺胃炎、腎炎，與QX株相似。從2003年起許多歐洲國家相繼分離到IBV類QX株，包括德國、荷蘭、比利時、法國、意大利( Worthington et al, 2008 ；Monne et al, 2008)、波蘭(Domanska-Blicharz et al, 2006)、英國(Gough et al，2008)和西班牙(Dolz et al，2009)。各種相關研究報道表明整個歐洲地區都有類QX 株病毒的存在。顯然，IB類QX株對于禽養殖來說是很大的威脅，而目前尚無專門針對IB類 QX株的疫苗。國外學者將類QX毒株在雞胚上連續傳代80余代致弱的IB L1148毒株制成 IB類QX株的活疫苗，并進行相關的效力和安全性試驗。表明對于SPF雞亦或是攜有母源抗體的雞，經IB LI 148株制成的活苗免后對類QX株D388的攻毒都能提供有效保護。
免疫接種是防治雞傳染性支氣管炎的最有效手段。目前，國內外用于預防腺胃型傳染性支氣管炎疫苗的研究較多，但均尚未商品化。同時由于IBV血清型眾多，市場上一直未有交叉保護力好的弱毒株，腺胃型IB得不到有效控制。因此，篩選獲得新的具有較好保護力的IB弱毒株就顯得尤為重要。發明內容
本發明的目的是提供一種雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株，即一種新的腺胃型雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗株，用該弱毒疫苗株所制備的疫苗對目前中國流行腺胃型雞傳染性支氣管炎病毒的攻擊能提供良好的免疫保護效力。
本發明的雞傳染性支氣管炎病毒(Avianinfectious bronchitis virus)YB160, 該病毒株于2012年10月31日保藏在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 6752。
本發明篩選的弱毒疫苗株用來制備用于防治雞傳染性支氣管炎的疫苗。
本發明篩選的雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株無論人工感染還是水平傳播感染在雞體連續傳代，均未見毒力返強現象，遺傳性穩定，符合雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗株無毒力返強的標準，制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護，具有很好的商品化開發前景。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明。本領域的技術人員應該理解的是，在不偏離本發明精神和范圍的前提下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換， 但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍。
一、本發明雞傳染性支氣管炎弱毒YB160株的篩選
使用l(Tll日齡SPF雞胚對傳染性支氣管炎強毒進行連續傳代致弱，每代通過尿囊腔接種4枚SPF雞胚，連傳至160代，進行致弱評價。取10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、110、120、130、140、150、160傳代接種的病毒株感染I日齡的SPF雞。結果從第80代病毒株開始無死亡雞，第90代毒株接種的雞開始無眼觀病變，第130代接種的雞開始無組織學病變。說明IBV第130代已經完全致弱，對雞只具有良好的安全性。同時用本發明毒株130、140、150160代分別免疫3日齡SPF雞，于免疫后14日，用同源強毒攻擊。免疫組分毒率0/10 1/10，保護率9/10 10/10，對照組分毒率10/10。結果說明本發明毒株具有良好的免疫保護性。為了便于同以前毒株區分，將傳代160代弱化的雞胚毒定為原始種子 El代，并將該致弱毒株命名為ΥΒ160株。選取IBV YB 160株作為疫苗研制的候選毒株，并于 2012年10月31日保藏于中國科學院中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6752。
二、IBV ΥΒ160株的安全性檢測
毒力返強試驗將ΥΒ160株的El代在SPF雞體上人工感染和同居感染分別連續傳 5代，試驗雞均一切正常，接種后5天剖檢氣管、腺胃、腎臟等均未見肉眼病理變化；試驗發現病毒分離氣管棉拭子和腺胃第4代起分不到病毒，腎臟從第3代起分不到病毒，肝臟從第 2代起分不到病毒。試驗雞氣管、腺胃、腎臟等組織勻漿中分毒不通器官病毒分離率不同，氣管、腺胃病毒分離率較高，說明該毒株主要在氣管、腺胃兩個器官增殖。隨著代次的增加病毒向外排泄也逐漸減少，分毒率逐漸降低。水平感染試驗也出現人工感染同樣的規律，只是同居感染同代次分毒率相對人工感染低。以上試驗結果證明該毒株無論人工感染還是水平傳播感染在雞體連續傳代，均未見毒力返強現象，遺傳性穩定，符合雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗株無毒力返強的標準，可以作為疫苗毒株進行商品化開發。
IBV YB 160株毒種安全性試驗取IBV YB 160株基礎種子Ε2、Ε4、Ε7、Ε10, Ε13代毒種以IO5 ciEID5tl滴鼻I滴(約O. 03ml)，分別接種1、3日齡SPF雞，連續觀察10日。結果接種雞只均健活，均 無任何異常反應。結果見表1、2。
表IIBV YB160株毒種的安全性試驗結果
權利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒，其保藏編號為=CGMCC No. 6752。
2.權利要求1所述的病毒在制備疫苗中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的疫苗用于預防雞傳染性支氣管炎病。
全文摘要
本發明涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株，該病毒株的保藏編號為CGMCC No.6752。本發明篩選的弱毒疫苗株用來制備用于防治雞傳染性支氣管炎的疫苗。本發明篩選的雞傳染性支氣管炎病毒弱毒疫苗株無論人工感染還是水平傳播感染在雞體連續傳代，均未見毒力返強現象，其遺傳性穩定，符合雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗株無毒力返強的標準，可以作為疫苗毒株進行商品化開發。
文檔編號C12R1/93GK102994460SQ20121059477
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者范根成, 杜元釗, 宋新宇, 宮曉, 孫健, 王紅, 徐保娟 申請人:青島易邦生物工程有限公司