在單路或多路測定法中用于檢測人細小病毒核酸和用于檢測甲型肝炎病毒核酸的組合物 ...的制作方法
【專利摘要】本發明公開了對人細小病毒基因組DNA特異性的核酸寡聚物。還公開了一種用于在生物標本中擴增和檢測人細小病毒基因型1、2和3的核酸的測定法。還公開了用于在人生物標本中擴增和檢測人細小病毒基因型1、2和3的基因組DNA的存在的組合物。
【專利說明】在單路或多路測定法中用于檢測人細小病毒核酸和用于檢測甲型肝炎病毒核酸的組合物和方法
[0001]相關專利申請的交叉引用
[0002]本申請根據35U.S.C.§ 119要求2011年7月15日提交的美國專利申請N0.61/508，597的優先權，將該專利申請的全部內容以引用的方式并入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用于檢測人傳染性病原體的診斷方法和組合物，并且具體地講涉及用于體外檢測人細小病毒基因型1、2和3和/或甲型肝炎病毒的核酸的方法和組合物。
【背景技術】
[0004]多種治療性蛋白質，包括凝血因子、免疫球蛋白(IVIG)以及白蛋白，是由如基立福(Grifols)、百特(Baxter)以及CSL之類的公司從人血漿中純化而來的。檢驗細小病毒B19和HAV是重要的，因為它們是無包膜病毒，這使得這些病毒在純化(分級分離)過程期間抗滅活。允許相對低水平的B19存在于血漿級分中(現行規定要求在可含有4，000至5，000個單獨的血漿單位的制造池中低于10，000IU)。與其冒險集合成一個大型制造池而然后發現其污染有B19，通常用血漿分級分離器來篩選較小的池來鑒定含有高滴度B19的單獨的血漿單位。目前不存在關于HAV的規 定，但一般也執行檢驗，因為這樣做已經變成一個行業標準。
[0005]人細小病毒(紅細胞病毒屬(Erythrovirus))是一種血源性無包膜病毒，其具有約5.5kb的單鏈DNA(ssDNA)基因組(Shade等人，1986，J.Virol.(《病毒學雜志》)58(3):921-936 ;Brown 等人，1997，Ann.Rev.Med.(《醫學年評》)48:59-67)。單獨的病毒粒子含有一個拷貝的基因組的正鏈或負鏈，以大致相等數目表現。該ssDNA基因組具有形成約350nt的5’和3’發夾的反向末端重復序列，所述反向末端重復序列為病毒復制所必需。該基因組在正鏈上包括兩個開放閱讀框，其編碼結構蛋白(VPl和VP2)和非結構蛋白(NSl)。
[0006]曾經認為人細小病毒是高度保守的，遺傳多樣性小于2%。然而，近來已發現人紅細胞病毒屬分離株(最初稱為V9)與B19相比在基因組序列方面具有大于11%的趨異性，其中最驚人的DNA不相似性>20%，是在p6啟動子區域內觀察到的。該V9分離株也被測定具有大于11%的臨床存在率。現在人紅細胞病毒屬群體被分成三個不同的病毒基因型:基因型1(B19)、基因型2 (A6樣和LaLi樣)以及基因型3 (V9樣)。(Servant等人，2002，J.Virol.(《病毒學雜志》)76(18):9124-34 ;Ekman等人，2007，J.Virol.(《病毒學雜志》)81 (13):6927-35)。Servant等人將基因型I稱為對應于細小病毒B19的病毒并將基因型2和3稱為對應于細小病毒V9相關病毒的病毒。Ekman等人將基因型1_3稱為都對應于細小病毒B19。本文為方便起見,將基因型1、2和3稱為細小病毒基因型1、2和3或人細小病毒基因型1、2和3。不能精確檢測所有細小病毒基因型的核酸檢測測定法會導致許多血漿池仍污染有人細小病毒。因此，需要一種可檢測人細小病毒基因型1、2和3的核酸檢驗。[0007]人細小病毒感染可通過呼吸道傳播或通過受感染的血液或血液制品而發生。受感染的個體可能不表現出癥狀，或具有傳染性紅斑(erythema infectiosum)癥狀,該癥狀包括輕度流感樣癥狀、皮疹(“第五病”)、短暫性關節炎樣關節疼痛(關節病)、溶血性貧血患者中的再生障礙性危象、持續性細小病毒感染以及約10%的由于胎兒死亡而造成的早期流產。因此，不能檢測匯集的血漿樣本中的細小病毒或不能診斷感染具有嚴重的后果。
[0008]此外，需要檢測測定法提供檢測靈敏性，該靈敏性使得能檢測如可能在感染早期或在稀釋或匯集的樣本中出現的低滴度的病毒。可檢測適當水平的污染的細小病毒核酸檢測測定法可有助于在使用前從血液供給處移除受感染的捐獻單位或受污染批次的匯集血漿。
[0009]許多免疫診斷方法可檢測個體的血清或血漿中存在的抗細小病毒抗體(IgM或IgG)(例如參見 Wolf 等人的 PCT N0.W096/09391 和 Hedman 等人的 PCT N0.W096/27799)。這些方法在檢測近來或當前的感染時具有局限性，因為它們依賴于檢測身體對傳染性病原體的響應。在感染后病毒血癥的快速增加導致個體的血液中存在高水平的細小病毒而無相應的可檢測水平的抗細小病毒抗體(參見例如Brentano等人的美國專利N0.7，094, 541的實例4)。因此，基于免疫學的檢測測定法容易出現假陰性結果。此外，病毒血癥經常被迅速清除，然而人可能會在不存在這些感染性粒子的情況下仍保持抗體陽性，因此產生假陽性結果。多達90%的成年人對細小病毒呈血清陽性，這使得精確地免疫學檢測近來或當前的感染存在困難。其他類似的測定法通過檢測結合于純化的細胞受體的病毒或空病毒衣殼來檢測細小病毒的存在(Young等人的美國專利5，449，608)，這些基于免疫的測定法遭遇類似的問題。
[0010]DNA雜交和擴增方法也已經用于檢測人細小病毒，但這些檢驗一般是只針對基因型I的檢測。然而，美國和歐洲管理機構已經發布標準，規定用于制造抗D免疫球蛋白和其他血漿衍生物的血漿池可含有不超過10，000IU/ml (在歐洲為IOIU/微升)的任何人細小病毒。如上文所論述的，治療性血漿池和診斷檢驗同樣需要可靠地鑒定人細小病毒類型1、2和3。因此，本領域中需要可用于人細小病毒類型1、2和3的體外核酸檢測的組合物、試劑盒以及方法。
[0011]甲型肝炎病毒(HAV)為一種形式的肝炎的病原體，該種肝炎可在不到兩個月內產生包括發熱、疲乏、惡心、腹痛、腹瀉、食欲不振以及黃疸在內的癥狀。在HAV感染者中，約10%至15%在感染后六至九個月內具有長期或復發的癥狀。在有癥狀感染和無癥狀感染之后，基于個體內產生抗HAV免疫球蛋白G(IgG)而對HAV具免疫性。
[0012]盡管自20世紀90年代末以來在已廣泛使用HAV疫苗接種的世界上部分地區的HAV感染發生率已急劇降低，但在存在不良衛生狀況(即使暫時地，例如在地震后)的非免疫群體中可能出現HAV感染的流行病(每100,000個人口 >700例，并且對于生活在高甲型肝炎比率的地區的兒童來說,該比率增加至每100，000個人口 >20例)。傳染也可能由接觸受HAV污染的血清或血液制品而產生。甚至在美國，每年有約100個人死于因甲型肝炎引起的急性肝功能衰竭(死亡率為約0.015%)。即使在非致命性甲型肝炎病例中，與HAV感染相關的費用也相當大，包括由患者住院、門診以及誤工時所產生的費用。 [0013]HAV為含有具有約7.5kb的有義單鏈RNA基因組的27_nm RNA病毒(細小核糖核酸病毒)。該病毒在急性感染期內于肝臟中復制，于膽汁中排泄并且在于糞便中排出(例如，高達每毫升108個病毒)。在癥狀出現前的潛伏期通常為兩至六周。已在全世界范圍內發現單一血清型的HAV。通過癥狀或其他臨床特征(例如，血清轉氨酶水平升高)不能將甲型肝炎的診斷與其他類型的病毒性肝炎相區分。通常，通過提供存在抗HAV免疫球蛋白(Ig)的陽性結果的血清學檢驗來證實甲型肝炎診斷。抗HAV IgM—般在癥狀發作前的五至十天存在并且六個月后在大部分患者中不可檢測，而抗HAV IgG在感染期間早期出現并且在個體終身可檢測。通過使用核酸檢驗方法(例如，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增)可以在急性感染期內在大部分人的血液和大便中檢測到HAV RNA，并且已使用核酸測序來鑒定社區范圍內感染后HAV的基因相關性(Dato等人，Morbidity Mortality ffkly.Rpt.(《發病率和死亡率周報》)，2003，52 (47): 1155-57 ;LaPorte 等人,Morbidity Mortality ffkly.Rpt.(《發病率和死亡率周報》)，2003，52 (24): 565-67)。然而，這些方法一般不用于診斷目的。
[0014]因此，需要精確地檢測生物樣本和環境樣本中HAV的存在。還需要檢測可用于醫學治療的產品(例如，用于輸液的血液或血清，或源自人血液或血清的因子)中的HAV污染的存在。此外需要檢測可能受污染的物質(例如水或食物)中HAV的存在以防止由于消費了受污染的物質而引起的社區范圍疾病爆發或流行病。
[0015]本文公開的發明通過描述可用于核酸檢驗方法中來檢測HAV核酸(HAV RNA或自其衍生的序列，例如，cDNA)的存在的寡核苷酸序列來回應這些需要。本申請還描述了檢測樣本中存在的HAV RNA的存在的核酸檢驗方法。
【發明內容】
[0016]本發明涉及用于檢測甲型肝炎病毒和/或人細小病毒基因型1、2和3的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方法被構造用于擴增甲型肝炎病毒和/或人細小病毒核酸的靶序列并且被構造用于檢測甲型肝炎病毒和/或人細小病毒核酸或擴增的核酸的靶序列。在某些實施例和方面中，甲型肝炎病毒的靶序列內的特定區域和人細小病毒內的特定區域已經被鑒定為用于樣本(包括源自受感染人的生物標本，例如血漿樣本)的核酸擴增反應的優選靶標。靶向這 些區域的擴增寡聚物或檢測寡聚物可具有共同的核心序列，并且因此提供多個特別優選的擴增寡聚物或檢測寡聚物。使用此類特別優選的擴增寡聚物所產生的擴增產物將含有可用于特異性檢測來自樣本的人細小病毒或HAV的靶特異性序列。擴增產物的檢測可包括多種方法中的任一種，所述方法包括但不限于基于探針的檢測、雜交保護測定法、基于分子炬、分子信標或分子開關的測定法、質譜分析、MALD1-T0F質譜分析、ES1-TOF質譜分析、實時檢測測定法、凝膠電泳、SDS-PAGE電泳、桑格測序(Sangersequencing)、第二代測序(Next Generation Sequencing)等。祀序列的這些優選區域可提供關于特異性、靈敏度或檢測速度以及高靈敏度檢測的改善。使用這些擴增和/或檢測寡聚物，所述方法包括擴增人細小病毒基因組或HAV基因組內的靶序列并檢測擴增產物的步驟。檢測寡聚物優選用于檢測擴增產物。
[0017]一個實施例為用于檢測樣本中的人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的寡聚物組合，所述寡聚物組合包含:(1)用于擴增人細小病毒核酸靶區域的第一擴增寡聚物和第二擴增寡聚物，其中，(a)該第一細小病毒擴增寡聚物包含第一靶標雜交序列，該第一靶標雜交序列為SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 179或SEQ ID NO: 180的序列；并且(b)該第二細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第二靶標雜交序列:(i)為SEQ ID NO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列的序列；和
(ii)為SEQ ID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ IDNO: 192的序列的序列；和/或(II)用于擴增HAV核酸靶區域的第一擴增寡聚物和第二擴增寡聚物，其中(a)該第一 HAV擴增寡聚物包含第一靶標雜交序列，該第一靶標雜交序列為SEQ ID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；并且(b)該第二 HAV擴增寡聚物包含第二靶標雜交序列，該第二靶標雜交序列具有SEQ ID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列。
[0018]在一個方面，該寡聚物組合包含(I)的第一細小病毒擴增寡聚物和第二細小病毒擴增寡聚物。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 179的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 117的序列。在一個方面，(I) (a)的第一靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 184的序列中。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID N0:81-84。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 180的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID N0:82-84。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 108-113。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191的序列中。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID N0:118-121。在一個方面，該第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該17啟動子序列具有SEQ ID NO: 196中示出的序列。在一個方面，該第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。
[0019]在一個方面，上述寡聚物組合還包含(III)用于擴增人細小病毒核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物，其中:(a)該第三細小病毒擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，該第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 180的序列；并且(b)該第四細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第四靶標雜交序列:(i)為SEQ ID NO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列的序列；和(ii)為SEQ ID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 192的序列的序列；其中(III) (a)的第三靶標雜交序列不同于(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列；并且其中(III) (b)的第四靶標雜交序列不同于(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列。
[0020]在一個方面，第三細小病毒擴增寡聚物如上所述并且第一細小病毒擴增寡聚物是如下文所述:(1) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 179的序列；(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ IDNO: 117或SEQ ID NO: 183的序列；(I) (a)的第一靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列；(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 184的序列中；(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID N0:81-84；(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID N0:180的序列，或⑴(a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:82-84。
[0021 ] 在一個方面，第四細小病毒擴增寡聚物如上所述并且第二擴增寡聚物是如下文所述:(1) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列；(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列；(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 108-113 ； (I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191的序列中；(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列；(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ IDNO: 118-121 ;第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于靶標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者；第二細小病毒擴增寡聚物為還包含啟動子序列(其為T7啟動子序列)的啟動子引物或啟動子提供者；第二細小病毒擴增寡聚物為還包含T7啟動子序列的啟動子引物或啟 動子提供者并且該17啟動子序列具有SEQ ID NO: 196中示出的序列；并且第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。
[0022]在一個實施例中，提供由任何本文所述的擴增寡聚物組成的寡聚物組合并且該寡聚物組合還包含至少一種細小病毒特異性捕集探針寡聚物，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 132-135。在一個方面，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO: 128-131 的序列。
[0023]在一個實施例中，提供由任何本文所述的擴增寡聚物組成的寡聚物組合并且該寡聚物組合還包含置換體寡聚物(displacer oligomer)，該置換體寡聚物包含被構造用于與第一細小病毒擴增寡聚物或第二細小病毒擴增寡聚物上游的細小病毒靶核酸雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該寡聚物組合還包含至少一種細小病毒特異性捕集探針寡聚物，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID N0:132-135。在一個方面，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO: 128-131的序列。
[0024]在一個實施例中，提供由任何本文所述的擴增寡聚物組成的寡聚物組合并且該寡聚物組合還包含至少一種細小病毒特異性檢測探針寡聚物，該細小病毒特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 199內所含的從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置2966、或從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置3067的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該細小病毒特異性檢測探針革巴標雜交序列包含于SEQ ID NO: 194或195的序列中。在一個方面,該細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 137-169。在一個方面，該寡聚物組合還包含置換體寡聚物，該置換體寡聚物包含被構造用于與第一細小病毒擴增寡聚物或第二細小病毒擴增寡聚物上游的細小病毒靶核酸雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該寡聚物組合還包含至少一種細小病毒特異性捕集探針寡聚物，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ IDNO: 132-135。在一個方面，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO: 128-131的序列。
[0025]在一個實施例中，寡聚物的組合為任何上述細小病毒寡聚物組合，其還包含(II)的第一 HAV擴增寡聚物和第二 HAV擴增寡聚物。在一個方面，(II) (a)的第一靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 172的序列中。在一個方面，(II) (a)的第一靶標雜交序列至少包括SEQID NO: 170的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 1-6和
11。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 171的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 1-60在一個方面，(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:176的序列中。在一個方面，(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID N0:29-38和45。在一個方面，該第二 HAV擴增寡聚物為還包含位于祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該17啟動子序列具有SEQ ID N0:196中示出的序列。在一個方面，該第二 HAV擴增寡聚物具有選自SEQ ID NO: 12-21和28的序列。
[0026]在一個實施例中，寡聚物組合為任何上述細小病毒寡聚物組合和HAV寡聚物組合，其還包括(IV)用于擴增HAV核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物，其中(a)該第三HAV擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，該第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；和(b)該第四HAV擴增寡聚物包含第四靶標雜交序列，該第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列；其中(IV) (a)的第三靶標雜交序列不同于(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列；并且其中(IV) (b)的第四靶標雜交序列不同于(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列。在一個方面，該第三HAV擴增寡聚物為如權利要求30至34中的任一項中關于第一 HAV擴增寡聚物所示的寡聚物。在一個方面，該第四HAV擴增寡聚物為如權利要求35至40中關于第二 HAV擴增寡聚物所示的寡聚物。
[0027]在一個實施例中，提供一種由任何本文所述的擴增寡聚物組成的寡聚物組合并且該寡聚物組合還包含至少一種HAV特異性捕集探針寡聚物，該HAV特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID N0:52-57。在一個方面，該HAV特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ IDNO:46-51的序列。
[0028]在一個實施例中，提供一種由任何本文所述的擴增寡聚物組成的寡聚物組合并且該寡聚物組合還包含置換體寡聚物，該置換體寡聚物包含被構造用于與第一 HAV擴增寡聚物或第二 HAV擴增寡聚物上游的HAV靶核酸雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該寡聚物組合還包含至少一種HAV特異性捕集探針寡聚物，該HAV特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQID NO: 52-57。在一個方面，該HAV特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO:46-51的序列。
[0029]在一個實施例中，提供一種由任何本文所述的擴增寡聚物組成的寡聚物組合并且該寡聚物組合還包含至少一種細小病毒特異性HAV特異性檢測探針寡聚物，該細小病毒特異性HAV特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQID NO: 198內所含的從大約核苷酸位置5965至大約核苷酸位置6028的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該HAV特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO:46-51的序列。在一個方面，該HAV特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO:178的序列中。在一個方面，該HAV特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 58-74。在一個方面，該寡聚物組合由任何本文所述的擴增寡聚物組成并且該寡聚物組合還包含置換體寡聚物，該置換體寡聚物包含被構造用于與第一 HAV擴增寡聚物或第二 HAV擴增寡聚物上游的HAV靶核酸雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該寡聚物組合還包含至少一種HAV特異性捕集探針寡聚物，該HAV特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID NO:52-57。
[0030]一個實施例為包含任何本文所述的寡聚物組合的試劑盒。一個實施例為包含任何本文所述的寡聚物組合的反應混合物。一個實施例為使用至少一種本文所述的擴增寡聚物來擴增甲型肝炎病毒的單路擴增測定法。在一個方面，該甲型肝炎病毒單路擴增測定法是使用至少一種本文所述的檢測探針寡聚物來擴增和檢測甲型肝炎病毒。一個實施例為使用至少一種本文所述的擴增寡聚物來擴增細小病毒的單路擴增測定法。在一個方面，該細小病毒單路擴增測定法是使用至少一種本文所述的檢測探針寡聚物來擴增和檢測細小病毒。一個實施例為使用至少一種本文所述的擴增寡聚物來擴增甲型肝炎病毒和細小病毒的多路擴增測定法。在一個方面，該甲型肝炎病毒和細小病毒多路擴增測定法是使用至少一種本文所述的檢測探針寡聚物來擴增和檢測甲型肝炎病毒和細小病毒。
[0031]一個實施例為用于檢測樣本中的人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法，該方法包括:(A)提供樣本，其中該樣本疑似含有人細小病毒和HAV中的至少一者；(B)使所述樣本與用于擴增人細小病毒核酸靶區域和HAV核酸靶區域中的至少一者的寡聚物組合接觸，所述寡聚物組合包含:(I)對于該細小病毒酸靶區域，(a)第一細小病毒擴增寡聚物包含 第一靶標雜交序列，該第一靶標雜交序列為SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 117,SEQ ID NO: 179或SEQ ID NO: 180的序列；和(b)第二細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第二靶標雜交序列:(i)為SEQ ID NO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQID NO: 188的序列的序列；和(ii)為SEQ ID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 192的序列的序列；和/或(II)對于該HAV靶區域，(a)第一 HAV擴增寡聚物包含第一靶標雜交序列，該第一靶標雜交序列為SEQ ID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；和(b)第二HAV擴增寡聚物包含第二靶標雜交序列，該第二靶標雜交序列為SEQ ID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列；(C)執行體外核酸擴增反應，其中所述樣本中存在的任何細小病毒和/或HAV靶核酸被用作產生細小病毒和/或HAV擴增產物的模板；以及(D)檢測該細小病毒和/或HAV擴增產物的存在或不存在，從而指示所述樣本中細小病毒和/或HAV的存在或不存在。
[0032]在一個方面，該方法是用于檢測人細小病毒靶核酸并且使樣本與(I)的第一細小病毒擴增寡聚物和第二細小病毒擴增寡聚物接觸。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 179的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 183的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 184的序列中。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 75、76、77和81-84。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 180的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQID NO:82-84。在一個方面，(I)(b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 108-113。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191 的序列中。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。在一個方面，(I)(b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ IDNO:118-121。在一個方面，該第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于靶標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該H啟動子序列具有SEQ IDNO:196中示出的序列。在一個方面，該第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。
[0033]在一個實施例中，步驟(B)還包括使該樣本與(III)用于擴增人細小病毒核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物接觸，其中(a)該第三細小病毒擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，該第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 179或SEQ ID NO: 180的序列；并且
(b)該第四細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第四靶標雜交序列:(i)為SEQ ID NO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列的序列；和
(ii)為SEQ ID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ IDNO: 192的序列的序列；其中(III) (a)的第三靶標雜交序列不同于(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列；并且其中(III) (b)的第四靶標雜交序列不同于(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列。在一個方面，該第三細小病毒擴增寡聚物為SEQ ID NO: 182的序列中所含的寡聚物并且至少包括SEQ ID NO: 179的序列。在一個方面，(I) (a)的第三細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 183的序列。在一個方面，(I) (a)的第三細小病毒靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列。在一個方面，(I) (a)的第三細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 184的序列中。在一個方面，(I) (a)的第三細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:75-77和81-84。在一個方面，(I) (a)的第三細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 180的序列。在一個方面，(I) (a)的第三細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:82-84。在一個方面，該第四細小病毒擴增寡聚物包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。在一個方面，(I) (b)的第四細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。在一個方面，⑴(b)的第四細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 108-113。在一個方面，⑴(b)的第四細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:191的序列中。在一個方面，(I) (b)的第四細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。在一個方面，(I) (b)的第四細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID N0:118-121。在一個方面，該第四細小病毒擴增寡聚物為還包含位于祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該17啟動子序列具有SEQ ID NO: 196中示出的序列。在一個方面，該第四細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQ IDNO:88-93和98-101的序列。
[0034]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括在步驟(B)之前從該樣本中的其他成分純化細小病毒靶核酸。在一個方面，該純化步驟包括使該樣本與至少一種細小病毒特異性捕集探針寡聚物接觸，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID N0:132-135。在一個方面，該細小病毒特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO: 128-131的序列。 [0035]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，步驟(B)還包括使該樣本與置換體寡聚物接觸，該置換體寡聚物包含被構造用于與第一細小病毒擴增寡聚物或第二細小病毒擴增寡聚物上游的細小病毒靶核酸雜交的靶標雜交序列。
[0036]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，檢測步驟(D)包括使所述體外核酸擴增反應物與細小病毒特異性檢測探針寡聚物接觸，該細小病毒特異性檢測探針寡聚物被構造用于在借此測定細小病毒擴增產物的存在或不存在的條件下與該細小病毒擴增產物特異性雜交，從而指示所述樣本中細小病毒的存在或不存在。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 199內所含的從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置2966、或從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置3067的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。在一個方面，該細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQID NO: 194或195的序列中。在一個方面，該細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 137-169。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針包含選自如下的標記:(a)化學發光標記;(b)熒光標記；(C)淬滅劑；和(d) (a)、(b)和(C)中的一者或多者的組合。
[0037]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括使該樣本與可使用第一細小病毒擴增寡聚物和第二細小病毒擴增寡聚物在體外核酸擴增反應中擴增以產生第二擴增產物的假靶標寡聚物接觸，該第二擴增產物在檢測反應條件下不與細小病毒特異性檢測探針特異性雜交。
[0038]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括使該樣本與冷探針寡聚物接觸，該冷探針寡聚物與細小病毒特異性檢測探針寡聚物競爭雜交至細小病毒擴增產物。
[0039]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括使該樣本與調諧體寡聚物(tuner oligomer)接觸,該調諧體寡聚物被構造用于與第一細小病毒擴增寡聚物和第二細小病毒擴增寡聚物二者特異性雜交。
[0040]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，檢測步驟(D)發生在擴增步驟(C)期間。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針包括熒光標記、淬滅劑或這二者。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針為TaqMan檢測探針或分子信標。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針包含選自如下的標記:(a)化學發光標記；(b)熒光標記；(c)淬滅劑；和(d) (a)、(b)和(C)中的一者或多者的組合。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針還包含非靶標雜交序列。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針為發夾檢測探針。在一個方面，該發夾檢測探針為分子信標或分子炬。
[0041]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，步驟(C)的擴增反應為等溫擴增反應。在一個方面，該擴增反應為實時擴增反應。
[0042]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，步驟(C)的擴增反應為PCR擴增反應。在一個方面，該擴增反應為實時擴增反應。[0043]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，其中該方法是用于檢測HAV靶核酸，使該樣本與(II)的第一HAV擴增寡聚物和第二 HAV擴增寡聚物接觸。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 172的序列中。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 170的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ IDNO: 1-6和11。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 171的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID N0:l_6。在一個方面，(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:176的序列中。在一個方面，(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID N0:29-38和45。在一個方面，該第二 HAV擴增寡聚物為還包含位于祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該17啟動子序列具有SEQ ID NO: 196中示出的序列。在一個方面，該第二 HAV擴增寡聚物具有選自SEQ ID N0:12-21和28的序列。
[0044]在一個實施例中，步驟(B)還包括使樣本與(IV)用于擴增HAV核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物接觸，其中(a)該第三HAV擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，該第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；并且(b)該第四HAV擴增寡聚物包含第四靶標雜交序列，該第四靶標雜交序列為SEQ ID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列；其中(IV) (a)的第三靶標雜交序列不同于(II) (a)的第一HAV靶標雜交序列；并且其中(IV) (b)的第四靶標雜交序列不同于(II) (b)的第二HAV靶標雜交序列。在一個方面，該第三HAV擴增寡聚物為如權利要求96至100中的任一項中關于第一 HAV擴增寡聚物所述的寡聚物。在一個方面，該第四HAV擴增寡聚物為如權利要求101至106中關于第二 HAV擴增寡聚物所述的寡聚物。
[0045]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括在步驟(B)之前從該樣本中的其他成分純化HAV靶核酸。在一個方面，該純化步驟包括使該樣本與至少一種HAV特異性捕集探針寡聚物接觸，該HAV特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID NO:52-57。在一個方面，該HAV特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO:46-51的序列。
[0046]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括在擴增步驟使用置換體寡聚物，該置換體寡聚物包含被構造用于與第一 HAV擴增寡聚物或第二 HAV擴增寡聚物上游的HAV靶核酸雜交的靶標雜交序列。
[0047]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，檢測步驟(D)包括使所述體外核酸擴增反應物與HAV特異性檢測探針寡聚物接觸，該HAV特異性檢測探針寡聚物被構造用于在借此測定HAV擴增產物的存在或不存在的條件下與該HAV擴增產物特異性雜交，從而指示所述樣本中HAV的存在或不存在。在一個方面，HAV特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 198內所含的從大約核苷酸位置5965至大約核苷酸位置6028的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。在一個方面，HAV特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 178的序列中。在一個方面，該HAV特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ IDN0:58-74。在一個方面，HAV特異性檢測探針包含選自如下的標記:(a)化學發光標記；(b)突光標記；(C)淬滅劑；和(d) (a)、(b)和(C)中的一者或多者的組合。
[0048]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括使該樣本與可使用第一 HAV擴增寡聚物和第二 HAV擴增寡聚物在體外核酸擴增反應中擴增以產生第二擴增產物的假靶標寡聚物接觸，該第二擴增產物在檢測反應條件下不與HAV特異性檢測探針特異性雜交。
[0049]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括使該樣本與冷探針寡聚物接觸，該冷探針寡聚物與HAV特異性檢測探針寡聚物競爭雜交至HAV擴增產物。
[0050]在一個實施例中，用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法還包括該樣本與調諧體寡聚物接觸，該調諧體寡聚物被構造用于與第一 HAV擴增寡聚物和第二 HAV擴增寡聚物特異性雜交。
[0051]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，檢測步驟(D)發生在擴增步驟(C)期間。在一個方面，HAV特異性檢測探針包括突光標記、淬滅劑或這二者。在一個方面，HAV特異性檢測探針為TaqMan檢測探針或分子信標。在一個方面，HAV特異性檢測探針包含選自如下的標記:(a)化學發光標記;(b)突光標記；(C)淬滅劑；和(d) (a)、(b)和(C)中的一者或多者的組合。在一個方面，HAV特異性檢測探針還包含非靶標雜交序列。在一個方面，HAV特異性檢測探針為發夾檢測探針。在一個方面，該發夾檢測探針為分子信標或分子炬。
[0052]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，步驟(C)的擴增反應為等溫擴增反應。
[0053]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，步驟(C)的擴增反應為PCR擴增反應。
[0054]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，該擴增反應為實時擴增反應。
[0055]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，樣本來自個體患者。在一個方面，樣本是被匯集的。在一個方面，該匯集樣本為匯集的血漿樣本。在一個方面，樣本為用于衍生治療性化合物的血漿樣本。在一個方面,樣本為用于衍生化合物的血漿樣本,該化合物為人凝血酶、人抗體或其部分、人蛋白、人細胞因子受體、人細胞因子配體或其他衍生自血漿的化合物。
[0056]在用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法的一個實施例中，其中該方法是用于檢測人細小病毒靶核酸和HAV靶核酸，并且其中檢測步驟(D)包括使所述體外核酸擴增反應物與細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物接觸，該細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物被構造用于在借此測定細小病毒擴增產物和HAV擴增產物的存在或不存在的條件下分別與該細小病毒擴增產物和該HAV擴增特異性雜交，從而指示所述樣本中細小病毒和HAV的存在或不存在。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物被區別標記。在其中細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物各包含標記的一個方面，所述標記獨立地選自(a)化學發光標記和(b)突光標記。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物各包含化學發光標記。在一個方面，用于細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物的化學發光標記的特征為不同的發光動力學，其足以區分細小病毒特異性化學發光信號與HAV特異性化學發光信號。在一個方面，用于細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物的化學發光標記各包含吖啶酯(AE)。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 179的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 183的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:184的序列中。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:81-84。在一個方面，(I)(a)的第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ IDNO: 180的序列。在一個方面，(I) (a)的第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID N0:82_84。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ IDNO: 108-113。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191的序列中。在一個方面，(I) (b)的第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。在一個方面，(I)(b)的第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 118-121.在一個方面，該第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于靶標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該17啟動子序列具有SEQ ID NO: 196中示出的序列。在一個方面，該第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQ ID NO:88-93和98-101的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 172`的序列中。在一個方面，(II) (a)的第一HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 170的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ IDNO: 1-6和11。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 171的序列。在一個方面，(II) (a)的第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID N0:l_6。在一個方面，(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 176的序列中。在一個方面，(II) (b)的第二 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 29-38和45。在一個方面，該第二 HAV擴增寡聚物為還包含位于祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。在一個方面，該啟動子序列為17啟動子序列。在一個方面，該17啟動子序列具有SEQ ID NO: 196中示出的序列。在一個方面，該第二 HAV擴增寡聚物具有選自SEQ ID N0:12-21和28的序列。在一個方面，細小病毒特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 199內所含的從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置2966、或從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置3067的祀序列特異性雜交的祀標雜交序列。在一個方面，該細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:194或195的序列中。在一個方面，該細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 137-169。在一個方面，HAV特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQID NO: 198內所含的從大約核苷酸位置5965至大約核苷酸位置6028的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。在一個方面，HAV特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 178的序列中。在一個方面，該HAV特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 58-74。
[0057]在一個實施例中，提供用于從樣本中多路擴增和檢測人細小病毒基因型1、2和3靶核酸以及甲型肝炎病毒靶核酸的方法。在該實施例的一個方面，用于擴增和檢測人細小病毒基因型1、2和3的擴增寡聚物包括一種或多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，兩種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，三種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，四種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，五種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，六種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，七種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在該實施例的一個方面，用于擴增和檢測HAV的擴增寡聚物包括一種或多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，兩種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，三種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，四種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，五種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，六種或更多種于表3中所述的擴增寡聚物。在另一方面，七種或更多種于 表3中所述的擴增寡聚物。在該實施例的一個方面，用于檢測由人細小病毒基因型1、2和3產生的擴增產物和用于檢測由HAV產生的擴增產物的檢測探針寡聚物包括一種或多種于表3中所述的細小病毒檢測探針和一種或多種于表3中所述的HAV檢測探針。在另一方面，在用于實時檢測的擴增期間存在檢測探針寡聚物。在另一方面，在用于終點檢測的擴增反應之后將檢測探針寡聚物與擴增產物組合。在該實施例的一個方面，人細小病毒基因型1、2和3靶核酸、HAV靶核酸的多路擴增和檢測為定量多路擴增和檢測反應。在該實施例的一個方面，將人細小病毒基因型1、2和3靶核酸與其他樣本組分分離。在另一方面，該分離是使用靶標捕集寡聚物執行的。在該實施例的一個方面，將HAV靶核酸與其他樣本組分分離。在另一方面，該分離是使用靶標捕集寡聚物執行的。在該實施例的一個方面，擴增和檢測反應包括內部對照。
【具體實施方式】
[0058]本申請公開了被構造用作用于通過體外核酸擴增測定法檢測生物樣本中存在的甲型肝炎病毒和/或細小病毒類型1、2和3的核酸序列的擴增寡聚物和檢測探針寡聚物的寡核苷酸序列。該方法的一個實施例使用轉錄介導的核酸擴增(如先前在Kacian等人的美國專利N0.5，399，491和N0.5，554，516中所詳細公開的)。用于檢測擴增核酸的方法使用與擴增序列的一部分特異性雜交的序列特異性探針。在一個方面，該方法使用任何已知的均相檢測步驟來檢測混合物中結合至擴增核酸的標記探針(例如,如由Arnold等人，Clin.Chem.(《臨床化學》)35:1588-1594 (1989);頒給Nelson等人的美國專利N0.5，658，737以及頒給Lizardi等人的美國專利N0.5，118，801和N0.5，312，728所公開的)。本申請還公開了可通過使用核酸雜交技術用于捕集甲型肝炎病毒靶標DNA或細小病毒類型1、2和3的靶標DNA的寡核苷酸序列。捕集步驟的一個實施例使用磁性粒子來分離所捕集的靶標(參見頒給Weisburg等人的美國專利N0.6, 110, 678)。
[0059]應注意，術語“一個/種”實體是指一個/種或多個/種所述實體；例如，“一種核酸”應理解為表示一種或多種核酸。因而，術語“一個/種”、“一個/種或多個/種”以及
“至少一個/種”在本文可互換使用。
[0060]“樣本”或“生物樣本”意指源自可能含有細小病毒核酸和/或甲型肝炎病毒核酸的活人或死人的任何材料，包括例如痰液、外周血、血衆、血清、包括淋巴結、呼吸組織或分泌物在內的活檢組織、或其他體液、組織或材料。樣本可被處理以通過物理、化學和/或機械方式破壞組織或細胞結構，從而釋放細胞內組分。樣本制備可使用含有被用于制備供分析用的樣本的緩沖劑、鹽、酶、洗滌劑等的溶液。樣本可從兩個或更多個來源匯集(例如，從兩個或更多個供體匯集的血漿樣本)。樣本可能經過分級分離(例如，樣本如匯集樣本的級分)。樣本可為制造商的用于從中分離組分的血漿池。
[0061]“核酸”是指包含兩種或更多種共價鍵合的由糖部分和含氮雜環堿基或堿基類似物構成的核苷或核苷類似物的多聚化合物。核苷通過磷酸二酯鍵或其他鍵聯連接在一起以形成RNA、DNA、或嵌合DNA-RNA聚合物或寡核苷酸，以及其類似物。核酸“主鏈”可由多種鍵聯構成，(參見例如國際專利申請公開N0.W095/32305)。核酸中的一個或多個殘基的糖部分可為核糖或脫氧核糖，或具有已知取代例如2’ -甲氧基取代和2’ -鹵基取代(例如，2’ -F)的類似化合物。核酸中的一個或多個殘基的含氮堿基可為常規堿基(A、G、C、T、U)、其類似物(參見例如 The Biochemistry of the Nucleic Acids (《核酸的生物化學》)5_36, Adams等人編，第 11 版，1992 ;Abraham 等人,2007, BioTechniques (《生物技術》)43:617-24),其包括嘌呤或嘧啶堿基的衍生物(參見例如美國專利N0.5，378，825、N0.6，949，367以及國際專利申請公開N0.W093/13121)，或“無堿基”，其中核苷單元缺乏含氮堿基(參見例如美國專利N0.5，585，481)。核酸可包括一個或多個“鎖定核酸”(LNA)殘基(Vester等人，Biochemistry (《生物化學》)43:13233-41，2004)。核酸可包括3’端二脫氧核苷酸以阻止另外的核苷酸添加至該核酸中。用于體外制備核酸的合成方法在本領域中是眾所周知的，但可使用常規技術從天然來源純化核酸。寡聚物的主鏈可影響雜交復合體(例如，捕集寡聚物與其靶核酸之間形成的)的穩定性。此類實施例包括肽鍵、2’-0-甲氧基鍵聯以及糖-磷酸二酯型鍵聯。肽核酸有利于與RNA形成雜交復合體。具有2’-甲氧基取代的RNA基團或2’ -氟取代的RNA的寡聚物可具有相對于標準DNA或RNA增強的雜交復合體穩定性并且優選與互補2’-OH RNA形成雜交復合體。接合兩個糖基的鍵聯可通過影響總電荷或電荷密度、或通過影響空間相互作用來影響雜交復合體穩定性(例如，大體積的鍵聯可降低雜交復合體穩定性)。優選的鍵聯包括具有中性基團(例如，甲基膦酸酯基)或帶電荷基團(例如，硫代膦酸酯基)以影響復合體穩定性的那些。
[0062]如本文所用的術語“多核苷酸”表示核酸鏈。在本申請通篇中，核酸是以5’端至3’端指示。
[0063]如本文所用的“核苷酸”為由磷酸酯基、5-碳糖以及含氮堿基組成的核酸的亞單元。RNA中存在的5-碳糖為核糖。在DNA中，5-碳糖為2’-脫氧核糖。該術語還包括此類亞單元的類似物，例如在核糖的2’位置的甲氧基(2’-O-Me)。如本文所用，含有“T”殘基的甲氧基寡核苷酸在核糖部分的2’位置具有甲氧基，并且在核苷酸的堿基位置具有尿嘧啶。
[0064]如本文所用的“非核苷酸單元”為未顯著地參與聚合物的雜交的單元。此類單元不應例如參與與核苷酸的任何顯著氫鍵鍵合，并且將排除具有五種核苷酸堿基或它們的類似物中的一種作為組分的單元。
[0065]可互換的術語“寡聚物”、“寡聚體”以及“寡核苷酸”是指具有從1，OOOnt到少至5nt的連續核苷酸殘基(nt)長度的多核苷酸。應理解，從1000到少至5的范圍為包涵性范圍，因此1000nt、5nt以及其間每一整數個nt都包括在該范圍內。寡核苷酸可從天然存在的來源純化或可使用多種眾所周知的酶促或化學方法中的任一者合成。術語寡核苷酸不表示試劑的任何特定功能；而是，其一般用于涵蓋本文所述的所有此類試劑。
[0066]所謂“擴增寡核苷酸”或“擴增寡聚物”意指至少其3’端與靶核酸互補并且與靶核酸或其互補序列雜交并參與核酸擴增的寡核苷酸。擴增寡聚物的例子包括引物和啟動子引物。擴增寡核苷酸優選含有至少10個連續堿基，并且更優選至少約12個連續堿基但少于約70個堿基，其在標準雜交條件下與靶核酸序列的區域特異性雜交。與靶序列雜交的連續堿基與擴增寡核苷酸所雜交的序列至少約80%、優選至少約90%并且更優選約100%互補。至少約X%是指從X%到100%的所有整數和分數的全部范圍。擴增寡核苷酸任選可包括被修飾的核苷酸。
[0067]擴增寡聚物可被稱為“引物”或“啟動子引物”。“引物”是指與模板核酸雜交并具有可在已知聚合反應中延伸的3’端的寡核苷酸。該引物的5’區域可與靶核酸是非互補的，例如，5’非互補區域可包括啟動子序列并且該寡聚物被稱為“啟動子引物”或其可包括標簽序列，或其可包括接頭序列(adapter sequence)。如本文所用，“啟動子”為被DNA依賴性RNA聚合酶(“轉錄酶”)識別為結合至核酸并在特定位點開始RNA轉錄的信號的特定核酸序列。此外，啟動子引物可包含封端的3’端以防止它們被用作引物，并且在這些情況下，擴增寡聚物被稱為啟動子提供者。在一些實施例中，封端部分替代寡聚物的3’ OH以防止寡聚物在擴增反應中進行酶介導的延伸。在可選擇的實施例中，封端部分可能在3’端的五種殘基內并且足夠大以限制聚合酶與寡聚物的結合。在其他實施例中，封端部分共價連接至寡聚物的3’端。可使用許多不同的化學基團對寡聚物的3’端進行封端，包括但不限于烷基、非核苷酸接頭、燒烴-二醇二脫氧核苷酸殘基以及蟲草素(cordycepin)。本領域技術人員應進一步了解，可充當引物的任何寡聚物(即，與靶序列特異性雜交并具有可利用聚合酶延伸的3’端的擴增寡核苷酸)可被修飾以包括5’啟動子序列，并且因此充當啟動子引物。類似地，任何啟動子引物可通過去除啟動子序列或在無啟動子序列下合成來修飾并充當引物。
[0068]本文所用的“靶核酸”為包含待擴增的“靶序列”的核酸。靶核酸可為如本文所述的DNA或RNA，并且可為單鏈或雙鏈。除靶序列之外，靶核酸還可包括其他序列，其可能未被擴增。靶核酸包括基因組核酸、基因產物(例如，mRNA)以及其擴增產物。本文的靶核酸為人細小病毒核酸和HAV核酸。
[0069]“分離的”意指含有靶核酸的樣本是從其天然環境中提取的，但該術語并不意味著任何程度的純化。
[0070]本文所用的術語“靶序列”是指待擴增和/或檢測的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在擴增過程期間與寡核苷酸(例如，引導性寡核苷酸和/或啟動子寡核苷酸)復合的復合序列。當靶核酸最初為單鏈時，術語“靶序列”還將指與靶核酸中存在的“靶序列”互補的序列。當靶核酸最初為雙鏈時，術語“靶序列”是指有義(+)和反義(_)鏈。
[0071]“靶標結合序列”在本文用于指被構造用于與靶核酸序列雜交的寡聚物的部分。優選地，靶標結合序列被構造用于與靶核酸序列特異性雜交。靶標結合序列可與它們被構造用于進行雜交的靶序列的部分100%互補；但未必如此。靶標結合序列還可以包括相對于靶序列插入、缺失和/或取代的核苷酸殘基。可能出現靶標結合序列與靶序列的互補性小于100%，例如，當靶核酸為一個物種內的多個菌株時，例如被構造用于與人細小病毒的不同菌株和基因型雜交的寡聚物將出現這種情形。應理解，構造靶標結合序列以與靶核酸具有小于100%互補性存在其他原因。[0072]本文關于人細小病毒核酸的區域所用的術語“靶向一個序列”是指借此使寡核苷酸與靶序列以允許如本文所述的擴增和檢測的方式雜交的過程。在一個實施例中，寡核苷酸與所靶向的人細小病毒核酸序列互補并且不含錯配。在另一個實施例中，寡核苷酸與所靶向的人細小病毒核酸序列互補但含有I個、或2個、或3個、或4個、或5個錯配。優選地，與人細小病毒核酸序列雜交的寡核苷酸包括至少10個至多達50個與靶序列互補的核苷酸。應理解，至少10個并且多達50個為包涵性范圍，因此10、50以及其間每一個整數都被公開。優選地，寡聚物與靶序列特異性雜交。本文所用的術語“被構造用于靶向一個序列”意指擴增寡核苷酸的靶標雜交區域被設計成具有可與所提及的人細小病毒區域或所提及的HAV區域特異性雜交的多核苷酸序列。此種擴增寡核苷酸不限于只靶向所述序列，而是可用作試劑盒或方法中的組合物，用于靶向如本文所述的人細小病毒靶核酸(包括基因型1、2和/或3)或HAV靶核酸。術語“被構造為”表示擴增寡核苷酸靶標雜交序列的多核苷酸序列構造的實際布置。
[0073]本文所用的術語“區域”是指核酸的一部分，其中所述部分小于完整核酸。例如，當所提到的核酸為寡核苷酸啟動子引物時，術語“區域”可用于指完整寡核苷酸的較小啟動子部分。類似地，并且也只作為例子，當核酸為人細小病毒基因組時，術語“區域”可用于指核酸的較小區域，其中該較小區域被一種或多種本發明的寡核苷酸靶向。寡核苷酸的靶標結合序列可與區域的全部或一部分雜交。與區域的一部分雜交的靶標結合序列為在所提及的區域內雜交的靶標結合序列。作為術語“區域”的使用的另一個非限制性例子，當所提到的核酸為擴增子時，術語“區域”可用于指鑒定用于通過探針的靶標結合序列雜交的較小核苷酸序列。
[0074]“擴增”是指用于獲得靶核酸序列或其互補序列或其片段的多個拷貝的任何已知程序，并且優選的實施例通過使用序列特異性方法來特異性擴增靶標。已知的擴增方法包括例如轉錄介導的擴增、復制酶介導的擴增、聚合酶鏈反應(PCR)擴增(包括RT-PCR)、連接酶鏈反應(LCR)擴增以及鏈置換擴增(SDA)。復制酶介導的擴增使用自我復制RNA分子，以及復制酶如QB-復制酶(例如，參見Kramer等人的美國專利N0.4，786，600和PCTN0.W090/14439)。PCR擴增為眾所周知的并且使用DNA聚合酶、序列特異性引物以及熱循環來合成多個拷貝的兩個互補鏈的DNA或cDNA (例如，頒給Mullis等人的美國專利N0.4，683，195、N0.4，683，202 和 N0.4，800，159，以及 Methods in Enzymology (《酶學方法》)，1987，第155卷:335-350)。LCR擴增使用至少四個單獨的寡核苷酸通過使用多個循環的雜交、連接以及變性來擴增靶標及其互補鏈(歐洲專利N0.0320308)。通過使用含有限制性內切酶(其切斷包括靶序列的半修飾DNA雙鏈的一條鏈)的識別位點的引物，接著在一系列引物延伸和鏈置換步驟中擴增來進行SDA擴增(頒給Walker等人的美國專利N0.5，422，252)。如下文所說明，優選的實施例使用轉錄相關的擴增。本領域技術人員應顯而易見，本發明的方法步驟和擴增寡核苷酸可容易適合于多種基于利用聚合酶活性的引物延伸的核酸擴增程序。
[0075]靶序列的“片段”或“部分”的擴增是指包含小于完整靶區域核酸序列的擴增核酸的產生。此類片段可通過例如使用與靶序列雜交并從靶序列中的內部位置起始聚合的擴增寡核苷酸來擴增靶序列的一部分而產生。
[0076]所謂“轉錄介導的擴增”(TM)或“轉錄相關的擴增”意指使用RNA聚合酶從核酸模板產生多個RNA轉錄物的核酸擴增。轉錄相關的擴增一般使用RNA聚合酶和DNA聚合酶活性、脫氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸以及啟動子引物，并且任選可包括一個或多個其他擴增寡核苷酸，包括“輔助”寡聚物。轉錄相關的擴增的變化在本領域中是眾所周知的并且在他處詳細地描述(參見頒給Kacian等人的美國專利N0.5，399，491和N0.5，554，516、頒給Burg等人的美國專利N0.5，437，990、頒給Malek等人的美國專利N0.5，130, 238、頒給Urdea等人的美國專利N0.4，868，105 和N0.5，124，246、Kacian等人的PCT N0.W093/2246UGingeras 等人的PCT N0.TO88/01302 和TO88/10315、McDonough等人的PCT N0.W094/03472以及 Ryder 等人的 PCT N0.W095/03430)。美國專利 N0.5，399，491 和 N0.5，554，516 的程序是優選的擴增實施例。如本文所用，術語“實時TMA”是指通過實時檢測手段監測的靶核酸的單引物轉錄介導的擴增(“TM”)。
[0077]所謂“探針”、“檢測探針”或“檢測探針寡聚物”其意指在允許雜交的條件下與核酸中、優選擴增核酸中的靶序列特異性雜交，從而允許檢測該靶標或該擴增核酸的核酸寡聚物。檢測可為直接的(即，由直接與序列雜交的探針產生)或間接的(即，由與連接探針與靶標的中間分子結構雜交的探針產生)。探針的“靶標” 一般是指通過標準氫鍵鍵合(即，堿基配對)與探針寡聚物的至少一部分特異性雜交的擴增核酸序列內的序列或其子集。探針可包含靶特異性序列和有助于探針的三維構象的其他序列(例如，頒給Lizardi等人的美國專利 N0.5，118，801 和 N0.5，312，728 以及頒給 Becker 等人的美國專利 N0.6，361，945B1)。探針可為DNA、RNA、其類似物或它們的組合并且它們可能被標記或未被標記。如果探針序列和它們的靶序列被構造為允許探針寡聚物和不與探針的靶特異性序列完全互補的靶序列在適當的雜交條件下穩定雜交的話，則所述探針序列和它們的靶序列充分互補。
[0078] “冷探針”是指相比于檢測探針寡聚物具有實質上類似或相同的寡核苷酸序列的寡核苷酸。冷探針與檢測探針之間的主要差異在于冷探針缺乏可檢測標記，而檢測探針寡聚物具有可檢測標記。冷探針寡聚物被用于在檢測反應中與檢測探針寡聚物競爭，從而降低在檢測步驟中接收到的總體信號。檢測信號經常因多路擴增和檢測測定法的一個靶標而降低，其中一個或多個、但非全部的靶核酸相比于多路測定法中的一個或多個其他成員具有穩健的擴增動力學。將冷探針用于在較強擴增上與檢測探針競爭，因此在某種意義上使穩健的擴增“失調”。因而使失調的擴增進入與多路測定法中較弱的擴增種類更相當的范圍內。類似地，假靶標為應用于多路擴增反應以使較強擴增種類失調從而使其反應動力學更類似于較弱擴增種類的反應動力學的核酸。假靶標為通常含有較強擴增種類的引物的結合位點，但其間幾乎沒有另外的序列的核酸。因而使引物從產生較強擴增種類的擴增產物分流。
[0079]所謂“互補的”意指兩個單鏈核酸的相似區域的核苷酸序列或同一單鏈核酸的不同區域具有允許單鏈區域在嚴格的雜交或擴增條件下在穩定的雙鏈氫鍵鍵合的區域中雜交在一起的核苷酸堿基組成。彼此雜交的序列可通過標準的核酸堿基配對(例如G:C、A:T或A:U配對)與預期靶序列完全互補或部分互補。所謂“充分互補”意指能夠通過一系列互補堿基之間的氫鍵鍵合與另一個序列雜交的連續序列，其可通過標準的堿基配對在序列中的每一位置互補或可含有一個或多個非互補殘基，包括無堿基殘基。充分互補的連續序列通常與寡聚物預期特異性雜交的序列至少80%、或至少90%互補(包括至多100%的所有整數和有理數并包括100%)。“充分互補”的序列允許核酸寡聚物與它的靶序列在適當的雜交條件下穩定的雜交，即使這些序列并不完全互補。當一個單鏈區域的核苷酸的連續序列能夠與另一個單鏈區域的核苷酸的類似序列形成一系列“典型的”氫鍵鍵合的堿基對，使得A與U或T配對并且C與G配對時，所述核苷酸序列為“完全”互補的，(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning, ALaboratory Manual (《分子克隆:實驗室手冊》)，第2版(紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY), 1989)的 § § 1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51 以及 11.47-11.57，特別是§ § 9.50-9.51,11.12-11.13,11.45-11.47 以及 11.55-11.57)。
[0080]所謂“優先雜交”或“特異性雜交”意指在嚴格的雜交測定法條件下，探針與它們的靶序列或其復制物雜交，以形成穩定的探針:靶標雜交體，而同時穩定的探針:非靶標雜交體的形成降至最少。因此，探針與靶序列或其復制物雜交的程度比其與非靶序列雜交的程度充分更大，以使得本領域的普通技術人員能夠精確地檢測在擴增期間形成的靶序列的RNA復制物或互補DNA(cDNA)。適當的雜交條件在本領域中是眾所周知的，可根據序列組成進行預測，或可以通過使用常規測試方法來確定(例如，Sambrook等人，MolecularCloning, A Laboratory Manual (《分子克隆:實驗室手冊》)，第2版(紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 1989)的 § § 1.90-1.91,7.37-7.57,9.47-9.51 以及 11.47-11.57，特別是 § §9.50-9.51、11.12-11.13,11.45-11.47 以及 11.55-11.57)。
[0081 ] 所謂“捕集寡核苷酸”或“捕集寡聚物”或“捕集探針”意指與待捕集的靶核酸特異性雜交并提供一 種用于從其他樣本組分分離和/或濃縮該靶標的手段的核酸寡聚物。捕集寡聚物的實施例包括兩個結合區域:靶標結合區域和固定化探針結合區域，由此該捕集寡聚物可形成雜交復合體，其中捕集寡聚物的靶標結合區域結合于靶序列并且固定化探針結合區域結合于固定在固體載體上的寡聚物(參見Weisburg等人的美國專利N0.6，110, 678和6，280，952)。盡管靶標結合區域和固定化探針結合區域通常在同一捕集寡聚物上，但這兩個功能性區域可存在于通過一個或多個接頭接合在一起的兩種不同寡聚物上。例如，固定化探針結合區域可存在于第一寡聚物上，靶標結合區域可存在于第二寡聚物上，并且這兩種寡聚物與作為與該第一寡聚物和該第二寡聚物的序列特異性雜交的接頭的第三寡聚物通過氫鍵鍵合而接合。捕集探針的靶標結合區域還可被稱為捕集探針的靶標特異性部分并且固定化探針結合區域可被稱為尾部分。尾部分的實施例包括均聚物(例如，聚dT或聚dA)或非均聚物(例如，Tch3A15,),優選連接至寡聚物的靶標特異性部分的3’端。
[0082]所謂“固定化探針”或“固定化寡聚物”意指將捕集寡聚物直接或間接接合至固定化載體的核酸寡聚物。接合至固體載體的固定化探針有助于樣本中被結合的靶序列與未結合的物質分離。可使用任何已知的固體載體，例如于溶液中的基質和粒子，例如，硝酸纖維素、尼龍、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯以及金屬粒子，優選磁性吸引粒子。優選的載體為單分散順磁球體(例如，均一尺寸±5%)，以提供一致的結果，固定化探針直接地(例如，通過直接共價鍵聯、螯合或離子相互作用)或間接地(例如，通過一個或多個接頭)接合至所述載體，其中該鍵聯或相互作用在核酸雜交條件期間是穩定的。
[0083]“樣本制備”是指對于樣本中存在的人細小病毒核酸的后續擴增和/或檢測而處理樣本的任何步驟或方法。樣本可為多種組分的復雜混合物，其中靶核酸為少數組分。樣本制備可包括從較大樣本體積濃縮成分(例如微生物或核酸)的任何已知方法，例如通過從較大體積樣本過濾氣載或水載的粒子或通過使用標準的微生物學方法從樣本分離微生物。樣本制備可包括對細胞組分的物理破壞和/或化學溶解以使細胞內組分釋放進實質上的水相或有機相中并移除碎片，例如通過使用過濾、離心或吸附。樣本制備可包括使用選擇性或非特異性捕集靶核酸并將其與其他樣本成分分離的核酸寡核苷酸(例如，如美國專利6，110，678 和 PCT 公開 N0.W02008/016988 中所述)。
[0084]所謂“分離”或“純化”意指將生物樣本的一種或多種組分從樣本的至少一種其他組分中移出。樣本組分一般包括核酸、鹽、蛋白質、碳水化合物以及脂質的水溶液。分離或純化核酸的步驟可除去樣本中至少約70%、優選至少約90%并且更優選至少約95%的其他組分。
[0085]所謂“標記”意指可以被檢測或可以產生可檢測信號的分子部分或化合物。標記被直接或間接接合至核酸探針。直接標記利用將標記連接至探針的鍵或相互作用，包括共價鍵或非共價相互作用，例如氫鍵、疏水和離子相互作用，或通過形成螯合物或配位絡合物。間接標記利用橋聯部分或“接頭”(例如，寡核苷酸或抗體)，來連接標記與探針。可使用接頭來擴增可檢測信號。標記為任何已知的可檢測部分，例如，放射性核素、配體(例如，生物素、抗生物素蛋白)、酶或酶底物、反應性基團或發色團，例如染料或可檢測粒子(例如，乳膠小珠或金屬粒子)、發光化合物(例如，生物發光、磷光或化學發光標記)以及突光化合物。優選地，標記探針上的標記是在均相反應中可檢測的(即，在混合物中，結合的標記探針與未結合的標記探針相比展現可檢測的變化，例如穩定性或差示降解)。用于均相測定法中的標記的一個實施例為化學發光化合物(例如，詳細描述于頒給Woodhead等人的美國專利N0.5，656，207、頒給Nelson等人的美國專利N0.5，658，737以及頒給Arnold, Jr.，等人的美國專利N0.5，639，604中)。優選的化學發光標記為吖啶酯(AE)化合物，例如標準的AE或其衍生物(如萘基-AEjM1-AE、1-或3-甲基-AE、2，7- 二甲基_AE、4，5- 二甲基-AE、鄰位-二溴-AEjM1- 二甲基-AE、間位-二甲基-AEjM1-甲氧基-AEjM1-甲氧基(桂皮酰基)-AEjM1-甲基-AEjM1-氟-AE、1-或3-甲基-鄰位-氟-AE、1-或3-甲基-間位-二氟-AE和2-甲基-AE)。將標記連接至核酸以及檢測標記的合成和方法在本領域中是眾所周知的(例如，Sambrook 等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual (《分子克隆:實驗室手冊》)，第2版(紐約冷泉港的冷泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Habor, NY)，1989),第 10 章；頒給 Kourilsky 等人的美國專利N0.4，581，333、頒給Nelson等人的美國專利N0.5，658，737、頒給Woodhead等人的美國專利N0.5, 656, 207、頒給Hogan等人的美國專利N0.5, 547, 842、頒給Arnold, Jr.等人的美國專利N0.5，283，174以及Becker等人的歐洲專利公開N0.0747706)。用于均相測定法中的標記的另一個實施例為連接至探針的熒光化合物，其中當該探針未與其靶標雜交時淬滅劑化合物在官能鄰近于該突光標記(例如，頒給Lizardi等人的美國專利N0.5，118，801和N0.5，312，728以及頒給Becker等人的美國專利N0.6，361，945B1)。
[0086]“均相可檢測標記”是指其存在可基于被標記的探針是否與靶序列雜交而以均相方式檢測(即，可以在未物理去除未雜交的標記或被標記的探針的情況下被檢測)的標記。均相可檢測標記以及檢測它們的方法的實施例已經被描述(頒給Arnold等人的美國專利N0.5，283，174、頒給Woodhead等人的美國專利N0.5，656，207、頒給Nelson等人的美國專利N0.5，658，737、頒給Lizardi等人的美國專利N0.5，118，801和N0.5，312，728以及頒給Becker 等人的美國專利 N0.6，361，945B1)。
[0087]所謂“基本上由…組成”意指可包括不會在實質上改變本發明的基本和新穎特性的另外的組分和方法步驟。此類特征包括不會對本文所述的檢測甲型肝炎病毒和/或細小病毒類型1、2和3的核酸序列的要求權利保護的組分或方法步驟的特性具有實質影響的鹽、緩沖劑、核酸寡聚物以及類似的生物化學試劑。類似地，可包括不會對測定法的基本性質具有實質影響的另外的方法步驟。
[0088]如本文所用，具有“包含選自一組特定序列的序列”或“由選自一組特定序列的序列組成”或“基本上由選自一組特定序列的序列組成”的核酸序列的寡核苷酸意指作為基本和新穎的特性，寡核苷酸能夠在嚴格的雜交條件下與具有所列群組的核酸序列中的一者的精確互補序列的核酸穩定雜交。精確的互補序列包括相應的DNA或RNA序列。
[0089]如本文所用，“對應于”指定的核酸序列的寡核苷酸意指所提到的寡核苷酸與參考核酸序列充分類似以使得該寡核苷酸具有與該參考核酸序列類似的雜交特性，因而其將在嚴格的雜交條件下與相同的靶核酸序列雜交。本領域技術人員應理解“相應的寡核苷酸”可與所提到的序列有所變化并且仍與相同的靶核酸序列雜交。還應理解，對應于第二核酸的第一核酸包括其互補序列并且包括其RNA和DNA。這種與核酸相比的變化可以探針或引物與它的靶序列之間的序列內相同堿基百分比或完全互補堿基百分比來說明。因此，如果這些堿基同一性或互補性百分比為100%至約80%，則寡核苷酸“對應于”參考核酸序列。在優選的實施例中，百分比為100%至約85%。在更優選的實施例中，該百分比可以為100%至約90% ;在其他優選的實施例中，該百分比為100%至約95%。類似地，核酸或擴增核酸的區域在本文可被稱為對應于參考核酸序列。本領域技術人員應理解，在不同的互補性百分比下可能需要對雜交條件的不同修改以允許與特定靶序列雜交而不會產生不可接受水平的非特異性雜交。
[0090]本文所用的術語“擴增子”或術語“擴增產物”是指在擴增程序期間產生的與靶序列內所含的序列互補或同源的核酸分子。擴增子的這種互補或同源序列有時在本文被稱為“靶特異性序列”。擴增子可為雙鏈或單鏈并且可包括DNA、RNA或這二者。例如，DNA依賴性RNA聚合酶在轉錄介導的擴增程序期間從雙鏈DNA轉錄單鏈擴增子。這些單鏈擴增子為RNA擴增子并且可為雙鏈復合體的任一條鏈；這取決于如何設計擴增寡聚物。因此，擴增子可為單鏈RNA。RNA依賴性DNA聚合酶合成與RNA模板互補的DNA鏈。因此，擴增子可為雙鏈DNA和RNA雜交體。RNA依賴性DNA聚合酶常常包括RNA酶活性，或者與降解RNA鏈的RNA酶結合使用。因此，擴增子可為單鏈DNA。RNA依賴性DNA聚合酶和DNA依賴性DNA聚合酶從DNA模板合成互補的DNA鏈。因此，擴增子可為雙鏈DNA。RNA依賴性RNA聚合酶從RNA模板合成RNA。因此，擴增子可為雙鏈RNA。DNA依賴性RNA聚合酶從雙鏈DNA模板合成RNA，也稱為轉錄。因此，擴增子可為單鏈RNA。擴增子和用于產生擴增子的方法為本領域技術人員已知的。本文為方便起見，RNA的單鏈或DNA的單鏈可表示由本發明的擴增寡聚物組合所產生的擴增子。此種陳述并不意欲將擴增子局限為所示的陳述。擁有本公開內容的熟練技術人員將使用擴增寡聚物和聚合酶來產生眾多類型的擴增子中的任一種；全部都在本發明的精神內。
[0091]本文所用的“非靶特異性序列”是指寡聚物序列的區域，其中所述區域在標準的雜交條件下不與靶序列穩定地雜交。具有非靶特異性序列的寡聚物包括但不限于啟動子引物和分子信標。擴增寡聚物可含有不與靶標或模板序列互補的序列；例如，引物的5’區域可包括與靶核酸不互補的啟動子序列(稱為“啟動子引物”)。本領域技術人員應理解，充當引物的擴增寡聚物可被修飾以包括5’啟動子序列，并且因此充當啟動子引物。類似地，啟動子引物可通過去除啟動子序列或在啟動子序列不存在下合成來進行修飾并且仍充當引物。3’封端的擴 增寡聚物可提供啟動子序列并且充當聚合模板(稱作“啟動子提供者”)。因此，由擴增寡聚物成員如啟動子引物所產生的擴增子將包含靶特異性序列和非靶特異性序列。
[0092]如本文所用，術語“相對光單位”(“RLU”)為指示樣本在給定的波長或波長帶下發射的光子相對數目的任意測量單位。RLU隨著測量所用的檢測手段的特性而變化。
[0093]在擴增和/或檢測系統的上下文中的術語“特異性”在本文用于指描述系統取決于序列和測定法條件來區分靶標與非靶序列的能力的系統特性。就核酸擴增來說，特異性一般是指所產生的特異性擴增子的數目與副產物數目的比率(例如，信噪比)。就檢測來說，特異性一般是指由靶核酸產生的信號與由非靶核酸產生的信號的比率。
[0094]術語“靈敏度”在本文用于指核酸擴增反應可以被檢測或定量的精確度。擴增反應的靈敏度一般為可以在擴增系統中可靠地檢測的靶核酸的最小拷貝數目的量度，并且將取決于例如所使用的檢測測定法以及擴增反應的特異性，例如，特異性擴增子與副產物的比率。
[0095]本發明的測定法檢測生物樣本(例如，血液、血清、血漿、痰液、支氣管灌洗液)中存在的人細小病毒。在一個實施例中，該測定法檢測來自單獨的供體或來自供體樣本的匯集收集物的血漿樣本中的細小病毒和/或HAV靶核酸。為了制備血漿標本，使用標準方法離心全血樣本，并且在測試之前將血漿在4°C或_20°C下儲存。為了裂解標本中的病毒粒子，將含有洗滌劑的裂解試劑與標本混合以從病毒粒子中釋放靶核酸。標本處理可通過在裂解試劑中包括捕集寡聚物和固定化寡聚物而將病毒裂解與病毒靶核酸的純化組合在一起。因而該方法包括靶標捕集步驟，其中將靶核酸與捕集寡聚物特異性雜交，然后與固定化寡聚物雜交，并且每一結合復合體(即，固定化寡聚物、捕集寡聚物以及靶核酸)實質上與其他樣本組分分離。用含細小病毒結合復合體洗滌固體載體可將殘余樣本組分洗出。因此，靶核酸與其他樣本組分分離并于濃縮于結合復合體中，而未從固體載體中釋放出結合的靶核酸。
[0096]典型的樣本處理涉及如下步驟(詳細描述于美國專利N0.6，110，678、國際申請公開N0.W02008/016988以及美國專利申請N0.2006/0068417中)。體液(例如，0.5ml血漿)中的病毒粒子在60°C下與靶標捕集試劑(790mM HEPES、680mM LiOH、10%十二烷基硫酸鋰(LLS)、230mM琥珀酸鹽、至少一種7pm/ml的捕集探針以及100 y g/ml結合于磁性粒子的聚dT14 (SERADYN?，印第安納州印第安納波利斯(Indianapolis，IN)))接觸時溶解。捕集寡聚物包含5’靶標結合區域序列。捕集寡聚物還包含與連接至固體載體的互補寡聚物(例如，連接至固體載體的寡聚dT以及捕集寡聚物的寡聚dA尾部分)雜交的均聚物或非均聚物3’尾序列。通過在第一溫度(60°C)下溫育混合物而在這種反應混合物中發生靶標捕集雜交，使得捕集寡聚物特異性結合至靶核酸中的其互補靶序列。然后，將混合物冷卻至40°C或更低溫度(例如，室溫)以使得捕集寡聚物的3’尾與粒子上的其互補寡聚物雜交。在第二次雜交之后，例如通過使用重力、離心或磁性分離來處理混合物以將固體載體和其結合的核酸復合體與其他樣本組分分離。通常，分離使用含有磁體的架子將具有結合的核酸復合體的磁性粒子吸引到管側。然后通過將磁性粒子懸浮于洗滌緩沖液中，將粒子分離至管側并且去除上清液，來去除上清液并且用Iml洗滌緩沖液(IOmM HEPES、6.5mM NaOHUmMEDTA、0.3%(v/v)無水乙醇、0.02%(w/v)對羥基苯甲酸甲酯、0.01%(w/v)對羥基苯甲酸丙酯、150mM NaCU0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，pH7.5)來洗滌粒子上的結合復合體。
[0097]在樣本制備之后，通過使用限定通過體外酶介導的核酸合成而擴增的區域的5’端和3’端的擴增寡聚物來實現甲型肝炎病毒和/或細小病毒靶核酸的擴增以產生擴增子。一個實施例使用轉錄介導的擴增(TMA)方法，基本上如美國專利N0.5，399，491和N0.5，554,516中所述，其為產生大量的可檢測的擴增產物(RNA轉錄物)的實質上等溫系統。該方法的優選實施例使用擴增寡聚物的混合物，其中將至少一種啟動子引物與至少一種引物組合。
[0098]擴增寡聚物組合的一個優選實施例包含引物寡聚物成員和基于啟動子的寡聚物成員。優選地，基于啟動子的擴增寡聚物為包含5’RNA聚合酶啟動子序列和3’靶標結合序列的啟動子引物。RNA聚合酶啟動子序列在本領域中已知包括但不限于sp6RNA聚合酶啟動子序列、T3RNA聚合酶啟動子序列以及I7RNA聚合酶啟動子序列。在優選的實施例中，啟動子引物包含5’ T7RNA聚合酶啟動子序列和3’靶標結合序列。最優選地，5’ T7RNA聚合酶啟動子序列為SEQ ID NO: 196。
[0099]在一個優選的實施例中，基于啟動子的擴增寡聚物的3’靶標結合序列的長度為約10至約40個核酸堿基并且包含被構造為與人細小病毒核酸或甲型肝炎病毒靶核酸的靶序列內的區域特異性雜交的核酸序列。其他優選的啟動子引物包含內部標簽序列，其被啟動子序列側接于它的5’端并且被靶標結合序列側接于它的3’端。內部標簽序列在本文中也被稱為插入序列。內部標簽序列為優選不與靶核酸穩定雜交或干擾靶標結合序列與靶核酸雜交的任何核酸序列。此外，內部標簽序列優選具有足夠長度和組成以使得一旦摻入擴增產物中，標簽特異性擴增寡聚物就可以用于參與后續回合以產生擴增產物。一個優選的標簽序列的長度為約10個核苷酸至約50個核苷酸。此外，認識到插入序列可包括任何本發明的基于啟動子的寡聚物成員。
[0100]在一個優選實施例中，擴增寡聚物組合包含至少一個引物擴增寡聚物成員。優選的引物擴增寡聚物具有約10個核酸堿基至約50個核酸堿基的長度，并且具有被構造為當用于本發明的擴增反應中時與甲型肝炎病毒或人細小病毒類型1、2和3特異性雜交以產生可檢測擴增產物的核苷酸組成。一個優選的引物寡聚物的長度為約10至約50個核酸堿基。本發明的引物寡聚物成員描述于本文中。這些描述不需在此重復。其他優選的引物寡聚物成員包含5’標簽序列。5’標簽序列為優選不與靶核酸穩定雜交或干擾靶標結合序列與靶核酸雜交的任何核酸序列。此外，5’標簽序列優選具有足夠長度和組成以使得一旦摻入擴增產物中，標簽特異性擴增寡聚物就可以用于參與后續回合以產生擴增產物。一個優選的5’標簽序列的長度為約10個核苷酸至約50個核苷酸。另一個優選的標簽序列的長度為約12個核苷酸。此外，認識到5’標簽序列可包括任何本發明的引物寡聚物成員。[0101]通過轉錄介導的擴增來擴增靶核酸可從靶核酸的單一拷貝產生許多核酸鏈，因而允許通過檢測與擴增產物的序列雜交的探針來檢測靶標。通常，反應混合物包括靶核酸和至少兩種擴增寡聚物，所述擴增寡聚物包含至少一種引物、至少一種啟動子引物、逆轉錄酶和RNA聚合酶活性、核酸合成底物(脫氧核糖核苷三磷酸和核糖核苷三磷酸)以及適當的含鹽和緩沖劑的溶液以從核酸模板產生多個RNA轉錄物。簡而言之，啟動子引物與靶序列的一部分特異性雜交。包括RNA酶活性的逆轉錄酶通過啟動子引物的3’延伸產生第一鏈cDNA。該cDNA與啟動子引物下游的引物雜交并且使用逆轉錄酶從引物的3’端合成新的DNA鏈以產生在一端具有功能性啟動子序列的dsDNA。RNA聚合酶結合至dsDNA的啟動子序列處并轉錄多個轉錄物或擴增子。這些擴增子進一步用于擴增過程中，用作新一輪復制的模板，以最終從初始靶序列產生大量的單鏈擴增核酸(例如，從單一模板合成的100至3，000個拷貝的RNA)。該過程使用基本上恒定的反應條件(即，實質上等溫)。典型的IOOiU擴增反應物使用 75 ii I 的擴增試劑混合物(11.6mM Tris 堿、15.0mM Tris_HCl、22.7mM MgCl2,
23.3mM KC1、3.33%甘油、0.05mM醋酸鋅(二水合物)、各0.665mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、各5.32mM的ATP、CTP、GTP和UTP，pH7)和25 y I酶試劑混合物(700U的T7RNA聚合酶、1400U的來自莫羅尼鼠科白血病病毒的逆轉錄酶(MMLV-RT)、16mM HEPES (游離酸，二水合物)、70mMN-乙酰基-L-半胱氨酸、3mM EDTA、0.05%(w/v)疊氮化鈉、20mM Tris堿、50mM KCl,20%(v/v)無水甘油、10%(v/v) TRI「ON? X-102 以及 150mM 海藻糖(二水合物)，pH7)，優選與保留在固體粒子上的被捕集靶的核酸混合。對于酶促活性，IU的I7RNA聚合酶在37°C下使用含17啟動子的DNA模板在I小時內將lnmol ATP摻入RNA中，而IU的MMLV-RT在37°C下使用200-400 u mo I寡聚dT引導的聚(A)作為模板在10分鐘內將lnmol dTTP摻入DNA中。擴增寡聚物在約5-20皮摩爾/反應、或更通常約7-15皮摩爾/反應、或更通常約5-15皮摩爾/反應或更通常約5-10皮摩爾/反應的范圍內，這些范圍包括其中所有整數和分數。
[0102]在一個優選的實施例中，使用擴增寡聚物的組合進行TMA反應，其中所述組合包括至少一個啟動子引物寡聚物成員和至少一個引物寡聚物成員，并且其中所述組合被構造用于產生用于檢測甲型肝炎病毒和/或人細小病毒類型1、2和3的擴增產物。在一個特定方面，使用至少一種甲型肝炎病毒非T7擴增寡聚物(SEQ ID NO: 1-11)和至少一種基于甲型肝炎病毒啟動子的擴增寡聚物(SEQ ID NO: 12-28)執行TMA反應。在一個特定方面，使用至少一種細小病毒非I7擴增寡聚物(SEQ ID NO:75-87)和至少一種基于細小病毒啟動子的擴增寡聚物(SEQ ID NO:88-107)執行TMA反應。在一個特定方面，使用至少一種甲型肝炎病毒非n擴增寡聚物(SEQ ID NO: 1-11)和至少一種基于甲型肝炎病毒啟動子的擴增寡聚物(SEQ ID NO: 12-28)執行多路TMA反應。在一個特定方面，使用至少一種細小病毒非17擴增寡聚物(SEQ ID NO:75-87)和至少一種基于細小病毒啟動子的擴增寡聚物(SEQ IDNO: 88-107)執行多路TMA反應。在一個特定方面，使用至少一種細小病毒非17擴增寡聚物(SEQ ID NO:75-87)、至少一種基于細小病毒啟動子的擴增寡聚物(SEQ ID N0:88_107)、至少一種甲型肝炎病毒非17擴增寡聚物(SEQ ID NO: 1-11)以及至少一種基于甲型肝炎病毒啟動子的擴增寡聚物(SEQ ID NO: 12-28)執行多路TMA反應。在該實施例的一個方面，擴增寡聚物組合包含至少一種包含5’啟動子序列、內部標簽序列以及3’靶標結合序列的啟動子引物寡聚物成員。在該實施例的一個方面，擴增寡聚物組合包含至少一種包含5’啟動子序列、內部標簽序列以及3’靶標結合序列的啟動子引物寡聚物成員，并且還包括至少一種包含5’啟動子序列和3’靶標結合序列的啟動子引物寡聚物成員。在該實施例的一個方面，擴增寡聚物組合包含至少一種包含5’標簽序列和3’靶標結合序列的引物寡聚物成員。在該實施例的一個方面，擴增寡聚物組合包含至少一種包含5’標簽序列和3’靶標結合序列的引物寡聚物成員，并且還包括至少一種包含3’靶標結合序列的引物寡聚物成員。
[0103]在另一個優選實施例中，利用包含至少一種啟動子引物寡聚物成員和至少一種引物寡聚物成員的擴增寡聚物組合執行TMA反應，其中該組合被構造用于產生用于檢測人細小病毒類型1、2和3的擴增產物，和/或利用包括至少一種啟動子引物寡聚物成員和至少一種引物寡聚物成員的擴增寡聚物組合執行TMA反應，其中該組合被構造用于產生用于檢測甲型肝炎病毒的擴增產物。在一個實施例中，用于細小病毒的TMA反應為定量擴增和檢測反應。在一個實施例中，用于甲型肝炎病毒的TMA反應為定量擴增和檢測反應。在一個實施例中，用于細小病毒的TMA反應和用于甲型肝炎病毒的TMA反應為定量擴增和檢測反應。在一個方面，這些擴增反應為多路擴增反應，并且在使用一個或多個SEQ ID NO:58-74的檢測探針和/或一個或多個SEQ ID NO: 137-169的檢測探針的檢測步驟中執行擴增產物的檢測。在一個方面，擴增 反應為單路擴增反應，并且在使用一個或多個SEQ ID NO:58-74的檢測探針和/或一個或多個SEQ ID NO: 137-169的檢測探針的檢測步驟中執行擴增產物的檢測。
[0104]在擴增反應之后或在擴增反應期間，優選通過與至少一種與擴增序列的一部分特異性雜交的被標記核酸探針雜交，檢測到由甲型肝炎病毒靶核酸和/或由細小病毒靶核酸產生的擴增序列。探針實施例包括具有在約80°C至約85°C范圍內的！?的那些。一些優選的探針實施例包括具有約15至約40個核苷酸的核苷酸長度和作為DNA、RNA或其組合并且被構造用于與甲型肝炎病毒核酸或人細小病毒核酸或擴增核酸的靶序列的全部或一部分區域特異性雜交的核酸序列的寡聚物。本發明的檢測寡聚物還可包含一個或多個LNA殘基。通過檢測可以在均相反應中檢測到的標記來實現探針的檢測。因此，一些優選的實施例還包含使用眾所周知的允許均相檢測的方法用吖啶酯(AE)化合物標記的探針(例如，標記和檢測方法詳細描述于頒給Arnold, Jr.等人的美國專利N0.5, 283, 174、頒給Woodhead等人的美國專利N0.5，656，207以及頒給Nelson等人的美國專利N0.5，658，737中)。化學發光AE化合物通過接頭化合物連接至探針序列(實質上如頒給Arnold，Jr.等人的美國專利N0.5，585，481和N0.5，639，604中所述，例如參見第10列第6行至第11列第3行，以及實例8)。在一個實施例中，被標記的探針寡聚物在核酸主鏈中具有至少一個2’ -0-甲氧基鍵聯。在典型的檢測步驟的一個實施例中，探針試劑包括IOOmM琥珀酸鹽、2%(w/v)LLS、230mMLi0H (一水合物)、15mM2, 2’ - 二硫基二吡啶(ALDRITHIOL-2)、1.2MLiCl、20mMEDTA、20mM EGTA、3%(v/v)無水乙醇，用LiOH達到約pH4.7，并且用于水解未結合探針上的標記的選擇試劑包括600mM硼酸、182mM NaOH、l%(v/v) TRITON" X-1OO0將檢測探針以
每一反應約1E7-5E7相對光單位(RLU)、更通常每一反應約1E7-3E7RLU、更通常每一反應2E7-5E7RLU或更通常每一反應2E7-4E7RLU的范圍添加至檢測反應；其中所述范圍包括其中所有整數和分數。使用光度計(例如，LEADER?450HC+，加利福尼亞州圣地亞哥的基因探針公司(Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA))以 RLU 形式檢測信號。
[0105]為了選擇適用作捕集寡聚物、擴增寡聚物以及檢測探針的DNA序列，通過匹配相同或類似序列的區域來比對可獲自公共訪問數據庫(例如，GenBank)的DNA序列(包括部分或互補序列)并使用眾所周知的分子生物學技術進行比較。盡管通過使用算法可促進序列比較，但本領域技術人員可容易地通過手動和目測執行此類比較。通常，選擇在所比較序列之間含有相對較少變體的序列的部分作為設計本發明中所用的合成寡聚物的基礎。設計寡聚物的其他考慮包括相對CG含量(其影響Tm)和序列內相對不存在所預測的二級結構(其可能形成分子內雜交體)，如通過使用眾所周知的方法所測定。
[0106]在一個實施例中，在單個管中使用0.5至Iml體液(如血漿)樣本進行測定法來以每反應約100至500個拷貝/ml靶標DNA的靈敏度檢測靶核酸。在其他實施例中，該測定法檢測樣本中較高數目的靶核酸，該樣本可為單獨的樣本的匯集樣本。
[0107]除非另外定義，否則本文所用的所有科學和技術術語具有與相關領域的技術人員所 通常理解相同的含義。本文所用的許多術語的一般定義提供于Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology (《微生物學和分子生物學詞典》)，第2版.(Singleton等人，1994,紐約州紐約市的約翰威立父子出版公司(John ffiley&Sons, NewYork, NY) ) ；The Harper Collins Dictionary of Biology (《哈拍柯林斯生物學詞典》)(Hale 和 Marham, 1991,紐約州紐約市的哈拍出版社(Harper Perennial, New York, NY))；以及Taber’s Cyclopedic Medical Dictionary (《泰伯爾醫學百科詞典》)，第17版(賓夕法尼亞州費城的戴維斯出版社(F.A.Davis C0.，Philadelphia, PA, 1993))中。除非另外提及，否則本文使用或涵蓋的技術為本領域的普通技術人員眾所周知的標準方法。以下實例說明本發明的一些優選的實施例并且僅為說明而提供。
[0108]實例1:使用引物和啟動子提供者并且不使用靶標捕集的HAV靶標的擴增。
[0109]使用每一反應1.25IU的HAV和以下兩種擴增條件中的一種來設定甲型肝炎病毒擴增測定法:SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:18，或 SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:13。使用分離凝膠和溴化乙錠染色劑來執行擴增產物的檢測。通過對HAV靶標儲備液(來自國家生物標準和控制研究所(National Institute for Biologic Standards and Controls)的 WHO 第一國際標準品(NIBSC#00/560，每一小瓶5E4IU))進行連續稀釋來設定測定法，然后將稀釋液添加至96孔板的單獨的孔。然后將兩種擴增條件中的每一者添加至單獨的含有稀釋液的孔。執行等溫擴增反應并在反應結束時，將每一反應的等分試樣轉移至單獨的凝膠孔并然后用EtBr染色。這項研究的結果顯示，每一擴增條件可檢測少至1.25IU的甲型肝炎病毒核酸。
[0110]實例2:使用引物和啟動子提供者并且使用靶標捕集的HAV靶標的擴增。[0111]如實例I中設定甲型肝炎病毒擴增測定法，不同的是該測定法包括不同稀釋液的初始靶標捕集步驟并且不同的是使用檢測探針(SEQ ID NO:62)進行擴增產物的檢測。通過首先從每一單獨的稀釋液中捕集HAV靶標并將所捕集的HAV靶核酸添加至96孔板上的單獨孔來設定測定法。所用的靶標捕集寡聚物來自具有dT3dA30尾和K18靶標捕集區域的寡聚物池。合成靶標捕集寡聚物的靶標捕集區域以各具有G和U殘基的隨機組合，因此該實例中所用的靶標捕集寡聚物的群體為序列的混合收集物。檢測步驟為終點檢測反應并且結果顯示該測定法系統對至少3.87IU/mL的HAV靶核酸具有95%檢出率(表1)。
[0112]表1。
[0113]
【權利要求】
1.一種用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的寡聚物組合，所述寡聚物組合包含: (I)用于擴增人細小病毒核酸靶區域的第一擴增寡聚物和第二擴增寡聚物，其中 (a)所述第一細小病毒擴增寡聚物包含第一靶標雜交序列，所述第一靶標雜交序列為SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 179 或 SEQ ID NO: 180 的序列；以及 (b)所述第二細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第二靶標雜交序列: (i)為SEQID NO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQID NO: 188的序列的序列；和 (ii)為SEQID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQID NO: 192的序列的序列； 和/或 (II)用于擴增HAV核酸靶區域的第一擴增寡聚物和第二擴增寡聚物，其中 (a)所述第一HAV擴增寡聚物包含第一靶標雜交序列，所述第一靶標雜交序列為SEQID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；以及 (b)所述第二HAV擴增 寡聚物包含第二靶標雜交序列，所述第二靶標雜交序列為SEQID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列。
2.根據權利要求1所述的寡聚物組合，其中所述寡聚物組合包含(I)的所述第一細小病毒擴增寡聚物和所述第二細小病毒擴增寡聚物。
3.根據權利要求2所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 179的序列。
4.根據權利要求3所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 183或SEQ ID NO: 117的序列。
5.根據權利要求4所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80 的序列。
6.根據權利要求2所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID N0:184的序列中。
7.根據權利要求6所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:81-84。
8.根據權利要求2所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 180的序列。
9.根據權利要求8所述的寡聚物組合，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:82-84。
10.根據權利要求2至9中任一項所述的寡聚物組合，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。
11.根據權利要求10所述的寡聚物組合，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。
12.根據權利要求11所述的寡聚物組合，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO: 108-113。
13.根據權利要求2至9中任一項所述的寡聚物組合，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191的序列中。
14.根據權利要求13所述的寡聚物組合，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。
15.根據權利要求14所述的寡聚物組合，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO: 118-121。
16.根據權利要求2至15中任一項所述的寡聚物組合，其中所述第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于所述祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。
17.根據權利要求16所述的寡聚物組合，其中所述啟動子序列為T7啟動子序列。
18.根據權利要求17所述的寡聚物組合，其中所述17啟動子序列具有SEQID NO: 196中示出的序列。
19.根據權利要求18所述的寡聚物組合，其中所述第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQ ID NO:88-93 和 98-101 的序列。
20.根據權利要求2至19中任一項所述的寡聚物組合，還包含 (III)用于擴增所述 人細小病毒核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物，其中 (a)所述第三細小病毒擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，所述第三靶標雜交序列具有SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ IDNO: 117、SEQ ID NO: 179 或 SEQ ID NO: 180 的序列；以及 (b)所述第四細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第四靶標雜交序列: (i)為SEQID NO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQID NO: 188的序列的序列；和 (ii)為SEQID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQID NO: 192的序列的序列； 其中(III) (a)的所述第三靶標雜交序列不同于(I) (a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列；并且 其中(III) (b)的所述第四靶標雜交序列不同于(I) (b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列。
21.根據權利要求20所述的寡聚物組合，其中所述第三細小病毒擴增寡聚物為如權利要求3至9中任一項關于所述第一細小病毒擴增寡聚物所述的寡聚物。
22.根據權利要求20或21所述的寡聚物組合，其中所述第四細小病毒擴增寡聚物為如權利要求10至19中任一項關于所述第二細小病毒擴增寡聚物所述的寡聚物。
23.根據權利要求2至22中任一項所述的寡聚物組合，還包含至少一種細小病毒特異性捕集探針寡聚物，所述細小病毒特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID NO: 132-135。
24.根據權利要求23所述的寡聚物組合，其中所述細小病毒特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO: 128-131的序列。
25.根據權利要求2至24中任一項所述的寡聚物組合，還包含置換體寡聚物，所述置換體寡聚物包含被構造用于與所述第一細小病毒擴增寡聚物或所述第二細小病毒擴增寡聚物上游的所述細小病毒靶核酸雜交的靶標雜交序列。
26.根據權利要求2至25中任一項所述的寡聚物組合，還包含至少一種細小病毒特異性檢測探針寡聚物，所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 199內所含的從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置2966、或從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置3067的祀序列特異性雜交的祀標雜交序列。
27.根據權利要求26所述的寡聚物組合，其中所述細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 194或195的序列中。
28.根據權利要求27所述的寡聚物組合，其中所述細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列選自 SEQ ID NO: 137-169。
29.根據權利要求1至22中任一項所述的寡聚物組合，其中所述寡聚物組合包含(II)的所述第一 HAV擴增寡聚物和所述第二 HAV擴增寡聚物。
30.根據權利要求29所述的寡聚物組合，其中(II)(a)的所述第一靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 172的序列中。
31.根據權利要求30所述的寡聚物組合，其中(II)(a)的所述第一靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 170 的序列。
32.根據權利要求31所述的寡聚物組合，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列選自 SEQ ID NO: 1-6 和 11。
33.根據權利要求30所述的寡聚物組合，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 171的序列。
34.根據權利要求33所述的寡聚物組合，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列選自 SEQ ID NO: 1-6。
35.根據權利要求29至34中任一項所述的寡聚物組合，其中(II)(b)的所述第二 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 176的序列中。
36.根據權利要求35所述的寡聚物組合，其中(II)(b)的所述第二 HAV靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:29-38 和 45。
37.根據權利要求29至36中任一項所述的寡聚物組合，其中所述第二HAV擴增寡聚物為還包含位于所述祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。
38.根據權利要求37所述的寡聚物組合，其中所述啟動子序列為T7啟動子序列。
39.根據權利要求38所述的寡聚物組合，其中所述17啟動子序列具有SEQID NO: 196中示出的序列。
40.根據權利要求39所述的寡聚物組合，其中所述第二HAV擴增寡聚物具有選自SEQID NO: 12-21 和 28 的序列。
41.根據權利要求29至40中任一項所述的寡聚物組合，還包含 (IV)用于擴增HAV核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物，其中 (a)所述第三HAV擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，所述第三靶標雜交序列為SEQID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；以及 (b)所述第四HAV擴增寡聚物包含第四靶標雜交序列，所述第四靶標雜交序列為SEQID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列； 其中(IV) (a)的所述第三靶標雜交序列不同于(II) (a)的所述第一 HAV靶標雜交序列；并且 其中(IV) (b)的所述第四靶標雜交序列不同于(II) (b)的所述第二 HAV靶標雜交序列。
42.根據權利要求41所述的寡聚物組合，其中所述第三HAV擴增寡聚物為如權利要求30至34中任一項關于所述第一 HAV擴增寡聚物所述的寡聚物。
43.根據權利要求41或42所述的寡聚物組合，其中所述第四HAV擴增寡聚物為如權利要求35至40中關于所述第二 HAV擴增寡聚物所述的寡聚物。
44.根據權利要求29至43中任一項所述的寡聚物組合，還包含至少一種HAV特異性捕集探針寡聚物，所述HAV特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID NO:52-57。
45.根據權利要求44所述的寡聚物組合，其中所述HAV特異性捕集探針寡聚物具有選自 SEQ ID NO:46-51 的序列。
46.根據權利要求29至45中任一項所述的寡聚物組合，還包含置換體寡聚物，所述置換體寡聚物包含被構造用于與所述第一 HAV擴增寡聚物或所述第二 HAV擴增寡聚物上游的所述HAV靶核酸雜交的靶標雜交序列。
47.根據權利要求29至46中任一項所述的寡聚物組合，還包含至少一種HAV特異性檢測探針寡聚物，所述HAV特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 198內所含的從大約核苷酸位置5965至大約核苷酸位置6028的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。
48.根據權利要求47所述的寡聚物組合，其中所述HAV特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO:178的序列中。
49.根據權利要求48所述的寡聚物組合，其中所述HAV特異性檢測探針靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:58-74。
50.一種試劑盒，包含根據權利要求1至49中任一項所述的寡聚物組合。
51.一種反應混合物,包含根據權利要求1至49中任一項所述的寡聚物組合。
52.一種用于檢測樣本中人細小病毒靶核酸和甲型肝炎病毒(HAV)靶核酸中的至少一者的方法，所述方法包括: (A)提供樣本，其中所述樣本疑似含有人細小病毒和HAV中的至少一者； (B)使所述樣本與用于擴增人細小病毒核酸靶區域和HAV核酸靶區域中的至少一者的寡聚物組合接觸，所述寡聚物組合包含: (I)對于所述細小病毒靶區域，(a)第一細小病毒擴增寡聚 物，其包含第一靶標雜交序列，所述第一靶標雜交序列為SEQ ID NO:181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 179或SEQID NO: 180的序列；和(b)第二細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第二靶標雜交序列:(i)具有SEQ IDNO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ IDNO: 188的序列的序列；和(ii)具有SEQ ID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 192的序列的序列； 和/或 (II)對于所述HAV靶區域，(a)第一 HAV擴增寡聚物，其包含第一靶標雜交序列，所述第一靶標雜交序列為SEQ ID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 173的序列；和(b)第二 HAV擴增寡聚物包含第二靶標雜交序列，所述第二靶標雜交序列為SEQ ID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175 的序列； (C)執行體外核酸擴增反應，其中所述樣本中存在的任何細小病毒和/或HAV靶核酸被用作產生細小病毒和/或HAV擴增產物的模板；以及 (D)檢測所述細小病毒和/或所述HAV擴增產物的存在或不存在， 從而指示所述樣本中細小病毒和/或HAV的存在或不存在。
53.根據權利要求52所述的方法，其中所述方法是用于檢測所述人細小病毒靶核酸并且使所述樣本與(I)的所述第一細小病毒擴增寡聚物和所述第二細小病毒擴增寡聚物接觸。
54.根據權利要求53所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 179的序列。
55.根據權利要求54所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 183的序列。
56.根據權利要求55所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列。
57.根據權利要求53所述的方法，其中⑴(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 184的序列中。
58.根據權利要求57所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:81-84。
59.根據權利要求53所述的方法，其中⑴(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 180的序列。
60.根據權利要求59所述的方法，其中⑴(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:82-84。
61.根據權利要求53至60中任一項所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。
62.根據權利要求61所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。
63.根據權利要求62所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:108-113。
64.根據權利要求53至60中任一項所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191的序列中。
65.根據權利要求64所述的方法，其中⑴(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。
66.根據權利要求65所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列選自SEQ ID NO:118-121。
67.根據權利要求53至66中任一項所述的方法，其中所述第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于所述祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。
68.根據權利要求67所述的方法，其中所述啟動子序列為T7啟動子序列。
69.根據權利要求68所述的方法，其中所述17啟動子序列具有SEQID NO: 196中示出的序列。
70.根據權利要求69所述的方法，其中所述第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQIDNO:88-93 和 98-101 的序列。
71.根據權利要求53至70中任一項所述的方法，其中步驟(B)還包括使所述樣本與以下接觸: (III)用于擴增所述人細小病毒核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物，其中(a)所述第三細小病毒擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，所述第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 181的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 179 或 SEQ ID NO: 180 的序列；以及 (b)所述第四細小病毒擴增寡聚物包含選自如下的第四靶標雜交序列:(i)為SEQ IDNO: 189的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列的序列；和(ii)為SEQ ID NO: 193的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 192的序列的序列； 其中(III) (a)的所述第三靶標雜交序列不同于(I) (a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列；并且 其中(III) (b)的所述第四靶標雜交序列不同于(I) (b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列。
72.根據權利要求71所述的方法，其中所述第三細小病毒擴增寡聚物為如權利要求54至60中任一項關于所述第一細小病毒擴增寡聚物所述的寡聚物。
73.根據權利要求71或72所述的方法，其中所述第四細小病毒擴增寡聚物為如權利要求61至70中任一項關于所述第二細小病毒擴增寡聚物所述的寡聚物。
74.根據權利要求53至73中任一項所述的方法，還包括在步驟(B)之前從所述樣本的其他組分純化所述細小病毒靶核酸。
75.根據權利要求74所述的方法，其中所述純化步驟包括使所述樣本與至少一種細小病毒特異性捕集探針寡聚物接觸，所述細小病毒特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ IDNO:132-135。
76.根據權利要求75所述的方法，其中所述細小病毒特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQ ID NO: 128-131 的序列。
77.根據權利要求53至76中任一項所述的方法，其中步驟(B)還包括使所述樣本與置換體寡聚物接觸，所述置換體寡聚物包含被構造用于與所述第一細小病毒擴增寡聚物或所述第二細小病毒擴增寡聚物上游的所述細小病毒靶核酸雜交的靶標雜交序列。
78.根據權利要求53所述的方法，其中所述檢測步驟(D)包括使所述體外核酸擴增反應物與細小病毒特異性檢測探針寡聚物接觸，所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物被構造用于在借此測定細小病毒擴增產物的存在或不存在的條件下與所述細小病毒擴增產物特異性雜交，從而指示所述樣本中細小病毒的存在或不存在。
79.根據權利要求78所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 199內所含的從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置2966、或從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置3067的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。
80.根據權利要求79所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 194或195的序列中。
81.根據權利要求80所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:137-169。
82.根據權利要求78至81中任一項所述的方法，還包括使所述樣本與可使用所述第一細小病毒擴增寡聚物和所述第二細小病毒擴增寡聚物在體外核酸擴增反應中擴增以產生第二擴增產物的假靶標寡聚物接觸，所述第二擴增產物在所述檢測反應條件下不與所述細小病毒特異性檢測探針特異性雜交。
83.根據權利要求78至82中任一項所述的方法，還包括使所述樣本與冷探針寡聚物接觸，所述冷探針寡聚物與所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物競爭雜交至所述細小病毒擴增產物。
84.根據權利要求78至81中任一項所述的方法，還包括使所述樣本與調諧體寡聚物接觸，所述調諧體寡聚物被構造用于與所述第一細小病毒擴增寡聚物和所述第二細小病毒擴增寡聚物特異性雜交。
85.根據權利要求78至84中任一項所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針包括選自如下的標記: (a)化學發光標記； (b)突光標記； (C)淬滅劑；和 (d) (a)、(b)和(C)中的一者或多者的組合。
86.根據權利要求78至85中任一項所述的方法，其中所述檢測步驟(D)在所述擴增步驟(C)期間發生。
87.根據權利要求86所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針包含熒光標記、淬滅劑或這二者。
88.根據權利要求87所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針為TaqMan檢測探針或分子信標。
89.根據權利要求78至87中任一項所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針還包含非靶標雜交序列。
90.根據權利要求89所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針為發夾檢測探針。
91.根據權利要求90所述的方法，其中所述發夾檢測探針為分子信標或分子炬。
92.根據權利要求53至91中任一項所述的方法，其中步驟(C)的所述擴增反應為等溫擴增反應。
93.根據權利要求53至91中任一項所述的方法，其中步驟(C)的所述擴增反應為PCR擴增反應。
94.根據權利要求92或93所述的方法，其中所述擴增反應為實時擴增反應。
95.根據權利要求52所述的方法，其中所述方法是用于檢測所述HAV靶核酸并且使所述樣本與(II)的所述第一 HAV擴增寡聚物和所述第二 HAV擴增寡聚物接觸。
96.根據權利要求95所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 172的序列中。
97.根據權利要求96所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 170的序列。
98.根據權利要求97所述的方法，其中(II)(a)的所述第一HAV靶標雜交序列選自SEQID NO:1-6 和 11。
99.根據權利要求96所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 171的序列。
100.根據權利要求9 9所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO:1-6。
101.根據權利要求95至100中任一項所述的方法，其中(II)(b)的所述第二 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO:176的序列中。
102.根據權利要求101所述的方法，其中(II)(b)的所述第二 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO:29-38 和 45。
103.根據權利要求95至102中任一項所述的方法，其中所述第二HAV擴增寡聚物為還包含位于所述祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。
104.根據權利要求103所述的方法，其中所述啟動子序列為T7啟動子序列。
105.根據權利要求104所述的方法，其中所述17啟動子序列具有SEQID NO: 196中示出的序列。
106.根據權利要求105所述的方法，其中所述第二HAV擴增寡聚物具有選自SEQ IDNO: 12-21和28的序列。
107.根據權利要求95至106中任一項所述的方法，其中步驟(B)還包括使所述樣本與以下接觸: (IV)用于擴增所述HAV核酸靶區域的第三擴增寡聚物和第四擴增寡聚物，其中(a)所述第三HAV擴增寡聚物包含第三靶標雜交序列，所述第三靶標雜交序列為SEQ ID NO: 174的序列中所含的約14至約27個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO:173的序列；并且(b)所述第四HAV擴增寡聚物包含第四靶標雜交序列，所述第四靶標雜交序列為SEQ ID NO: 177的序列中所含的約14至約30個連續核苷酸并且至少包括SEQ ID NO: 175的序列； 其中(IV) (a)的所述第三靶標雜交序列不同于(II) (a)的所述第一 HAV靶標雜交序列；并且 其中(IV) (b)的所述第四靶標雜交序列不同于(II) (b)的所述第二 HAV靶標雜交序列。
108.根據權利要求107所述的方法，其中所述第三HAV擴增寡聚物為如權利要求96至100中任一項關于所述第一 HAV擴增寡聚物所述的寡聚物。
109.根據權利要求107或108所述的方法，其中所述第四HAV擴增寡聚物為如權利要求101至106中關于所述第二 HAV擴增寡聚物所述的寡聚物。
110.根據權利要求95至109中任一項所述的方法，還包括在步驟(B)之前從所述樣本的其他組分純化所述HAV靶核酸。
111.根據權利要求110所述的方法，其中所述純化步驟包括使所述樣本與至少一種HAV特異性捕集探針寡聚物接觸，所述HAV特異性捕集探針寡聚物包含共價連接至與固定化探針結合的序列或部分的靶標雜交序列，其中所述靶標雜交序列選自SEQ ID NO:52-57。
112.根據權利要求111所述的方法，其中所述HAV特異性捕集探針寡聚物具有選自SEQID NO:46-51 的序列。
113.根據權利要求95至112中任一項所述的方法，還包括置換體寡聚物，所述置換體寡聚物包含被構造用于與所述第一 HAV擴增寡聚物或所述第二 HAV擴增寡聚物上游的所述HAV靶核酸雜交的靶標雜交序列。
114.根據權利要求95所述的方法，其中所述檢測步驟(D)包括使所述體外核酸擴增反應物與HAV特異性檢測探針寡聚物接觸，所述HAV特異性檢測探針寡聚物被構造用于在借此測定HAV擴增產物的存在或不存在的條件下與所述HAV擴增產物特異性雜交，從而指示所述樣本中HAV的存在或不存在。
115.根據權利要求114所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 198內所含的從大約核苷酸位置5965至大約核苷酸位置6028的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。
116.根據權利要求115所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 178的序列中。
117.根據權利要求116所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO:58-74。
118.根據權利要求114至117中任一項所述的方法，還包括使所述樣本與可使用所述第一 HAV擴增寡聚物和所述第二 HAV擴增寡聚物在體外核酸擴增反應中擴增以產生第二擴增產物的假靶標寡聚物接觸，所述第二擴增產物在所述檢測反應條件下不與所述HAV特異性檢測探針特異性雜交。
119.根據權利要求114至118中任一項所述的方法，還包括使所述樣本與冷探針寡聚物接觸，所述冷探針寡聚物與所述HAV特異性檢測探針寡聚物競爭雜交至所述HAV擴增產物。
120.根據權利要求114至117中任一項所述的方法，還包括使所述樣本與調諧體寡聚物接觸，所述調諧體寡聚物被構造用于與所述第一 HAV擴增寡聚物和所述第二 HAV擴增寡聚物特異性雜交。
121.根據權利要求114至120中任一項所述的方法，其中所述HAV特 異性檢測探針包括選自如下的標記: (a)化學發光標記； (b)突光標記；(C)淬滅劑；和 (d) (a)、(b)和(c)中的一者或多者的組合。
122.根據權利要求114至121中任一項所述的方法，其中所述檢測步驟(D)在所述擴增步驟(C)期間發生。
123.根據權利要求122所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針包含熒光標記、淬滅劑或這二者。
124.根據權利要求123所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針為TaqMan檢測探針或分子信標。
125.根據權利要求114至123中任一項所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針還包含非靶標雜交序列。
126.根據權利要求125所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針為發夾檢測探針。
127.根據權利要求126所述的方法，其中所述發夾檢測探針為分子信標或分子炬。
128.根據權利要求95至127中任一項所述的方法，其中步驟(C)的所述擴增反應為等溫擴增反應。
129.根據權利要求95至127中任一項所述的方法，其中步驟(C)的所述擴增反應為PCR擴增反應。
130.根據權利要求128或129所述的方法，其中所述擴增反應為實時擴增反應。
131.根據權利要求52至130中任一項所述的方法，其中所述樣本來自個體患者。
132.根據權利要求52至130中任一項所述的方法，其中所述樣本是被匯集的。
133.根據權利要求132所述的方法，其中所述匯集樣本為匯集的血漿樣本。
134.根據權利要求52所述的方法，其中所述方法是用于檢測所述人細小病毒靶核酸和所述HAV靶核酸，并且其中所述檢測步驟(D)包括使所述體外核酸擴增反應物與細小病毒特異性檢測探針寡聚物和HAV特異性檢測探針寡聚物接觸，所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物和所述HAV特異性檢測探針寡聚物被構造用于在借此測定細小病毒擴增產物和HAV擴增產物的存在或不存在的條件下分別與所述細小病毒擴增產物和所述HAV擴增產物特異性雜交，從而指示所述樣本中細小病毒和HAV的存在或不存在。
135.根據權利要求135所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物和所述HAV特異性檢測探針寡聚物被區別標記。
136.根據權利要求135所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物和所述HAV特異性檢測探針寡聚物各包含獨立地選自(a)化學發光標記和(b)熒光標記的標記。
137.根據權利要求135所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物和所述HAV特異性檢測探針寡聚物各包含化學發光標記。
138.根據權利要求137所述的方法，其中用于所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物和所述HAV特異性檢測探針寡聚物的所述化學發光標記的特征為不同的發光動力學，其足以區分細小病毒特異性化學發光信號與HAV特異性化學發光信號。
139.根據權利要求138所述的方法，其中用于所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物和所述HAV特異性檢測探針寡聚物的所述化學發光標記各包含吖啶酯(AE)。
140.根據權利要求134至139中任一項所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 182的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 179的序列。
141.根據權利要求140所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 183的序列。
142.根據權利要求141所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列具有選自SEQ ID NO:75-80的序列。
143.根據權利要求134至139中任一項所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 184的序列中。
144.根據權利要求143所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:81-84。
145.根據權利要求134至139中任一項所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 185的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 180的序列。
146.根據權利要求145所述的方法，其中(I)(a)的所述第一細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:82-84。
147.根據權利要求134至146中任一項所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 187的序列中并且至少包括SEQ ID NO: 188的序列。
148.根據權利要求147所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 186的序列。
149.根據權利要求148所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:108-113。
150.根據權利要求134至146中任一項所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 191的序列中。
151.根據權利要求150所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 190的序列。
152.根據權利要求151所述的方法，其中(I)(b)的所述第二細小病毒靶標雜交序列選自 SEQ ID NO:118-121。
153.根據權利要求134至152中任一項所述的方法，其中所述第二細小病毒擴增寡聚物為還包含位于所述祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。
154.根據權利要求153所述的方法，其中所述啟動子序列為T7啟動子序列。
155.根據權利要求154所述的方法，其中所述17啟動子序列具有SEQID NO: 196中示出的序列。
156.根據權利要求155所述的方法，其中所述第二細小病毒擴增寡聚物具有選自SEQID NO:88-93 98-101 的序列。
157.根據權利要求134至156中任一項所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 172的序列中。
158.根據權利要求157所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 170的序列。
159.根據權利要求158所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO:1-6 和 11。
160.根據權利要求157所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列至少包括SEQ ID NO: 171的序列。
161.根據權利要求160所述的方法，其中(II)(a)的所述第一 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO:1-6。
162.根據權利要求134至161中任一項所述的方法，其中(II)(b)的所述第二 HAV靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 176的序列中。
163.根據權利要求162所述的方法，其中(II)(b)的所述第二 HAV靶標雜交序列選自SEQ ID NO:29-38 和 45。
164.根據權利要求134至163中任一項所述的方法，其中所述第二HAV擴增寡聚物為還包含位于所述祀標雜交序列的5’的啟動子序列的啟動子引物或啟動子提供者。
165.根據權利要求164所述的方法，其中所述啟動子序列為T7啟動子序列。
166.根據權利要求165所述的方法，其中所述17啟動子序列具有SEQID NO: 196中示出的序列。
167.根據權利要求166所述的方法，其中所述第二HAV擴增寡聚物具有選自SEQ IDNO: 12-21和28的序列。
168.根據權利要求134至167中任一項所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 199內所含的從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置2966、或從大約核苷酸位置2921至大約核苷酸位置3067的靶序列特異性雜交的靶標雜交序列。
169.根據權利要求168所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 194或195的序列中。
170.根據權利要求169所述的方法，其中所述細小病毒特異性檢測探針靶標雜交序列選自 SEQ ID NO: 137-169。
171.根據權利要求134至170中任一項所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針寡聚物包含長度為約14至約40個核苷酸并且被構造用于與SEQ ID NO: 198內所含的從大約核苷酸位置5965至大約核苷酸位置6028的祀序列特異性雜交的祀標雜交序列。
172.根據權利要求171所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針靶標雜交序列包含于SEQ ID NO: 178的序列中。
173.根據權利要求172所述的方法，其中所述HAV特異性檢測探針靶標雜交序列選自SEQ ID NO:58-74。
【文檔編號】C12Q1/70GK103703148SQ201280035195
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年7月13日 優先權日:2011年7月15日
【發明者】K.高, J.M.林南, K.C.諾頓, P.C.戈頓, D.多, T.N.勒 申請人:簡.探針公司