引入了肝細胞生長因子基因和具有堿性螺旋-環-螺旋基序的神經源性轉錄因子基因的成 ...的制作方法
【專利摘要】本發明涉及引入了HGF基因和bHLH家族的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞系、所述成人干細胞系的制備方法、用于預防或治療神經疾病的包含所述成人干細胞系的組合物、和用于治療神經疾病的方法，所述方法包括給具有神經疾病或疑似具有神經疾病的受試者施用所述組合物的步驟。根據本發明的引入了HGF基因和bHLH家族的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞可被用于克服由中風后的細胞損傷導致的慢性損傷。因而，可以將所述成人干細胞開發為新型治療劑或廣泛用于細胞替換療法和基因療法的臨床試驗和研究中，所述療法可應用于神經疾病，包括帕金森病、阿爾茲海默病、和脊髓損傷以及中風。
【專利說明】引入了肝細胞生長因子基因和具有堿性螺旋-環-螺旋基序的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞系及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及成人干細胞系及其用途，所述成人干細胞系通過將編碼肝細胞生長因子(HGF)的基因和編碼堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的神經源性轉錄因子(neurogenictranscription factor)的基因引入成人干細胞系而被修飾；更具體地,本發明涉及引入了肝細胞生長因子基因和堿性螺旋-環-螺旋家族的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞系、所述成人干細胞系的制備方法、用于預防或治療神經疾病的包含所述成人干細胞系的組合物和用于治療神經疾病的方法，所述方法包括給具有神經疾病或疑似具有神經疾病的受試者施用所述組合物的步驟。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(MSC)是基質細胞，其幫助骨髓中的造血作用，且具有分化成各種中層譜系細胞(包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、和肌細胞)且同時還維持未分化干細胞群的能力，因此已獲得作為人造組織的細胞來源的優勢。
[0003]由于已報道MSC具有在腦中分化成神經膠質細胞的潛力，已經提出可以將MSC用作治療中樞神經系統中的神經疾病的來源。
[0004]已知若干生長因子或激素誘導未分化細胞分化成人造神經細胞。不幸的是，這些方法具有一起產生非神經細胞與神經細胞的問題，并且該問題在將細胞移植到實驗動物腦內時更為突出。因此，存在開發誘導MSC分化成神經細胞的直接方法的需要。
[0005]神經原素(neurogenin),也稱為NeuroD,是屬于堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的轉錄因子，在神經系統形成中起重要作用，并且與其他bHLH蛋白例如E12或E47形成復合物，以結合至含有E-box (CANNTG)的DNA序列或在偶然情況下結合至含有N_box的DNA序列。已發現這種結合對于bHLH蛋白活化促進神經元分化的組織特異性基因的表達是關鍵的。
[0006]本發明人已致力于開發將MSC有效分化成神經細胞的穩定物質。結果是，他們已經意外地發現，轉導了 bHLH轉錄因子例如神經原素和neuroD的MSC可以連續表達bHLH轉錄因子；并且發現，在移植到實驗動物的腦中時，表達bHLH轉錄因子的MSC可以轉分化成高水平的神經細胞。基于這一發現，他們報道了，與未誘導的MSC相比，誘導MSC分化成神經細胞以在中風動物模型中獲得優異的治療效力(韓國專利N0.10-0519227)。
[0007]MSC在治療神經疾病中的用途是有利的，這在于其可以使用自體細胞，而不是異體細胞。但是，在實際治療程序中，所述方法具有下述不利之處:需要2至4周來分離和培養自體細胞和基因轉染，直到中風發作后的自體細胞治療。因此，為了解決中風發作后自體細胞移植的耗時的臨床程序這一問題，已經進行了許多研究，來開發驗證自體細胞對慢性傷害的治療效力并使其最大化的方法。
[0008]HGF，也稱為擴散因子(scatter factor)，已知是肝素結合糖蛋白，在器官例如肝或腎中具有強抗纖維化活性(Silver等人，Nat.Rev.Neurosc1., 5:146-156，2004)。現在正在進行肝細胞生長因子用于治療神經疾病包括中風和脊髓損傷的研究。已報道了其對急性疾病的治療效力，但是尚未報道對于慢性疾病的成功的結果。
【發明內容】
[0009]本發明人已作出許多努力來開發用于慢性中風的治療組合物，所述組合物包含引入了 HGF的MSC作為活性成分。結果是，他們發現，引入了 bHLH轉錄因子神經原素I的MSC連續表達所述bHLH轉錄因子，并且還引入了 HGF的MSC在移植到中風動物模型中時顯示出治療效力，由此完成了本發明。 [0010]本發明的目的是提供一種成人干細胞系，所述成人干細胞系通過將編碼肝細胞生長因子(HGF)的基因和堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的編碼神經源性轉錄因子的基因引入成人干細胞系而被修飾。
[0011]本發明的另一個目的是提供所述成人干細胞系的制備方法。
[0012]本發明的又一個目的是提供用于預防或治療神經疾病的包含所述成人干細胞系的組合物。
[0013]本發明的又一個目的提供用于治療神經疾病的方法，所述方法包括給具有神經疾病或疑似具有神經疾病的受試者施用所述組合物的步驟。
[0014]根據本發明的引入了 HGF基因和bHLH家族的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞可被用于克服由中風之后的細胞死亡導致的慢性損傷。因而，可以將所述成人干細胞開發為新型治療劑或廣泛用于細胞替換療法和基因療法的臨床試驗和研究中，所述療法可應用于神經疾病，包括帕金森病、阿爾茲海默病、和脊髓損傷以及中風。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1是示出MSC分化成脂肪細胞、軟骨細胞、和骨細胞的照片，其中圖1a是由MSC分化、采用油紅O染色的脂肪細胞的照片，圖1b是由MSC分化、采用阿利新藍染色的軟骨細胞的照片，圖1c和Id是由MSC分化、分別采用堿性磷酸酶和von Kossa染色的骨細胞的照片;
[0016]圖2是蛋白質免疫印跡(下圖)的結果，其示出人神經原素I在293T細胞中的表達，所述293T細胞引入了含有人神經原素I基因的逆轉錄病毒載體(上圖)；
[0017]圖3是免疫組化染色的結果，其中使用抗神經元標記物Tujl( B-微管蛋白-1II)抗體，以檢查在引入了人神經原素I基因的MSC在被表達GFP的腺病毒轉染并移植到大白鼠(albino rat)的紋狀體中之后兩周時，MSC的神經原性分化；
[0018]圖4是蛋白質免疫印跡分析的結果，示出細胞內(細胞裂解物)和細胞外(條件培養基；CM) HGF在引入了表達人HGF的腺病毒載體的MSC中的表達；
[0019]圖5是示出免疫細胞化學的結果的照片，所述免疫細胞化學檢查HGF在引入了逐級稀釋的表達人HGF的腺病毒載體的MSC中的表達水平；
[0020]圖6是示出動物行為試驗的結果的照片，所述動物行為試驗包括粘合劑去除試驗(Adhesive Removal Test,左圖)和轉棒試驗(Rotarod Test,右圖)，以評價引入了人HGF基因和人神經原素I基因的MSC在中風動物模型中的治療效力；
[0021]圖7是示出MRI (上圖)結果的照片和梗死區的定量分析(下圖)，以評價引入了人HGF基因和人神經原素I基因的MSC在中風動物模型中的治療效力；
[0022]圖8是示出免疫組織化學的結果的照片，其中使用GFAP和MAP2抗體，以檢查在引入了人HGF基因和人神經原素I基因的MSC的移植之后，梗死區中的膠質細胞及其表達譜；和
[0023]圖9是總結引入了人HGF基因和人神經原素I基因的MSC在中風動物模型中的治療效力隨細胞移植時間變化的圖解(上圖)和圖(下圖)。
【具體實施方式】
[0024]在本發明的一個方面，本發明提供一種成人干細胞系，所述成人干細胞系通過將編碼肝細胞生長因子(HGF)的基因和編碼堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的神經源性轉錄因子的基因引入成人干細胞系而被修飾。
[0025]如本文所用，術語“成人干細胞”表示一種未分化細胞，如需要，其可以分化成組織的專門化的細胞類型。所述成人干細胞系優選是、但不具體限于源自骨髓、脂肪組織、血液、臍帶血、肝、皮膚、胃腸道、胎盤、子宮或流產胎兒的干細胞，更優選是源自骨髓的成人干細胞系，最優選是源自骨髓的MSC。源自骨髓的成人干細胞包括多種成人干細胞，例如MSC和能夠產生血細胞和肝細胞的造血干細胞。其中MSC能夠易于離體增殖并且分化成多種細胞類型(脂肪細胞、軟骨細胞、 肌細胞、和骨細胞)。因而，可以將它們用作基因和細胞療法中的有用靶標，但是并不具體限定其用途。
[0026]如本文所用，術語“肝細胞生長因子(HGF)”，也稱為擴散因子，表示由間充質細胞產生的多功能異二聚體多肽。HGF由含有N端指結構域和4個Kringle結構域的69kDaa-鏈和與糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的蛋白酶結構域具有相似性的34kDa0-鏈組成。將人HGF合成為由728個氨基酸組成的無生物活性的單鏈前體。通過在R494殘基處用特定的血清絲氨酸蛋白酶進行切割得到有生物活性的HGF。活性HGF為異二聚體，其由69kDa α -鏈和34kDai3-鏈經由二硫鍵連接而組成。在本發明中，將HGF引入成人干細胞系，以獲得經轉化的細胞系。編碼優選的HGF的核苷酸序列是已知的(GenBank登錄號NM_000601.4166-2352或BC130286.1 (76-2262))。
[0027]如本文所用，術語“堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)”表示轉錄因子的陰影，是指通過環連接兩個螺旋的形式。已知bHLH轉錄因子在多細胞生物體的基因表達中起重要作用。
[0028]bHLH轉錄因子優選是、但不具體限于神經源性轉錄因子，更優選是神經原素I基因(GenBank登錄號:U63842、U67776 )、神經原素2基因(GenBank登錄號:U76207、AF303001)、neuro Dl 基因(GenBank 登錄號:U24679、AB018693)、MASHl 基因(GenBank 登錄號:M95603、L08424)、MATH3 基因(GenBank 登錄號:D85845)、E47 基因(GenBank 登錄號:M65214、AF352579)等等。此外，還可以使用在多核苷酸序列的一部分中具有改變、缺失或置換的神經源性轉錄因子，只要其顯示與所述神經源性轉錄因子等同或類似的活性即可。
[0029]引入了 bHLH轉錄因子基因的MSC具有分化成神經細胞的潛力，而不是具有分化成骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、和軟骨細胞的潛力，并且它們能夠在體外特定條件下分化成神經細胞。根據本發明的一個實施例，制備引入了 HGF基因和神經原素I基因的成人干細胞，發現它們當移植到實驗動物的腦組織中時有效地分化成神經細胞(圖3)。
[0030]如本文所用，術語“引入了 HGF基因和bHLH家族的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞系”是指引入了上述HGF基因和bHLH家族的神經源性轉錄因子基因的成人干細胞系，優選是引入了 SEQ ID N0.1的HGF基因和SEQ ID N0.2的神經原素I基因的成人干細胞系。然而，上述成人干細胞系并不具體限于此，只要它保持分化成神經細胞的能力即可。
[0031]針對本發明的目標，優選的是將HGF基因克隆到載體中，然后將其引入成人干細胞。
[0032]如本文所用，描述能 夠在合適的宿主細胞中表達靶蛋白的表達載體的術語“載體”是指包括必需調控元件的基因構建體，向所述必需調控元件可操作地連接基因插入物，連接方式使得表達所述基因插入物。
[0033]如本文所用，術語“可操作地連接”是指在編碼所述蛋白的核酸序列和核酸表達控制序列之間以允許一般功能的方式的功能連接。可以使用本領域中熟知的遺傳重組技術制備可操作的連接，并且可以使用本領域公知的酶進行位點特異性DNA切割和連接。
[0034]所述載體優選是、但不具體限于質粒載體、粘粒載體、病毒單體，更優選是源自HIV(人免疫缺陷病毒)、MLV (鼠白血病病毒)、ASLV (禽肉瘤/白血病病毒)、SNV (脾壞死病毒)、RSV (勞氏肉瘤病毒)、MMTV (鼠乳房瘤病毒)、MSV (鼠肉瘤病毒)、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒等等的病毒載體。
[0035]根據本發明的一個實施例，為了引入神經原素I基因，將圖2的GenBank登錄號U63842的基因序列中的編碼區(55-768bp)克隆到pMSCV-puro質粒中，以制備重組載體pMSCV/puro-hNgnl，然后將獲得的重組載體引入到產生逆轉錄病毒的細胞系中，從而制備逆轉錄病毒載體。然后，將獲得的逆轉錄病毒載體弓丨入到源自骨髓的MSC系中，以制備經轉化的成人干細胞。
[0036]根據本發明的另一個實施例，為了引入HGF基因，將GenBank登錄號NM_000601.4的基因序列中的編碼區(166-2352bp)克隆到pShuttle_CMV中，然后通過與pAdEasy-Ι重組制備重組載體pAd-HGF。通過采用限制性酶PacI切割將所述重組載體線性化，并將經線性化的重組載體引入產生腺病毒的細胞系中，從而制備Adeno-HGF載體。然后，將獲得的Adeno-HGF載體引入到源自骨髓的MSC系中，以制備經轉化的成人干細胞。
[0037]本發明的成人干細胞的基因引入是、但不具體限于通過轉化進行的，并且所述轉化可以通過本領域中已知的典型方法容易地進行。
[0038]如本文所用，術語“轉化”是指通過將外源DNA或含有外源DNA的病毒載體引入到宿主細胞中(作為染色體外元件)或通過染色體摻入的人工遺傳改變。通常，轉化方法包括使用下述的感染:逆轉錄病毒和腺病毒、DNA的CaCl2沉淀、Hanahan法(為通過使用二甲基亞砜(DMSO)作為還原物質而改進的CaCl2法)、電穿孔、磷酸鈣沉淀、原生質體融合、使用碳化硅纖維攪拌、農桿菌介導的轉化、PEG介導的轉化、硫酸葡聚糖介導的轉化、脂質體介導的轉化、和干燥/抑制介導的轉化。根據本發明的一個實施例，通過將含有神經原素的逆轉錄病毒載體和含有HGF基因的Adeno-HGF載體引入到干細胞中進行轉化。
[0039]在另一方面，本發明通過引入了 HGF基因和神經原素I基因的成人干細胞系的制備方法。
[0040]如上文所述，不具體限制引入了 HGF基因和神經原素I基因的成人干細胞系的類型，任何細胞系均可用作本發明的細胞系，只要它具有分化成組織的專門化細胞類型的潛力即可。[0041]優選地，所述成人干細胞系可以是源自骨髓、脂肪組織、血液、臍帶血、肝、皮膚、胃腸道、胎盤、子宮或流產胎兒的成人干細胞系。更優選地，所述成人干細胞系是源自骨髓的成人干細胞系。更優選地。所述成人干細胞系是源自骨髓的MSC系。
[0042]可以通過使用轉化方法進行將特定基因引入到干細胞系中。如上文所述，可以使用本領域中已知的典型轉化方法而不進行限制。根據本發明的一個實施例，通過將MSCV-puro/hNgnl和Adeno-HGF引入到成人干細胞系中制備經轉化的成人干細胞系。在用MSCV-puro/hNgnl基因轉染MSC之后，使用嘌呤霉素進行篩選。在用Adeno-HGF轉染MSC之后，使用HGF抗體來檢查其表達，測定和使用感染復數(MOI)。
[0043]產生本發明的引入了 HGF基因和神經原素I基因的源自骨髓的成人干細胞系的方法可以包括下述步驟:
[0044](a)將具有SEQ ID N0.1核苷酸序列的編碼肝細胞生長因子的基因和具有SEQ IDN0.2核苷酸序列的編碼神經原素I的基因引入到培養的成人干細胞中；
[0045](b)篩選引入了編碼肝細胞生長因子和神經原素I的基因二者的經修飾的成人干細胞系；和
[0046](C)培養所篩選的經修飾的成人干細胞系。
[0047]在產生引入了 HGF基因和神經原素I基因的源自骨髓的成人干細胞系的方法中，順序或以相反次序或同時引入編碼肝細胞生長因子的基因和編碼神經原素I的基因，但是不具體限制次序和方法。
[0048]根據本發明的一個實施例，分離成人干細胞中的源自骨髓的MSC。
[0049]在含有10%FBS、10ng/mL bFGF和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中培養所分離的MSC，然后傳代培養直到四代以用于實驗中。
[0050]在用神經原素I基因轉化的步驟中，使用T4DNA連接酶將神經原素I基因連接至pMSCV-puro載體，然后轉化到大腸桿菌DH5 α中。最后，通過將hNgnl基因插入到pMSCV-puro載體中制備pMSCV-puro/hNgnl載體，然后將神經原素I基因引入到傳代培養的細胞系中。將引入了神經原素I的細胞在含有2 μ g/mL嘌呤霉素的培養基中傳代培養2周以便篩選存活的引入了神經原素I的細胞。最后，通過上述程序制備連續表達神經原素I的細胞系。
[0051]在用HGF基因轉化的步驟中，將HGF克隆的pShuttle-CMV-HGF和pAdEasy-Ι通過電穿孔共轉化到大腸桿菌(BJ5183菌株)中，然后在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的培養基中培養，直到形成克隆。從每個克隆中獲得質粒，然后通過標準限制性酶消化篩選候選克隆。分析堿基序列以獲得pAd-HGF。通過用限制性酶PacI切割將pAd_HGF線性化，然后通過CaCl2沉淀引入到HEK293細胞中，以獲得含有Adeno-HGF病毒的培養肉湯。為了篩選其中成功引入了 HGF的MSC系，通過使用抗HGF的抗體的免疫組化染色，檢查表達HGF的蛋白。
[0052]在又一方面，本發明提供了用于預防或治療神經疾病的組合物，所述組合物包含引入了 HGF基因和神經原素I基因的成人干細胞系。
[0053]如本文所用，術語“神經疾病”是指與神經、特別是顱神經相關的多種疾病。所述神經疾病可以是、但不具體限于帕金森病、阿爾茲海默病、亨丁頓氏舞蹈病、肌萎縮側索硬化、癲癇、精神分裂、急性中風、慢性中風、或脊髓損傷，優選是慢性中風。
[0054]如本文所用，術語“預防”是指下述所有動作:在所述動作中，通過使用引入了 HGF基因和神經原素I基因的成人干細胞系，神經疾病或與其相關的疾病的發生得到了限制或阻滯。
[0055]如本文所用，術語“治療”是指下述所有動作:在所述動作中，通過使用引入了 HGF基因和神經原素I基因的成人干細胞系，神經疾病或與其相關的疾病的癥狀已經得到了更好地轉變或被有利地改變。
[0056]本發明的引入了 HGF基因和神經原素I基因的MSC可以包含用于治療的MSC的藥物組合物的形式存在。
[0057]同時，本發明的組合物可以是進一步包含藥學上可接受的載體的藥物組合物。包含藥學上可接受的載體的藥物組合物可以制備成口服或腸胃外的制劑。可以使用常規采用的稀釋劑或賦形劑制備制劑，所述賦形劑例如填料、增量劑、粘結劑、潤濕劑、分散劑、和表面活性劑。用于口服施用的固體制備物的實例包括片劑、丸劑、粉末、顆粒劑、和膠囊，并且可以通過混合一種或多種化合物與至少一種賦形劑制備所述固體制備物，所述賦形劑例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、和明膠。此外，除了賦形劑，還可以使用例如硬脂酸鎂和滑石的潤滑劑。用于口服施用的液體制備物的實例包括懸浮劑、內服用液體、乳液、和糖漿，并且除了例如水和液體石蠟的一般稀釋劑，還可以含有例如潤濕劑、甜味劑、香料、和防腐劑的各種賦形劑。用于胃腸外施用的制備物的實例可以包括無菌水性溶液、非水性溶劑、懸浮液、乳液、凍干劑、和栓劑。作為非水性溶劑和懸浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、例如橄欖油的植物油、和例如油酸乙酯的可注射酯。作為栓劑基質，可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61、可可脂、月桂酸型脂、甘油明膠等等。可以將所述藥物組合物配制成選自下述的任何制備物:片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊、懸浮液、內服用液體、乳液、糖漿、無菌水性溶液、非水性溶劑、懸浮液、乳液、凍干劑、和栓劑。
[0058]在又一方面，本發明提供了一種用于治療神經疾病的方法，所述方法包括給具有神經疾病或疑似具有神經疾病的受試者施用所述組合物的步驟。
[0059]如本文所用，術語“受試者”是指具有神經系統因而易受由多種因素導致的上述神經疾病影響的活的生物體，優選是哺乳動物。
[0060]如本文所用，術語“哺乳動物”是指小鼠、大鼠、兔、狗、貓，尤其是人，并且是指高級脊椎動物中用乳腺分泌的乳液喂養其幼代的“哺乳動物”綱的任何生物體。
[0061]可以通過任何常規途徑給受試者施用本發明的組合物，只要其能夠達到期望組織即可。涵蓋各種施用模型，包括腹膜內地、靜脈內地、肌肉內地、皮下地、皮內地、經口地、鼻內地、肺內地和直腸內地，但是本發明不限于這些示例的施用模式。此外，可以單獨或與激素療法、藥物療法和生物應答調節劑組合地使用本發明的組合物，以便實現抗氧化作用。
[0062]此外，可以以藥物有效量使用本發明的組合物。如本文所用，術語“藥物有效量”是指足以治療疾病的量，其與可應用于醫學治療的合理的益處/風險比率相稱。可以取決于受試者和疾病嚴重程度、年齡、性別、藥物活性、藥物敏感性、施用時間、施用途徑、排泄率、治療持續時間、同時使用的藥物、和醫學中已知的其它因素，確定本發明組合物的有效劑量。本發明的組合物可以作為單獨的治療劑或與其它治療劑組合地施用。并且可以與常規治療劑順序或同時施用。可以以單個或多個劑量提供這一施用。考慮所有因素，重要的是進行能夠給予最大作用且沒有副作用的最少劑量的施用，本領域技術人員容易地確定這種劑量。[0063]此外，可以單獨或與手術、激素療法、藥物療法和生物應答調節劑組合地施用本發明的組合物，以便預防或治療炎性疾病。
[0064]下文將參考實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅用于示例，本發明不意在受這些實施例限制。
[0065]實施例1:MSC的分離和培養
[0066]實施例1-1:MSC的分離
[0067]將從4mL HIST0PAQUE1077 (Sigma)和從骨髓庫(韓國骨髓捐贈計劃，KMDP)獲得的4mL骨髓加入到無菌15mL試管中，然后使用離心機在室溫和400 Xg下離心30分鐘。離心后，使用巴斯德吸管小心地收集位于界面中的0.5mL血沉棕黃層，然后將其轉移到含有IOmL無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)的試管中。
[0068]在250Xg下離心轉移的血沉棕黃層10分鐘以去除上清液，然后向其中加入IOmL磷酸緩沖液，以獲得懸浮液，將所述懸浮液在250Xg下離心10分鐘。
[0069]重復上述程序2次，然后向得到的沉淀中加入含有10%FBS(Gibco)的DMEM培養基(Gibco)0將對應于I X IO7個細胞的所得溶液的一部分置于IOOmm培養皿中，然后在37°C下孵育4小時，同時供應5%C02和95%空氣。然后去除上清液以清除沒有附到培養皿底部的細胞，并加入新的培養基以繼續培養。
[0070]實施例1-2:MSC的培養
[0071]將在實施例1-1中分離的MSC在保持于37°C下的CO2培養箱中培養，同時以2天的間隔更換MSC培養基(10%FBS+10ng/mL bFGF (Sigma)+1%青霉素/鏈霉素(Gibco)+89%DMEM)。當細胞達到大約8 0%匯合度時，使用0.25%胰蛋白酶/0.1mM EDTA (GIBCO)收集細胞，并且用所述培養基稀釋20倍，然后在新的培養皿中傳代培養。由此獲得的剩余細胞在含有10%DMS0的培養基中保持冷凍，如下檢測它們分化成脂肪細胞、軟骨細胞、和骨細胞的潛力。
[0072]實施例1-3:成脂分化
[0073]在MSC培養基中培養MSC預定的時間段，隨后在成脂分化誘導培養基(含有I μ M地塞米松(Sigma)、0.5μΜ 甲基-異丁基黃嘌呤(Sigma)、10 μ g/mL 胰島素(GIBCO)、IOOnM吲哚美辛(Sigma)和10%FBS的DMEM培養基)中培養48小時。隨后在成脂維持培養基(含有10 μ g/mL胰島素和10%FBS的DMEM培養基)中培養所得的混合物I周，然后用油紅O染色(圖la)。圖1a是由MSC分化、采用油紅O染色的脂肪細胞的照片。如圖1a所示，在細胞內部觀察到染成紅色的液滴，這表明MSC被成功分化成脂肪細胞。
[0074]實施例1-4:成軟骨分化
[0075]在MSC培養基中培養MSC預定的時間段，然后使用胰蛋白酶收集2 X IO5個細胞并將其轉移到試管中，離心，然后在0.5mL無血清的成軟骨分化誘導培養基(50mL高糖DMEM (GIBC0)、0.5mL100XITS (0.5mg/mL 牛胰島素、0.5mg/mL 人轉鐵蛋白、0.5mg/mL 硒酸鈉(Sigma)、50 μ L 亞麻酸-白蛋白(Sigma)、0.2mM100nM 地塞米松、和 10ng/mL TGF- β I(Sigma))中再次培養3周，同時每3天更換所述培養基。然后，用4%多聚甲醛固定所述細胞，使用顯微鏡用薄片切片機切片，然后用阿利新藍染色(圖lb)。圖1b是由MSC分化、采用阿利新藍染色的軟骨細胞的照片。如圖1b所示，細胞外軟骨基質被染成藍色，在軟骨陷窩中觀察到軟骨細胞的存在，這表明MSC被分化成軟骨細胞。[0076] 實施例1-5:成骨分化
[0077]在MSC培養基中培養MSC預定的時間段，然后在成骨分化誘導培養基(DMEM含有IOmMβ -憐酸甘油(Sigma)、0.2mM抗壞血酸-2-憐酸酯(Sigma)、IOnM地塞米松和10%FBS)中培養2周，同時每3天更換所述培養基。然后，用多聚甲醛固定所述細胞，然后用vonKossa和堿性磷酸酶染色(AP)(圖1c和Id)。圖1c和Id是由MSC分化、分別采用堿性磷酸酶和von Kossa染色的骨細胞的照片。如圖1c和Id中所示，鈣礦物以羥基磷灰石形式的細胞外累積和細胞內堿性磷酸酶活性的提高表明MSC被分化成骨細胞。
[0078]實施例2:人神經源件轉錄閔子即神經原素I的逆轉錄病毒的構律和表汰
[0079]實施例2-1:表達人神經原素I逆轉錄病毒載體的構建
[0080]使用T4DNA連接酶(Roche)，將對應于U63842基因序列中的編碼區(55_768bp)的SEQ ID N0.2的序列連接到pMSCV-puro載體(Clontech)中，然后轉化到大腸桿菌DH5a中，以最終構建其中人神經原素I (hNgnl)基因被插入到pMSCV-puro載體中的pMSCV-puro/hNgnl載體。通過磷酸鈣沉淀將所構建的pMSCV-puro/hNgnl載體引入到293T細胞中，然后通過蛋白質免疫印跡(圖2)檢查表達。圖2是蛋白質免疫印跡(下圖)的結果，其示出人神經原素I在293T細胞中的表達，所述293T細胞引入了含有hNgnl基因的逆轉錄病毒載體(上圖)。
[0081]實施例2-2:含有神經原素I的逆轉錄病毒的制備
[0082]根據磷酸鈣沉淀法將pMSCV-puro/hNgnl載體引入到逆轉錄包裝細胞PA317(ATCCCRL-9078)或PG13 (ATCC CRL-10686)中。48小時后，收集培養液，然后將其用0.45 μ m膜過濾以獲得逆轉錄病毒溶液。將所述逆轉錄病毒保持在_70°C下直到使用。
[0083]實施例3:引入了神經原素I基因的MSC的構建和體內神經元分化
[0084]實施例3-1:將神經原素I引入到MSC中
[0085]在IOOmm培養皿中將MSC培養到70%匯合度。向其中加入4mL在實施例2-2中獲得的神經原素I逆轉錄病毒溶液，所述溶液與聚凝胺(Sigma)混合到8 μ g/mL的終濃度，然后培養8小時。然后去除所述逆轉錄病毒溶液，在IOmL MSC培養基中培養MSC24小時，然后進行逆轉錄病毒的再次感染。重復上述程序1-4次。然后使用胰蛋白酶收集MSC并用所述培養基稀釋20倍。在補充了 2 μ g/mL嘌呤霉素(Sigma)的培養基中傳代培養所獲得的細胞2周，以便篩選存活的感染了逆轉錄病毒的細胞。最后，將具有嘌呤霉素抗性的MSC用作表達神經原素I的細胞。
[0086]實施例3-2:用于移植的細胞的標記
[0087]為了檢查神經原素I基因是否提高移植率和神經元分化，用表達GFP的腺病毒感染引入了 hNgnl基因的MSC。
[0088]通過加入具有I X 108PFU/mL的滴度和之前已描述的100M0I的腺病毒溶液3小時，進行腺病毒轉染。在腺病毒轉染后，使用0.25%胰蛋白酶/0.P/oEDTA收集引入了神經原素I的MSC，然后用PBS稀釋成每I μ L3 X IO3個細胞。
[0089]實施例3-3:移棺
[0090]如下使用成年Sprague-Dawley 雌性大白鼠(250g) (Dae Han Bio Link C0., Ltd)進行移植:
[0091]首先,用腹膜內注射75mg/kg克他命和5mg/kg rumpun麻醉大白鼠，除去切口區域的毛皮，然后將耳朵和口固定至立體定位架。用70%乙醇對頭部進行滅菌，然后形成一個大約Icm的切口。然后，將含有3 X IO3個表達hNgnl的MSC (MSC/hNgnl)的I μ L PBS放入IOyL Hamilton注射器中，所述注射針置于Hamilton注射器架中。在暴露的硬腦脊膜的前鹵AP, +1.0;ML3.0;LV, +4.0位置處滴注后，使用Hamilton注射器以0.2 μ L/min的速率注射IuL所述細胞。注射后20分鐘，緩慢取出注射器。使用無菌線和針縫合切口，然后使用殺菌劑殺毒。通過腹膜內注射每日使用5mg/kg免疫抑制的環孢菌素A (Sigma)直到將腦取出。
[0092]實施例3-4:組織切片的制備 [0093]移植后兩周,用腹膜內注射75mg/kg克他命和5mg/kg rumpun麻醉大白鼠。打開胸部，使用鹽水通過左心室進行灌注沖洗。使用0.1M磷酸緩沖溶液(pH7.4)中的多聚甲醛進行灌注固定。將腦取出，在4°C下使用相同的固定溶液后固定16小時。將后固定的腦在30%蔗糖中沉積24小時，然后使用滑動的顯微鏡用薄片切片機以35 μ m的厚度切片。將由此獲得的切片安裝至硅烷涂覆的載玻片上(MUTO PUREff CHEMICAS C0.，LTD，Japan)，然后在4°C下儲存在PBS中直到使用。將安裝在載玻片上的組織切片在1XPBS/0.l%Triton X-100中浸潰30分鐘。
[0094]實施例3-5:免疫組織化學
[0095]首先，為了封閉非特異性相互作用，將組織切片在室溫下與10%正常馬血清(NHS)反應I小時，然后在4°C下與各自稀釋成1:200的MAP2 (微管結合蛋白_2)抗體和GFP抗體的一抗反應16小時。在用1XPBS/0.l%Triton X-100洗滌3次15分鐘后，使切片與FITC-綴合的抗小鼠IgG (Vector, 1:200)反應以檢測GFP 一抗，或與Taxas red-綴合的抗小鼠IgG (Vector, 1:200)反應以檢測MAP2—抗(圖3)。圖3是免疫組化染色的結果，其中使用抗神經元標記物TuJl ( B-微管蛋白-1II)抗體，以檢查在引入了 hNgnl基因的MSC在被表達GFP的腺病毒轉染并移植到大白鼠的紋狀體中之后兩周時，MSC的神經原性分化。如圖3所示，表達GFP的細胞和表達MAP2的細胞重疊，這表明引入了神經原素I基因的MSC被分化成神經細胞。
[0096]實施例4:引入了 HGF某閔的腺病毒載體的構律和表汰
[0097]實施例4-1:表汰HGF的腺病毒載體的構律
[0098]將對應于GenBank登錄號NM_000601.4的基因序列中的編碼區(166_2352bp)的SEQ ID N0.1的堿基序列引入到pShuttle-CMV載體中以制備pShuttle-CMV-HGF。通過電穿孔將此載體和pAdEasy-Ι共轉化到大腸桿菌(BJ5183菌株)中，然后在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的培養基中培養直到形成克隆。從每個克隆獲得質粒，然后通過標準限制性酶消化篩選候選克隆。分析堿基序列以獲得具有HGF的pAd-HGF載體。通過采用限制性酶PacI切割將pAd-HGF線性化，然后通過CaCl2沉淀將其引入到HEK293細胞中，以獲得含有Adeno-HGF病毒的培養肉湯。
[0099]實施例4-2:腺病毒中HGF表汰的蛋白質免瘡印跡分析
[0100]為了檢查HGF是否在引入了 HGF基因的腺病毒中正常表達，用不同濃度的腺病毒感染MSC2小時，然后通過蛋白質免疫印跡以細胞內蛋白(細胞裂解物)和細胞外蛋白(條件培養基；CM)水平分析產生的HGF (圖4)。圖4是蛋白質免疫印跡分析的結果，示出細胞內(細胞裂解物)和細胞外(條件培養基；CM)HGF在引入了表達人HGF的腺病毒載體的MSC中的表達。如圖4所示，與感染到MSC中的表達HGF的腺病毒的濃度成比例地產生細胞內HGF。
[0101]實施例4-3:腺病毒介導的HGF表達的免疫細胞化學
[0102]進行免疫細胞化學以便檢查HGF細胞內表達。用不同濃度的表達HGF的腺病毒感染MSC，用4%甲醛固定10分鐘，然后在室溫下與正常山羊血清(NGS)反應I小時，以封閉非特異性相互作用。將以1:200稀釋的HGF抗體用作一抗，然后在4°C下反應16小時，之后用1XPBS/0.l%Triton X-100洗滌3次15分鐘。為了檢測HGF—抗，用以1:250稀釋的Alexa488綴合的小鼠Ig-G 二抗(Invitrogen)將細胞染色，同時用Hoechst將核染色(圖5)。圖5是示出免疫細胞化學的結果的照片，所述免疫細胞化學檢查HGF在引入了逐級稀釋的表達人HGF的腺病毒載體的MSC中的表達水平。如圖5所示，與感染到MSC中的表達HGF的腺病毒的濃度成比例地產生細胞內HGF。
[0103]實施例5:將HGF基因引入到引入了人神經原素I基因的MSC中和將其移植到中風動物模型中 [0104]實施例5-1:將HGF某閔引入到引入了 hNgnl某閔的MSC中
[0105]在IOOmm培養板中培養引入了 hNgnl基因的MSC，直到所述細胞達到大約70%匯合度。通過加入在實施例4中獲得的具有50M0I的表達HGF的腺病毒溶液，進行轉染2小時。用PBS洗滌MSC3次，然后使用胰蛋白酶將MSC從所述培養板上脫下來。
_6] 實施例5-2:中風動物模型的制備
[0107]用含有70%N20和30%02的5%異氟醚氣麻醉重200g至250g的成年雄性SD大鼠。通過在頸中的腹正中切口暴露右頸總動脈(C CA )、右頸外動脈(E CA )、和右頸內動脈(I CA )，然后將大約20mm至22mm4-0尼龍縫線從CCA插入到ICA以閉塞右大腦中動脈(MCA)。120分鐘后，去除尼龍縫線。在手術期間，將大鼠的體溫保持在37.8°C下，并且在使用前將所有手術器具滅菌。
[0108]實施例5-3:將引入了 HGF某閔和hNgnl某閔的MSC移棺到中風動物樽型中
[0109]在導致中風的4周后，將大白鼠置于立體定位裝置中，然后以0.5 μ L/min的速率在前鹵 ΑΡ=+0.5mm, ML=3.5mm, DV=5.0mm 和 AP=-L Omm 的位置移植 5.0X IO5 個引入了 HGF 基因和 hNgnl 基因的 MSC。ML=3.0, DV=2.5mm 使用 25 號 Hamilton 注射器。
[0110]移植后5分鐘，去除Hamilton注射器。除了表達HGF基因和hNgnl基因的MSC，將正常MSCdITvT HGF基因的正常MSCdITvT hNgnl的MSCjP PBS用于細胞移植。
[0111]實施例6:將HGF基因引入引入了人神經原素I基因的MSC并評估它們在中風動物模型中的有效性
[0112]實施例6-1:用于評估MSC在中風動物模型中的有效性的標準建立
[0113]為了評價移植到具有腦損傷的動物中的MSC的有效性，進行MRI和行為試驗。通過大腦中動脈閉塞在大白鼠中誘導中風。4周后，進行3.0T MRI和行為試驗以篩選具有均勻腦損傷的動物，然后向其中移植引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC。
[0114]用腹膜內注射75mg/kg克他命和5mg/kg rumpun麻醉大白鼠，使用裝配有能夠35millitesla/m的梯度系統的3.0T MRI掃描儀進行大鼠腦的MRI掃描。使用快速自旋回波成像序列獲得T2加權的解剖圖像，其中使用下述參數:重復時間4，OOOms ;有效回波時間96ms ;視野55X55mm2 ;圖像矩陣256X256 ;切片厚度1.5mm ;翻轉角90° ;激發數2 ;像素大小 0.21X0.2Imm2ο[0115]對于動物行為試驗，進行粘合劑去除試驗和轉棒試驗。對于粘合劑去除試驗，將IOmmX IOmm的粘合帶置于每個前肢的爪背上，然后測量將每個粘合帶從爪背上去除的時間。對于轉棒試驗，測試實驗動物在旋轉柱體上跑的能力，所述旋轉柱體以5分鐘從4加速到40rpm。在中風誘導前兩周，在實驗中僅篩選和包括能夠在10秒鐘內去除所述粘合帶且在旋轉棒柱體上保持超過300秒鐘的動物。
_] 實施例6-2:評估引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC在中風動物模型中的治療有效性
[0117]中風誘導后4周，進行行為試驗和MRI，以篩選具有均勻腦損傷的動物。用總共5個細胞組移植中風動物模型，所述細胞組包括對照組PBS、正常MSC、引入了 HGF基因的正常MSC、和引入了 hNgnl的MSC、以及引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC。基于行為試驗和MRI評價MSC在中風動物模型中的有效性(圖6)。圖6是示出動物行為試驗的結果的照片，所述動物行為試驗為粘合劑去除試驗(左圖)和轉棒試驗(右圖)，以評價引入了人HGF基因和hNgnl基因的MSC在中風動物模型的治療效力。如圖6所示，當在中風誘導后4周時移植HGF基因的正常MSC、和引入了 hNgnl基因的MSC時，沒有觀察到治療效力。相反，當移植引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC時，清楚觀察到治療效力。
[0118]上述結果表明，引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC在中風動物模型中的移植在中風模型中示出了對由腦損傷導致的運動和感覺損失的優異治療效力。
[0119]此外，通過MRI觀察到引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC在中風動物模型中的治療效力(圖7)。圖7是示出MRI (上圖)結果的照片和中風損傷的定量分析(下圖)，以評價引入了人HGF基因和hNgnl基因的MSC在中風動物模型中的治療效力。如圖7所示，當在中風誘導后28天時移植PBS和引入了神經原素I基因的MSC時，沒有減少梗死尺寸。相反，當移植引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC時，觀察到梗死尺寸的減小。
[0120]上述結構表明，相比于未引入HGF基因的表達hNgnl基因的MSCjIAT HGF基因的表達hNgnl基因的MSC示出對腦梗死的治療效力。
[0121]實施例7:引入了 HGF基因和人神經原素I基因的MSC在中風動物模型中的治療效力的機制
[0122]為了檢查引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC對梗死區的治療效力的機制，制備組織切片并通過免疫組織化學進行分析。
[0123]實施例7-1:組織切片的制備
[0124]移植后8周，如實施例3-4中所述麻醉大白鼠，以提取腦。在4°C下在固定溶液中后固定所述腦16小時。以2_的厚度將后固定的腦切片，在自動阻止處理器中脫水，然后用二甲苯和石蠟滲透。用石蠟包埋滲透了石蠟的組織，使用旋轉顯微鏡用薄片切片機(Leica)以5μπι的厚度切片，然后安裝到涂覆了硅烷的載玻片上。作為免疫組織化學的第一階段以發現組織抗原性，將組織浸潰在IOmM檸檬酸鈉中，使用微波爐在99°C下加熱10分鐘，然后在室溫下冷卻20分鐘。
[0125]實施例7-2:免疫組化染色
[0126]將在實施例 7-1中制備的組織切片浸潰在IX PBS/0.l%Triton X-10030分鐘。作為免疫組織化學的第一階段，使它們與正常山羊血清在室溫下反應I小時以封閉非特異性相互作用。作為一抗，使用以1:200稀釋的ΜΑΡ2和GFP抗體，然后使它們在4°C下反應16小時。在用IX PBS/0.l%TritonX-100洗滌3次15分鐘后，使切片與Alexa488綴合的抗小鼠IgG 二抗(11^行1*(^611，1:250)反應，以檢測MAP2 —抗，和與Alexa568綴合的抗小鼠IgG二抗(Invitrogen, 1:250)反應，以檢測 GFP —抗。
[0127]首先，檢查膠質細胞介導的腦纖維化的標志物GFAP的表達譜(圖8)。圖8是示出免疫組織化學的結果的照片，其中使用GFAP和MAP2抗體，以檢查在引入了人HGF基因和hNgnl基因的MSC的移植之后，梗死區中的膠質細胞及其表達譜。如圖8所示，當在中風誘導(MCAo)后4周時在梗死區中移植PBSdIAT HGF基因的正常MSC、和引入了 hNgnl基因的MSC時，在中風誘導(MCAo)后12周時在膠質細胞群中無變化。相反，當移植引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC時，觀 察到膠質細胞的分布。
[0128]接下來，檢查神經元標志物MAP2的表達譜。結果是，相比于PBS和引入了 HGF基因的正常MSC的移植，引入了 hNgnl基因的MSC的移植和引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC的移植示出神經細胞的更高表達。
[0129]上述結果表明，引入了 hNgnl基因的MSC被分化成神經細胞，并且引入了 HGF基因和hNgnI基因的MSC抑制在腦纖維化中涉及的膠質細胞群，這表明引入了 HGF基因和hNgnI基因的MSC示出對慢性腦損傷的治療效力。
[0130]實施例8:引入了 HGF基因和神經原素I基因的MSC對慢性腦損傷的治療效力
[0131]總的來說，引入了 HGF基因和神經原素I基因的MSC示出了對慢性腦損傷的治療效力(圖9)。圖9是總結引入了人HGF基因和hNgnl基因的MSC在中風動物模型中的治療效力隨細胞移植時間變化的圖解(上圖)和圖(下圖)。如圖9所示，當根據細胞移植時間檢查引入了神經原素I基因的MSC在中風動物模型中的治療效力時，相比于PBS組，在腦損傷后3天(急性)和2周(亞急性)移植時，觀察到運動功能改善，并且在腦損傷后4周移植時，未觀察到效力。然而，引入了神經原素I基因和HGF基因的MSC甚至在中風后4周(慢性)移植時，示出高治療效力。
[0132]因此，上述結果表明，引入了 HGF基因和hNgnl基因的MSC示出對慢性腦損傷的治療效力。
【權利要求】
1.一種成人干細胞系，其通過將編碼肝細胞生長因子(HGF)的基因和編碼堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的神經源性轉錄因子的基因引入成人干細胞系而被修飾。
2.根據權利要求1所述的成人干細胞系，其中所述成人干細胞系是源自選自骨髓、血液、臍帶血、脂肪組織、肝、皮膚、胃腸道、胎盤和子宮的一種或多種組織的干細胞。
3.根據權利要求1所述的成人干細胞系，其中所述成人干細胞系是間充質干細胞(MSC)系。
4.根據權利要求1所述的成人干細胞系，其中所述bHLH家族的神經源性轉錄因子是選自神經原素1、神經原素2、neuro DUMASH1、MATH3和E47或它們的活性片段的一種或多種轉錄因子。
5.根據權利要求4所述的成人干細胞系，其中所述bHLH家族的神經源性轉錄因子是神經原素I。
6.根據權利要求5所述的成人干細胞系，其中所述神經原素I包括SEQID N0.2的核苷酸序列。
7.根據權利要求1所述的成人干細胞系，其中所述HGF基因包括SEQID N0.1的核苷酸序列。
8.根據權利要求1所述的成人干細胞系，其中通過腺病毒載體的方式將所述HGF基因引入到所述成人干細胞系中。
9.一種用于制備經 修飾的成人干細胞系的方法，所述方法包括下述步驟:(a)將具有SEQ ID N0.1核苷酸序列的編碼肝細胞生長因子的基因和具有SEQ ID N0.2核苷酸序列的編碼神經原素I的基因引入到培養的成人干細胞中； (b)篩選引入了編碼肝細胞生長因子和神經原素I的基因二者的經修飾的成人干細胞系；和 (C)培養所篩選的經修飾的成人干細胞系。
10.根據權利要求9所述的方法，其中順序或以相反次序或同時引入編碼肝細胞生長因子的基因和編碼神經原素I的基因。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述成人干細胞系是源自選自骨髓、血液、臍帶血、脂肪組織、肝、皮膚、胃腸道、胎盤和子宮的一種或多種組織的干細胞。
12.一種用于預防或治療神經疾病的組合物，所述組合物包含根據權利要求1至8中任一項所述的經突變的成人干細胞系或通過根據權利要求9至11中任一項所述的方法產生的經突變的成人干細胞系作為活性成分。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中所述神經疾病是選自神經疾病中的一種或多種，所述神經疾病包括帕金森病、阿爾茲海默病、亨丁頓氏舞蹈病、肌萎縮側索硬化、癲癇、精神分裂、急性中風、慢性中風、和脊髓損傷以及中風后的慢性損傷。
14.一種用于治療神經疾病的方法，所述方法包括給具有神經疾病或疑似具有神經疾病的受試者施用根據權利要求12所述的組合物的步驟。
【文檔編號】C12N5/074GK103562377SQ201280025007
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月23日 優先權日:2011年5月23日
【發明者】徐海榮, 金性洙, 柳承完, 李永敦 申請人:亞洲大學校產學協力團