新型α-1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明提供一種新型α-1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途。根據本發明，血液半衰期（t1/2）和血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）通過N-末端第1位至第25位之間的氨基酸突變以在動物細胞中添加N-糖基化位點而得到顯著增加，因此，所述α-1抗胰蛋白酶變體具有非常好的體內穩定性并且保留了對彈性蛋白酶活性的抑制作用。因此，本發明的α-1抗胰蛋白酶變體可用于預防或治療α-1抗胰蛋白酶缺乏。
【專利說明】新型α-1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及新型α -1抗胰蛋白酶變體及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]α -1抗胰蛋白酶是一種由394個氨基酸殘基構成的蛋白質，其分子量為約50，000道爾頓(Da)，并且其存在于哺乳動物的血液中。α-l抗胰蛋白酶是主要的血液蛋白質之一，其在血液中的濃度為約 2mg/mL (Robin ff.C.等人，Nature, 298，329-334，1982)，并且α -1抗胰蛋白酶也被稱為α -1蛋白酶抑制劑。α -1抗胰蛋白酶具有至少約100個天然生成的等位基因，并且根據等電聚焦(IEF)曲線將α-l抗胰蛋白酶的表型分為A類至Z類。本領域已知，在A類至Z類中，最豐富的M型等位基因存在于大多數人類的血液中，并且具有至少大約 75 種不同的同種型(Brantley, Μ.等人,Am.J.Med., 84 (suppl.6A), 13-31，1988),而且該M型等位基因保留了作為蛋白酶抑制劑的主要功能。
[0003]總體而言，本領域已知曉的是，大約90%的α-1抗胰蛋白酶的同種型存在于五種PiM亞型中，例如，Μ1、Μ2、Μ3、Μ4和Μ5。在這些亞型中，Μ1、Μ2和M3分別占約67%、約16%和約 ll%(Cox D.ff.&Billingsley D.G., FEBS Lett.，231，327-330，1986)。本領域已知，在這些亞型中，在M2和M3亞型的N末端起的第101位分別具有組氨酸(His)和精氨酸(Arg)，并且已知這些氨基酸的差別不會影響α -1抗胰蛋白酶的固有活性。
[0004]α-1抗胰蛋白酶是一種在3個位點上被糖基化的糖蛋白(Mega, Τ.等人，J.Biol.Chem.，255，4057-4061，1980)。X-射線晶體結構顯示α-l抗胰蛋白酶由3個β片層和8個α螺旋構成，與存在于血液中的其他蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑)類似(ElliotP.R.，等人，JMB，275，41`9-425，1988)。α-1抗胰蛋白酶起到抑制體內各種不同類型的蛋白酶的作用，并且其在體內所起到的與目前相關領域已知的疾病有關的主要作用是抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性(Beatty等人，J.Biol.Chem.，255，3931~3934，1980)。α -1抗胰蛋白酶的缺乏引起諸如肺氣腫之類的嚴重疾病，在肺氣腫這種疾病中，肺部功能由于彈性蛋白的分解而被削弱。而且，已有臨床報告表明修飾的α-l抗胰蛋白酶的蛋白質不由肝臟正常分泌，而在肝臟中積累，這引起肝硬化的發作。
[0005]近年來，美國食品與藥品管理局(FDA)已批準了幾種從人類血液中提取的產品，并且這幾種產品已作為用于治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的治療劑上市銷售。這些產品的代表性的實例包括:Prolastin(由 Talecris Plasma Resources Inc 銷售)，Aralast(由 BaxterInc銷售)以及Zemaira (由CSL Behring Inc銷售),這些產品一般以60mg/kg的劑量通過靜脈注射每周一次給藥于人體。因此，蛋白質應當以4g至5g的大劑量每周一次給藥于成人患者持續一段較長的時間。
[0006]根據數據監控(DMHC2364)分析可知，在美國和歐洲大約有200，000位患者具有與α-l抗胰蛋白酶有關的遺傳問題，但是因為沒有得到適當的診斷，這些患者中僅有一些已得到治療。目前為醫用目的而研發的所有產品均為從人類血液中提取的α-l抗胰蛋白酶。這種從人類血液中提取的α-l抗胰蛋白酶可能帶有來自人體的病毒的風險，即使在生產過程中完全消除所述病毒，也有可能帶有來自人體的病毒，所述病毒可對人體引起致命性疾病，所述病毒例如，人免疫缺乏病毒(HIV)，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒。甚至當α-l抗胰蛋白酶經過檢測幾種病原體的血液篩選測試和病毒滅活過程時，也不可能徹底根除非常罕見的還不知曉的病原體。因此，在使用血液提取的α-l抗胰蛋白酶時總是有感染人體內未知的病原體的風險。而且，穩定提供未污染的血液用于生產商業需求量的α-l抗胰蛋白酶也遇到了問題。
[0007]作為解決上述問題的一個可選的方案，重組DNA技術可用于研發作為治療劑的α-l抗胰蛋白酶。因此，已對重組DNA技術進行持續性研究，但是由于各種不同的限制因素，目前還沒有可商售的重組α -1抗胰蛋白酶。
[0008]本領域已知，因為在人α -1抗胰蛋白酶的三個位點(第46位的天冬酰胺，第83位的天冬酰胺，第247位的天冬酰胺)進行了糖基化，所以人α -1抗胰蛋白酶具有3個N-多糖基團。因為通過重組DNA方法，使用諸如大腸桿菌之類的微生物生成的α-l抗胰蛋白酶未被糖基化，所以當將這樣生成的α-l抗胰蛋白酶給藥于人體時，其在體內具有較短的半衰期(Karnaukhova 等人，Amino Acids, 30, 317-332, 2006, Garver Jr.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，84，1050-1054，1987)。為了解決這個問題并且為了有效生成大量α-1抗胰蛋白酶，通過使α-l抗胰蛋白酶在植物中表達展開研究。然而，有報道稱，雖然在植物中表達的重組α-l抗胰蛋白酶具有源于植物的糖基化，但是其體內半衰期比人α-l抗胰蛋白酶的半衰期短(Huang 等人,Biotechnol.Prog., 17, 126-133，2001)。
[0009]為了增加α-l抗胰蛋白酶的體內半衰期，Cantin等人報道了通過將聚乙二醇結合至在微生物中表達的α -1抗胰蛋白酶的半胱氨酸殘基得到的融合蛋白(Cantin等人，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，27，659-665，2002)。這篇文章說明當分子量為 20kDa 至40kDa的聚乙二醇結合至在微生物中表達的α -1抗胰蛋白酶的半胱氨酸殘基時，與在微生物中表達的α-1抗胰蛋白酶相比，結合聚乙二醇后的α-1抗胰蛋白酶具有增加的體內半衰期，從而使該半衰期 與人α-l抗胰蛋白酶的半衰期基本類似。然而，當聚乙二醇結合至蛋白質時，各種異相反應產物可通過化學副反應形成。因此，需要額外的處理方法將這些異相反應產物除去。而且，因為在結合了 PEG的α-l抗胰蛋白酶中沒有N-多糖基團，所以，這可能會在用于治療人類時由暴露的氨基酸序列引起免疫原性問題。
[0010]本領域已知，來自動物細胞的α -1抗胰蛋白酶的體內半衰期與人α-l抗胰蛋白酶的體內半衰期基本相同(Garver Jr.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，84，1050-1054，1987)。因此，在動物細胞中生產具有與人α-l抗胰蛋白酶類似的結構的α-l抗胰蛋白酶的方法可為優選的。雖然來自動物細胞的α-l抗胰蛋白酶具有優勢，但是使用動物細胞生產α -1抗胰蛋白酶具有如下問題:一般而言，使用動物細胞生產α -1抗胰蛋白酶的方法比在微生物中生產α -1抗胰蛋白酶的方法更昂貴。
[0011]同時，在α-l抗胰蛋白酶的環區域添加糖基化位點的技術已被認為會使α-l抗胰蛋白酶的體內半衰期增加。總體而言，可以推測，當在動物細胞中表達的蛋白質被糖基化時，由于當將糖基化的蛋白質給藥于人體時其流體力學體積增大，因此與未糖基化的蛋白質相比，糖基化的蛋白質可被認為具有增加的體內半衰期。然而，從促紅細胞生成素的實例中可見，基于糖基化的位置的不同，向生理學活性蛋白質中添加糖基化位點或改變糖基化位點對蛋白質的體內半衰期產生很大影響(Eliott等人，Nat.Biotechnol.，21，414-421，2003)。因此，為了增加體內半衰期和生理穩定性而向α -1抗胰蛋白酶中添加糖基化位點時，本領域技術人員需要廣泛地證明向α-l抗胰蛋白酶的哪個或哪幾個位置添加糖基化位點。
[0012]綜上所述，為了提高α-l抗胰蛋白酶的體內穩定性，本領域已有多種不同的使用重組DNA技術制備α -1抗胰蛋白酶的方法。然而，由于存在上述各種各樣的問題，這些現有方法并不適用于作為藥物的α-l抗胰蛋白酶的研發。因此，本領域亟需一種新的用于研發在體內具有非常好的穩定性的重組α -1抗胰蛋白酶的方法。
【發明內容】
[0013][技術問題]
[0014]為了制備具有臨床效用的重組α-l抗胰蛋白酶，本發明的發明人通過在α-l抗胰蛋白酶的各個不同的特定位置添加糖基化位點以制備α -1抗胰蛋白酶變體，發現該α -1抗胰蛋白酶變體在體內具有非常好的穩定性并且該α -1抗胰蛋白酶變體保留了對彈性蛋白酶的抑制作用，具有顯著增加的血液半衰期(t1/2)以及顯著增加的血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)。因此，本發明是基于上述這些事實完成的。
[0015][技術方案]
[0016]根據本發明的一個方面，本發明提供一種通過取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點而制備的α -1抗胰蛋白酶變體。
[0017]根據本發明的一種示例性的實施方式，所述α -1抗胰蛋白酶變體可具有添加于其上的I至3個糖基化位點。
[0018]根據本發明的另一示例性的實施方式，所述特定位點可存在于N-末端的第3位至第13位之間。
[0019]根據本發明的又一示例性的實施方式，所述特定位點可存在于N-末端的第9位或第12位。
[0020]根據本發明的再一示例性的實施方式，所述特定位點可位于第4位和第9位，第4位和第12位或第9位和第12位。
[0021]根據本發明的另一方面，本發明提供一種制備α -1抗胰蛋白酶變體的方法，所述方法包括取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點，在培養基中培養由具有添加于其上的糖基化位點的α-l抗胰蛋白酶表達載體轉化的細胞，通過所述細胞表達α -1抗胰蛋白酶變體蛋白，以及純化并回收表達的α-l抗胰蛋白酶變體蛋白。
[0022]根據本發明的又一方面，本發明提供一種用于預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的組合物，所述組合物包含作為活性成分的α-l抗胰蛋白酶變體，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
[0023]根據本發明 的一種示例性的實施方式，所述α -1抗胰蛋白酶缺乏可為慢性阻塞性肺病或肝硬化。
[0024]根據本發明的再一方面，本發明提供一種預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括將治療有效量的α-l抗胰蛋白酶變體給藥于患者，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
[0025]根據本發明的再一方面，本發明提供一種具有增加的體內半衰期的α-l抗胰蛋白酶變體融合蛋白，其中，所述融合蛋白通過連接兩個α -1抗胰蛋白酶變體制備，其中每個α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
[0026]根據本發明的再一方面，本發明提供一種α -1抗胰蛋白酶變體融合蛋白，所述融合蛋白包括具有增加的體內半衰期的異質蛋白，其中，所述融合蛋白通過將α-l抗胰蛋白酶變體連接至所述異質蛋白制備，并且所述α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
[0027]根據本發明的一種示例性的實施方式，所述α -1抗胰蛋白酶變體在357位(Ρ2位)上可具有氨基酸脯氨酸，該脯氨酸進一步被天冬酰胺取代。
[0028][有益效果]
[0029]根據本發明的α -1抗胰蛋白酶變體，由于其血液半衰期(t1/2)和血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)通過在α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位和第25位之間的氨基酸突變添加N-糖基化位點而得到顯著增加，因此具有非常好的體內穩定性并且保留了對彈性蛋白酶活性的抑制作用。因此，根據本發明的α-l抗胰蛋白酶變體在預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏方面有用。而且，根據本發明的α-l抗胰蛋白酶變體可用于治療α-l抗胰蛋白酶缺乏，并且當異質蛋白連接至α-l抗胰蛋白酶變體時，根據本發明的α-l抗胰蛋白酶變體可用于提高異質蛋白的體內半衰期。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]在下面的【具體實施方式】以及附圖中對本發明的優選實施方式的這些特征、方面和優勢以及其他特征、方面和優勢進行更加詳細的描述。在附圖中:
[0031]圖1為表示根據本發明的α -1抗胰蛋白酶載體(ρΤ003)的示意圖。
[0032]圖2為表示根據本發明的α -1抗胰蛋白酶變體的序列和位點的圖。
[0033]圖3為表示根據本發明的純化的α -1抗胰蛋白酶及其變體的SDS-PAGE結果的圖。
[0034]圖4為根據本發明繪制的在皮下給藥之后血漿衍生的α -1抗胰蛋白酶和在動物細胞內表達的重組α-l抗胰蛋白酶的藥代動力學圖。
[0035]圖5為根據本發明繪制的在皮下給藥之后α -1抗胰蛋白酶及其變體的藥代動力學圖。
[0036]圖6為根據本發明繪制的在皮下給藥之后血漿衍生的α -1抗胰蛋白酶和重組α -1抗胰蛋白酶變體的藥代動力學圖。
[0037]圖7為根據本發明繪制的在皮下給藥和靜脈內給藥之后α -1抗胰蛋白酶變體的藥代動力學圖。
[0038]圖8為根據本發明繪制的在靜脈內給藥之后α -1抗胰蛋白酶及其二聚體的藥代動力學圖。[0039]圖9為根據本發明繪制的在皮下給藥之后人生長激素/ α -1抗胰蛋白酶變體融合物的藥代動力學圖。
[0040]圖10為根據本發明繪制的在皮下給藥之后粒細胞集落刺激因子/ α -1抗胰蛋白酶變體融合物的藥代動力學圖。
【具體實施方式】
[0041]本發明涉及通過取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點而制備的α -1抗胰蛋白酶變體。
[0042]根據本發明的α -1抗胰蛋白酶變體的特征在于:除了 α _1抗胰蛋白酶的三個糖基化位點(第46位的天冬酰胺、第83位的天冬酰胺和第247位的天冬酰胺)之外，對α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸進行取代以添加N-糖基化位點。所添加的糖基化位點的數目不受限制。例如，糖基化位點的數目可為I至3。
[0043]可在人α -1抗胰蛋白酶的N-末端的特定位點添加N-糖基化位點以形成序列Asn-X-Thr/Ser,該序列是編碼N-末端的第I位至第25位之間的N-多糖結合位點的序列。優選地，用天冬酰胺取代存在于人α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第3位至第13位之間的氨基酸谷酰胺(優選地，存在于N-末端的第9位或第12位的氨基酸谷酰胺)以添加糖基化位點。通過添加糖基化位點而形成的變體可具有如下結構:在該結構的第4位和第9位、第4位和第12位或第9位和第12位添加糖類。除了本文所述的特定位點之外，α -1抗胰蛋白酶變體可在N-末端的25位之內的另一位點上被糖基化。
[0044]本發明還涉及制備α -1抗胰蛋白酶變體的方法，所述方法包括取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第 25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點，在培養基內培養由具有添加于其上的糖基化位點的α-l抗胰蛋白酶表達載體轉化的細胞，在培養溶液中表達α-l抗胰蛋白酶變體蛋白，以及純化并回收表達的α-l抗胰蛋白酶變體蛋白。
[0045]重組DNA技術可用作上述添加N-糖基化位點的技術，并且氨基酸可通過基因操縱被取代、插入和除去以添加N-糖基化位點。人α-l抗胰蛋白酶的N-末端的大約20個氨基酸構成α-l抗胰蛋白酶的X-射線晶體結構中不易被檢測到的區域(PDB編碼:1QLP，2QUG, 3CWL, 1PSI, 7API, IKCT (www.pdb.0rg))。在這種情況下，α -1抗胰蛋白酶的N-末端區域具有非常靈活且不被結構化的三維結構。
[0046]根據本發明的α -1抗胰蛋白酶變體可通過使用定點誘變法使至少一個氨基酸發生突變來制備。例如，當人α -1抗胰蛋白酶的第9位上的谷酰胺被天冬酰胺取代或第148位上的甘氨酸被天冬酰胺取代時，并且當修飾的人α -1抗胰蛋白酶在動物細胞中表達時，在取代谷酰胺(第9位)或甘氨酸(第148位)的天冬酰胺殘基上形成糖基化位點。而且，當第148位上的甘氨酸被蘇氨酸取代時，在第146位的天冬酰胺上形成新的糖基化位點。糖基化位點可以這種方式添加至α -1抗胰蛋白酶的各個不同的位置。
[0047]在本發明中，α -1抗胰蛋白酶變體通過在人α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上進行氨基酸取代而添加除了人α-l抗胰蛋白酶的三個糖基化位點(第46位的天冬酰胺、第83位的天冬酰胺和第247位的天冬酰胺)之外的N-糖基化位點來制備，所述α-l抗胰蛋白酶的N-末端在α-l抗胰蛋白酶(AlAT)的X-射線晶體結構中未被結構化。隨后，所述α-l抗胰蛋白酶變體在中國倉鼠卵巢細胞中表達，并且使用色譜法純化至高純度。
[0048]在SDS-PAGE測試中，在比野生型α -1抗胰蛋白酶更高的位置上出現的染色帶上觀察到純化的具有添加于其上的N-糖基化位點的α-l抗胰蛋白酶變體。這個結果說明α -1抗胰蛋白酶變體的分子量通過糖基化作用而提高。
[0049]而且，純化的α -1抗胰蛋白酶變體由于血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)和體內半衰期(t1/2)的顯著提高而在體內具有非常好的穩定性。然而，在用蘇氨酸取代α-l抗胰蛋白酶第26位上的氨基酸的變體(I26T)的情況下，體內穩定性沒有改善，甚至通過添加N-糖基化位點也沒有使體內穩定性得到改善。而且，如W02008/151845中所描述的將糖基化位點添加至環區域(環A、環B、環C、環D或環E)或環區域附近的α -1抗胰蛋白酶變體未對體內穩定性產生顯著的改善作用。此外，因為環區域的糖基化可影響實質上作為蛋白酶抑制劑起作用的α-l抗胰蛋白酶的活性，所以，選擇不影響α-l抗胰蛋白酶活性的糖基化位點非常重要。
[0050]本發明還確認了純化的α-l抗胰蛋白酶變體保留了對彈性蛋白酶的抑制作用。此外，本領域已知人α-l抗胰蛋白酶的結合速率常數通常為1.0iOJXlO5M^(Boudier C., 1994)至 UTXlO6IVr1S-1 (Terashima Μ,等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.,52(4) ,516-523，1999)。根據本發明，野生型人α-1抗胰蛋白酶及其變體的結合速率常數和平衡常數與人α-l抗胰蛋白酶的結合速率常數和平衡常數類似。由此可見，α -1抗胰蛋白酶的N-末端的糖基化不影響對彈性蛋白酶活性的抑制作用。
[0051]本發明還涉及具有增加的體內半衰期的α-1抗胰蛋白酶變體融合蛋白。在本文中，融合蛋白通過將兩個α -1抗胰蛋白酶變體彼此連接來制備。
[0052]本發 明的發明人制備了 α -1抗胰蛋白酶雙變體，在該雙變體中，357位(α -1抗胰蛋白酶變體的Ρ2位置)的氨基酸脯氨酸被天冬酰胺進一步取代，本發明的發明人制備了融合蛋白，在該融合蛋白中，粒細胞集落刺激因子與α-l抗胰蛋白酶的雙變體連接，本發明的發明人進行了藥代動力學測試并確定融合蛋白具有提高的體內穩定性(請參見實驗實施例5)。從這些結果可知，當將生理活性蛋白連接至α-1抗胰蛋白酶的雙變體時，諸如生理活性蛋白之類的異質蛋白的體內半衰期增加。
[0053]因此，本發明涉及α-1抗胰蛋白酶變體融合蛋白，在該融合蛋白中，另一異質蛋白的體內半衰期通過將所述異質蛋白連接至α-l抗胰蛋白酶變體而增加。所述異質蛋白的種類不受限制，但是可為生理活性肽或生理活性蛋白。
[0054]具有增加的半衰期的α -1抗胰蛋白酶變體融合蛋白可通過將兩個或兩個以上純化的α-1抗胰蛋白酶變體連接來制備。在先前的研究中，Sytkowski, A.J.等人報道了當使用合適的連接體連接促紅細胞生成素(EPO)以制備EPO-EPO融合蛋白時，所述融合蛋白相對于EPO單體具有顯著增加的活性和較長的體內半衰期(Sytkowski, A.J.，等人，J.Biol.Chem.，274，24773-24778，1999)。因此，當將兩個或兩個以上本發明的α-l抗胰蛋白酶變體彼此連接時，可預見到，融合蛋白的半衰期相對于α-l抗胰蛋白酶變體單體增加。進一步地，當具有較短的體內半衰期的生理活性肽或免疫調節因子或細胞因子等與根據本發明的α-l抗胰蛋白酶變體連接時，可預見到，體內半衰期顯著增加，從而顯示出充分的穩定作用。[0055]本發明還涉及用于預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的組合物，所述組合物包含作為活性成分的α-l抗胰蛋白酶變體。
[0056]此外，本發明涉及預防或治療α -1抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括將治療有效量的α-l抗胰蛋白酶變體給藥于患者。
[0057]如上所述，根據本發明的α-l抗胰蛋白酶變體，由于通過在α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間進行氨基酸突變而添加N-糖基化位點使血液半衰期(t1/2)和血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)顯著增加，具有非常好的體內穩定性并且保留了對彈性蛋白酶的抑制作用。因此，根據本發明的α-l抗胰蛋白酶變體在預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏方面有用。α -1抗胰蛋白酶缺乏包括慢性阻塞性肺病(COPD)或肝硬化，優選地包括肺氣腫，但是本發明不限于此。
[0058]除了 α -1抗胰蛋白酶變體之外，根據本發明的組合物還可包括至少一種已知的具有預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏作用的活性成分。
[0059]根據本發明的組合物可被制成除了上述用于給藥的活性成分之外還進一步包括至少一種藥學上可用的載體。所述藥學上可用的載體可與選自鹽水、無菌水、林格氏(Ringer’ s)溶液、緩沖鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、丙三醇、乙醇及其混合物中的至少一種聯合使用。在需要時，可添加諸如抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑之類的另一常規添加劑。稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑也可加至組合物中，所述組合物隨后可被配制成注射用制劑、丸劑、膠囊、顆粒或片劑。進一步地，根據疾病或成分，所述組合物可通過使用相關領域已知的合適方法或在Remington’s Pharmaceutical Science (最新版本，Mack Publishing Company, Easton PA)中公開的方法被配制成理想的劑型。
[0060]根據本發明的組合物可根據期望的方法口服給藥或腸胃外給藥(例如，靜脈注射、皮下注射或腹膜內注射、吸入 給藥或局部施用)，并且通過使用根據本發明的α -1抗胰蛋白酶變體可將本發明的組合物用于基因療法。組合物的劑量可根據患者的體重、年齡、性別和健康狀況、飲食、給藥時間、給藥方法、釋放速率以及疾病的嚴重程度而發生改變。雖然每周給藥一次的α -1抗胰蛋白酶變體的劑量低于60mg/kg ( α -1抗胰蛋白酶的劑量),但是該劑量能夠使組合物表現出基本相同的臨床療效。而且，當以與野生型α-l抗胰蛋白酶相同的劑量給藥α-l抗胰蛋白酶變體時，可預見到的是，所述組合物表現出相同的臨床療效，甚至當給藥持續期進一步延長時，所述組合物也表現出相同的臨床療效。
[0061]本發明的組合物可單獨使用或與手術、激素療法、藥物治療以及使用生物反應調節劑的方法聯合使用。
[0062]下文提供優選的實施例和實驗實施例以有助于理解本發明。然而，應當理解的是，本文提供的詳細描述僅僅意在更好地理解本發明，而無意限定本發明的范圍。
[0063]實施例1: α -1抗胰蛋白酶及其變體和二聚體的制備
[0064]1-1.構律表汰載體DAVl
[0065]將基于工業使用目的通過對母體載體pSGHVO (GenBank登錄號:AF285183)進行合適地修飾研制得到的PAVl載體用作本發明克隆所需的表達載體。所述母體載體是實驗室載體，在源于人的蛋白質以高濃度過表達且從動物細胞中釋放出來，但所述蛋白質在諸如大腸桿菌之類的細菌中表達時不表現出活性的情況下，將所述實驗室載體構建為易于純化具有生理活性的蛋白質。然而，因為母體載體在用于工業生產時受到各種限制，所以對母體載體進行修飾以在具有高蛋白質表達水平的工業中使用，這是pSGHVO載體的最大的優點。
[0066]1-2.構律α-1杭胰蛋白酶(亞型M3)載體(DT003)
[0067]為了構建α-l抗胰蛋白酶載體，通過將α-l抗胰蛋白酶(M3)基因克隆至pAVl載體中，使用hMU001448 (KRIBB)作為模板構建α-1抗胰蛋白酶載體(PT003)。具體而言，hMU001448 (KRIBB)模板通過使用兩個引物(XhoAT正向引物(5，-CCC TCC TCG AGA ATGCCG TCT TCT GTC TCG-3，, SEQ ID NO:1)和 ATNot 反向引物(5，-GGG CCC GCG GCC GCAGTT ATT TTT GGG TGG G_3，, SEQ ID N0:2))的聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增。擴增的核苷酸的兩端由兩種限制性酶XhoI和NotI消化，并且與具有Xhol/Notl限制性位點的表達載體PAVl融合，從而構建α-l抗胰蛋白酶載體(PT003，SEQ ID NO: 39)。該α-l抗胰蛋白酶載體(PT003)示例性地顯示于圖1。
[0068]1-3.α-l抗胰蛋白酶(M3)變體的制備
[0069]為了制備具有添加于其上的糖基化位點的多種α -1抗胰蛋白酶變體，將實施例1-2中制備的α-1抗胰蛋白酶載體(ρΤ003)用作模板。下表1中所列的正向引物和反向引物對以及誘變試劑盒(Enzynomix, EZchange?定點誘變試劑盒)用于制備α -1抗胰蛋白酶變體。α -1抗胰蛋白酶變體的序列和位點如圖2所示。
[0070]因為所有α -1抗胰蛋白酶變體的突變目的是為了添加N-糖基化位點，所以，原始氨基酸通常被天冬酰胺取代以形成序列Asn-X-Thr，已知序列Asn-X-Thr為動物細胞中的N-糖基化位點。然而，在一些情況下，為了使用在原始DNA序列中出現的天冬酰胺殘基，用蘇氨酸取代與天冬酰胺殘基相鄰的氨基酸。
[0071]表1
[0072]
【權利要求】
1.一種α-l抗胰蛋白酶變體，該變體通過對α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸進行取代以添加糖基化位點來制備。
2.如權利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述α-1抗胰蛋白酶變體具有添加于其上的I個至3個糖基化位點。
3.如權利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述特定位點存在于所述N-末端的第3位至第13位之間。
4.如權利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述特定位點存在于所述N-末端的第9位或第12位。
5.如權利要求1所述的α-1抗胰蛋白酶變體，其中，所述特定位點存在于第4位和第9位、第4位和第12位或第9位和第12位。
6.一種制備α-1抗胰蛋白酶變體的方法，所述方法包括: a)取代α-1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點； b)在培養基中培養 用其上添加有糖基化位點的α-1抗胰蛋白酶表達載體轉化的細胞； c )通過所述細胞表達α-l抗胰蛋白酶變體蛋白；以及 d)純化并回收表達的α-l抗胰蛋白酶變體蛋白。
7.一種用于預防或治療α-1抗胰蛋白酶缺乏的組合物，所述組合物包含作為活性成分的α-l抗胰蛋白酶變體，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α-l抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
8.如權利要求7所述的組合物，其中，所述α-l抗胰蛋白酶缺乏是慢性阻塞性肺病或肝硬化。
9.一種預防或治療α-l抗胰蛋白酶缺乏的方法，所述方法包括: 將治療有效量的α-l抗胰蛋白酶變體給藥于患者，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
10.一種具有增加的體內半衰期的α-1抗胰蛋白酶變體融合物，其中，所述融合物通過連接兩個α -1抗胰蛋白酶變體來制備，每個α -1抗胰蛋白酶變體通過取代α _1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
11.一種包含具有提高的體內半衰期的異質蛋白的α-l抗胰蛋白酶變體融合物，其中，所述融合物通過將α-l抗胰蛋白酶變體連接至所述異質蛋白來制備，并且，所述α-l抗胰蛋白酶變體通過取代α -1抗胰蛋白酶的N-末端的第I位至第25位之間的特定位點上的氨基酸以添加糖基化位點來制備。
12.如權利要求11所述的α-1抗胰蛋白酶變體融合物，其中，所述α-l抗胰蛋白酶變體在第357位具有氨基酸脯氨酸，該脯氨酸進一步被天冬酰胺取代，所述第357位為Ρ2位置。
【文檔編號】C12N15/63GK103827141SQ201280044912
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年8月13日 優先權日:2011年9月15日
【發明者】樸淳宰, 鄭惠信, 李尚美, 金知宣 申請人:阿特根公司