專利名稱：一種opn基因的實時熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及生物 技術領域，具體涉及ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒。
背景技術：
2005年美國衛生研究院、疾控中心等多家単位做了ー個年度報告，“認為人類在抗癌大戰中是失敗”，也就是說癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是1，腫瘤細胞異質性；2，腫瘤細胞耐藥性；3，抗癌藥物設計思路不完善等。同吋，該報告中亦提出應重新審視現有的診治癌癥的措施。本發明人在研究中發現，導致癌癥死亡率不降的另ニ個重要原因是1，不能真正做到早期診斷；2，轉移的病理機制不清楚。所以檢測腫瘤相關基因的表達量來輔助診斷各類癌癥，有非常重要的臨床價值。骨橋蛋白(osteopontin, 0ΡΝ)是ー種分泌性I丐結合糖磷酸化蛋白，人OPN基因位于4q13位點。Tiniakos等研究發現OPN在伴網膜種植、淋巴結轉移的卵巢腫瘤中的陽性表達率較低。Tuck等采用免疫組化和原位雜交方法研究了淋巴結陰性的原發性乳腺癌中骨橋蛋白在細胞中的分布，結果表明腫瘤細胞中骨橋蛋白表達和生存率關系密切，乳腺癌細胞分泌的骨橋蛋白或從環境中結合的骨橋蛋白的表達和腫瘤的高侵襲及不良預后負相關。Ue等研究了 40例胃癌，5例轉移灶中骨橋蛋白的表達和周圍征程的粘膜組織相比，72. 5%的原發性腫瘤，60%的淋巴結轉移灶過度表達OPN mRNA, OPN mRNA水平的增加與臨床病理階段的發展有夫。最近，美國國立癌癥研究所應用的cDNA微列陣技術，比較40例伴和不伴播散的肝癌中9180個基因表達譜的變化，發現在伴肝內轉移的肝癌中骨橋蛋白表達水平顯著升高，其抗體可在體外阻斷高轉移肝癌細胞的侵襲能力和體內肺轉移，提示OPN可作為肝癌的預后指標和潛在的治療靶點。OPN基因，NM00582,1616bp，mRNA。免疫組化是檢測組織樣本中OPN蛋白表達常用的方法，但大多數腫瘤患者是晚期，失去了手術機會，大塊腫瘤組織難以獲得。而實時熒光定量PCR技術以其特異性強，所需組織少(活檢組織，脫落細胞等)，定量，敏感，方便等優點已得到全世界的公認，廣泛用于腫瘤相關基因，病原體等諸多臨床檢測。用定量PCR法檢測腫瘤相關基因，就能在基因水平上對腫瘤做更精確的早期診斷。而成熟標準的試劑盒是定量PCR成功檢測的關鍵。目前熒光實時定量PCR所使用的熒光化學方法主要用染料法(SYBR Green I染料)和探針法。其中SYBR Green I是ー種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料，檢測靈敏度很高，SYBRGreenI染料法不需要設計序列特異性探針，而且熔點曲線來分析產物的均一性，有助于更準確的分析和識別擴增產物和引物ニ聚體，是ー種簡便，性價比較高的實時監測方法；但是，由于SYBR Green I與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物ニ聚體，單鏈ニ級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。
實用新型內容本實用新型的目的在于克服現有技術中的不足，提供ー種OPN基因的實時熒光PCR(qPCR)檢測試劑盒，用于鑒定不同腫瘤組織中OPN基因的表達水平，為腫瘤早期診斷和干預提供重要的輔助指標。本實用新型的技術方案為ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括盒體，所述盒體內設有襯墊，所述襯墊上設有五個容器孔，所述容器孔內分別對應放置有裝有染料法PCR反應液的試劑瓶、OPN基因引物的試劑瓶、內參基因引物的試劑瓶、陰性對照的試劑瓶以及陽性對照的試劑瓶。較優的，所述盒體內還設有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒、或裝有空離心管的離心管盒中的ー種或多種，所述裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒和裝有空離心管的離心管盒均位于所述襯墊的下方。本實用新型試劑盒襯墊上的容器孔既可以貫穿所述襯墊，也可以是上方開ロ、下方封閉的凹陷結構；并且容器孔的直徑與其內放置的試劑瓶的直徑相匹配，既可以兩者直徑相同，使容器孔內的試劑瓶被固定住無法活動，也可以使容器孔的直徑略大于其內試劑 瓶的直徑。更優的，所述盒體內襯墊的下方還設有第二襯墊，所述第二襯墊上設有三個槽位，所述槽位內分別對應放置有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒以及裝有空離
心管的離心管盒。更優的，所述盒體內襯墊的下方還設有第二襯墊，所述第二襯墊上設有兩個槽位，所述槽位內分別對應放置有裝有去離子水的試劑瓶和裝有移液槍槍頭的槍盒，或者放置有裝有去離子水的試劑瓶和裝有空離心管的離心管盒，或者放置有裝有移液槍槍頭的槍盒和裝有空離心管的離心管盒。更優的，所述盒體內襯墊的下方還設有第二襯墊，所述第二襯墊上設有ー個槽位，所述槽位內放置有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒或裝有空離心管的離心管盒。最優的，所述槽位為與其內放置的試劑瓶、槍盒或離心管盒的輪廓相匹配的下陷凹槽。最優的，所述裝有去離子水的試劑瓶在所述第二襯墊上水平放置，并且所述試劑瓶瓶身的最大直徑小于等于對應的所述槽位的深度。最優的，所述槍盒在所述第二襯墊上水平放置，并且所述槍盒盒體的高度小于等于對應的所述槽位的深度。最優的，所述離心管盒在所述第二襯墊上水平放置，并且所述離心管盒盒體的高度小于等于對應的所述槽位的深度。本實用新型試劑盒的使用方法(I)擴增檢測取試劑盒中染料法PCR反應液試劑瓶、OPN基因引物試劑瓶、內參基因引物試劑瓶中的試劑，補充去離子水，與待測樣品配置總體積為20ul的qPCR反應體系，在熒光定量PCR儀上進行檢測；每次檢測還應分別取陰性對照試劑瓶和陽性對照試劑瓶中的試劑設置陽性對照和陰性對照。(2)反應條件95°C變性15秒；95°C 5秒，60°C，30秒，共40個循環，每個循環后自動讀數I次，72°C 30秒處采集熒光信號。(3)結果分析分析擴增產物的溶解曲線，確定是否存在非特異性擴增；根據目的基因和內參基因的Λ Ct來判斷目的基因的相對表達量Λ Ct越小，說明目的基因的表達量越尚。試劑盒中除包括上述物質外，還可包括常規PCR測試時所需要的試劑、工具或容器以及說明書等。本試劑盒保存于_4°C，盡量減少反復凍融。本實用新型建立了利用SYBR Green I熒光染料PCR技術檢測OPN基因表達的方法，并經檢測患者標本證實該方法切實可行。有益效果本實用新型的ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒設計合理，特異性高，與現有探針法的試劑盒相比相比不需要設計熒光探針，操作方便且節約成本。
圖I :ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒結構示意圖(I.盒體2.襯墊3’ _7’ ·容器孔3-7.試劑瓶)圖2 :—種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒結構示意圖(I.盒體2.襯墊3’ -7’ .容器孔3-7.試劑瓶2’第二襯墊8’ -10’ .槽位8.試劑瓶9.槍盒10.離心管盒)圖3 :—種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒結構示意圖(I.盒體2.襯墊3’ -7’ .容器孔3-7.試劑瓶2’ .第二襯墊8’ -9’ .槽位8.試劑瓶9.槍盒)圖4 :ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒結構示意圖(I.盒體2.襯墊3’ -7’ .容器孔3-7.試劑瓶2’ .第二襯墊8’ .槽位8.試劑瓶)圖5:待測樣品擴增曲線圖6 :0ΡΝ基因溶解曲線圖圖7 :內參基因GAPDH的溶解曲線圖
具體實施方式
如圖I所示的ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括盒體1，盒體I內設有襯墊2，襯墊2上設有五個容器孔(3’ -7’)，容器孔(3’ -7’)內分別對應放置有裝有染料法PCR反應液的試劑瓶3、OPN基因引物的試劑瓶4、內參基因引物的試劑瓶5、陰性對照的試劑瓶6以及陽性対照的試劑瓶7。本實用新型的試劑盒，其盒體I內還設有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒，以及裝有空離心管的離心管盒；并且裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒，以及裝有空離心管的離心管盒位于襯墊2的下方。為了防止裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒，以及裝有空離心管的離心管盒在運輸過程中晃動，本實用新型的試劑盒還可以如圖2所示，盒體I內襯墊2的下方還設有第二襯墊2’，第二襯墊2’上設有三個槽位8’-10’，槽位8’-10’內分別對應放置有裝有去離子水的試劑瓶8、裝有移液槍槍頭的槍盒9以及裝有空離心管的離心管盒10。或者，本實用新型的試劑盒還可以如圖3所示，盒體I內襯墊2的下方還設有第二襯墊2’第二襯墊2’上設有兩個槽位8’ -9’，槽位8’ -9’內分別對應放置有裝有去離子水的試劑瓶8和裝有移液槍槍頭的槍盒9。或者，本實用新型的試劑盒還可以如圖4所示，盒體I內襯墊2的下方還設有第二襯墊2’第二襯墊2’上設有ー個槽位8’，槽位8’內放置有裝有去離子水的試劑瓶8。為了控制試劑盒體積，節省包裝材料，本實用新型試劑盒的裝有去離子水的試劑瓶8在第二襯墊2’上水平躺倒放置，并且試劑瓶8瓶身的最大直徑小于等于槽位8，的深度。槍盒9在第二襯墊2’上水平放置，并且槍盒9盒體的高度小于等于槽位9’的深度。離心管盒10在第二襯墊2’上水平放置，并且離心管盒10盒體的高度小于等于槽位10’的深度。本實用新型試劑盒中，染料法(SYBR Green I )PCR反應液的成分包含Taq酶、緩沖液、SYBR Green I染料。此類反應試劑為已知技術，本實用新型的染料法PCR反應液優選為 SYBR premix ex Taq (購自 TAKARA 公司)。檢測用引物有兩對0ΡΝ基因引物；內參基因引物(GAPDH，管家基因)。(I) OPN基因引物的序列為正向引物5’-TGATGAATCTGATGAACTGGTC-3’反向引物5’ -GGTGATGTCCTCGTCTGTAG-3，(2)內參基因引物的序列為正向引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’反向引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為無OPN基因表達的cDNA樣本，陽性對照為有OPN基因表達的cDNA樣本。本實用新型的ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒的使用方法(I)取準備好的離心管，或者本實用新型離心管盒10中的離心管，按說明書分別加入染料法PCR反應液的試劑瓶3、OPN基因引物的試劑瓶4、內參基因引物的試劑瓶5中的試劑，加入待測樣品，以及裝有去離子水的試劑瓶8中的去離子水，制備待測樣品的qPCR擴增體系。(2)另取兩支離心管，分別制備陽性對照和陰性對照的qPCR擴增體系。(3)反應條件95°C變性15秒；95°C 5秒，60°C，30秒，共40個循環，每個循環后自動讀數I次，72°C 30秒處采集熒光信號。(4)結果分析分析擴增產物的溶解曲線，確定是否存在非特異性擴增；根據目的基因和內參基因的Λ Ct來判斷目的基因的相對表達量Λ Ct越小，說明目的基因的表達量越尚。待測樣品的qPCR擴增體系總體積20ul :其中PCR反應液10ul，待測樣品I. Oul,正向引物O. 25ul，反向引物O. 25ul，去離子水8. 5ul。陽性對照的qPCR擴增體系總體積20uI :其中PCR反應液IOuI，陽性對照品I. OuI，正向引物O. 25ul，反向引物O. 25ul，去離子水8. 5ul。陰性對照的qPCR擴增體系總體積20uI :其中PCR反應液IOuI，陰性對照品I. OuI，正向引物O. 25ul，反向引物O. 25ul，去離子水8. 5ul。試劑盒中除包括上述物質外，還可包括常規PCR測試時所需要的試劑、工具或容器以及說明書等。本試劑盒保存于_4°C，盡量減少反復凍融。本實用新型試劑盒的實際應用[0057]I.引物及探針設計與合成分別以OPN基因和GAPDH全長cDNA序列(GeneBank登錄號分別為NM_000582和NM_002046)為模板，設計并分析引物，并根據基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。2.樣品準備I)待測樣本人侵襲性脈絡膜黑色素瘤M619細胞。2)微量樣品即可，可以是新鮮的腫瘤組織或液氮保存的腫瘤組織，也可以是外周血，毎次均設陰性對照組和陽性對照組。3.總RNA抽提(根據Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行)I)去細胞上清，姆孔加入Iml于Trizol吹打，室溫靜止5min,然后轉移至心的 1.5ml eppendorf 管中。2)每管加入200 μ I氯仿，用カ震蕩15s，室溫靜置15min。3) 4°C, 12000rpm,離心 15min。4)從姆管中吸取上清至另一新的I. 5ml eppendorf管。加入等體積_2(TC預冷的異丙醇，混勻后-20°C沉淀lOmin。5) 4°C, 12000rpm 離心 IOmin 后，去上清。6)加入至少Iml 4°C預冷的75%こ醇，洗滌沉淀及離心管壁。7) 4°C, IOOOOrpm 離心 5min,棄上清。8) 4°C，IOOOOrpm再次離心5min，吸去殘液，室溫干燥(不需完全干燥)。9)加入20 μ I RNase-free水，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。4. cDNA獲得(逆轉錄反應)M-MLV逆轉錄酶和dNTP購自PR0MEGA公司。Oligo dT購自上海生エ。RNase-free的物品都購自Axygen。說明根據Promega公司的M-MLV操作說明書進行，均為RNase-free操作。I)將 Ιμ Oligo dT(0. 5μ g/μ I)和 2· 0μ g Total RNA 加入到 PCR 小管中，補充DEPC-H2O至9μ I。混勻后離心，70°C溫浴lOmin。之后立即插入到(TC冰水浴中，使OligodT和模板退火。2)按下表的比例，根據反應管數算出所需的試劑量。將M-MLV酶等在冰上混勻，得到RT反應液。
權利要求1.ー種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括盒體，所述盒體內設有襯墊，其特征在于，所述襯墊上設有五個容器孔，所述容器孔內分別對應放置有裝有染料法PCR反應液的試劑瓶、OPN基因引物的試劑瓶、內參基因引物的試劑瓶、陰性對照的試劑瓶以及陽性對照的試劑瓶。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述盒體內還設有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒或裝有空離心管的離心管盒中的ー種或多種，所述裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒和裝有空離心管的離心管盒均位于所述襯墊的下方。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述盒體內襯墊的下方還設有第二襯墊，所述第二襯墊上設有三個槽位，所述槽位內分別對應放置有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒以及裝有空離心管的離心管盒。
4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述盒體內襯墊的下方還設有第二襯墊，所述第二襯墊上設有兩個槽位，所述槽位內分別對應放置有裝有去離子水的試劑瓶和裝有移液槍槍頭的槍盒，或者裝有去離子水的試劑瓶和裝有空離心管的離心管盒，或者裝有移液槍槍頭的槍盒和裝有空離心管的離心管盒。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述盒體內襯墊的下方還設有第二襯墊，所述第二襯墊上設有ー個槽位，所述槽位內放置有裝有去離子水的試劑瓶、裝有移液槍槍頭的槍盒或裝有空離心管的離心管盒。
6.如權利要求3-5任ー權利要求所述的試劑盒，其特征在于，所述槽位為與其內放置的試劑瓶、槍盒或離心管盒的輪廓相匹配的下陷凹槽。
7.如權利要求3-5任ー權利要求所述的試劑盒，其特征在干，所述裝有去離子水的試劑瓶在所述第二襯墊上水平放置，并且所述試劑瓶瓶身的最大直徑小于等于對應的所述槽位的深度。
8.如權利要求3-5任ー權利要求所述的試劑盒，其特征在于，所述槍盒在所述第二村墊上水平放置，并且所述槍盒盒體的高度小于等于對應的所述槽位的深度。
9.如權利要求3-5任ー權利要求所述的試劑盒，其特征在于，所述離心管盒在所述第ニ襯墊上水平放置，并且所述離心管盒盒體的高度小于等于對應的所述槽位的深度。
專利摘要本實用新型涉及生物技術領域，具體公開了一種OPN基因的實時熒光PCR檢測試劑盒，包括盒體，所述盒體內設有襯墊，所述襯墊上設有五個容器孔，所述容器孔內分別對應放置有裝有染料法PCR反應液的試劑瓶、OPN基因引物的試劑瓶、內參基因引物的試劑瓶、陰性對照的試劑瓶以及陽性對照的試劑瓶。本實用新型的試劑盒設計合理，與現有探針法相比不需要設計熒光探針，操作方便且節約成本。
文檔編號C12M1/34GK202482326SQ2012200444
公開日2012年10月10日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者曹躍瓊, 楊敏, 高博 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司