具有d-乳酸脫氫酶活性的甘油脫氫酶變體及其用途【專利摘要】本發明提供一種設計及產生比較于親代多肽而具有改變功能的甘油脫氫酶(GlyDH)變體的方法。本發明更提供一種編碼比較于親代多肽而具有改變功能的GlyDH多肽變體的核酸。本發明的各種實施形態中也提供包含編碼GlyDH變體的多核苷酸的宿主細胞和制造乳酸的方法。【專利說明】具有D-乳酸脫氫酶活性的甘油脫氫酶變體及其用途[0001]相關申請的前后參照本申請要求2011年10月4日提出的美國臨時專利申請序號第61/543003號的權益，特此將該專利申請的公開內容完整加入作為參考，包括所有附圖、表格和氨基酸或核酸序列。[0002]本發明受政府支持由能源部（DE-FG36-04G014019號與DE-FG36-08G088142)與美國農業部、國家食品和農業研究院（2011-10006-30358號）補助而成。政府在本發明中擁有特定權利。【
背景技術：
】[0003]石油作為汽車燃料的首要來源以及用于有機化學和塑料的主要原料。石油儲備的有限性和使用石油的負面環境沖擊，將注意力逐漸轉移到可再生原料的替代物上（1?4)。碳水化合物的發酵作用已被證明制造出短鏈氫氧基酸以及其他可被聚合成塑料并代替石油的化學物質（5)。早在1895年時就已經開始使用純細菌培養進行乳酸的商業化生產（6)，而目前的年產量已超過300000公噸。雖然乳酸主要用于食品和藥品產業，假設可以降低制造聚乳酸生物聚合物（polylacticacidbiopolymers，PLA)的成本，貝u制造PLA的應用預期將會超過其他的用途（7,8)。[0004]乳酸被濃縮成乳酸交酯雙體（lactidedimers)，純化并聚合成熱塑性塑料（7,9)。混合D型（_)和L型（+)乳酸聚合物提供實質上控制物理及熱化學特性與生物分解速率(9)。雖然可以用石油人工合成出乳酸，化學合成制造出的異構物的混合物并不適合用于PLA。合成PLA所需的旋光性純乳酸可以通過微生物發酵快速制造（8)。通過乳酸細菌，例如乳酸菌、乳酸球菌等等，從葡萄糖和蔗醣在介于30°C到40°C溫度之間以高產率及滴度制造出商業化L型（+)乳酸（8,10)。大腸桿菌（Escherichiacoli)的衍生物是已知唯一商業化D型㈠乳酸的生產者（11，12)并且也能在40°C以下達到最佳運作。[0005]為了消除碳水化合物（葡萄糖、蔗醣）食物的使用，需要可發酵醣的替代來源，例如木質纖維素生物量與改良的微生物性生物催化劑以用于乳酸的制造（13)。然而，使用纖維素作為原料的商業化真菌纖維素意味著可觀的制造成本。可以通過有效率地在最佳用于真菌纖維素的環境（PH5.0,50°C)下發酵的耐熱性生物催化劑的開發而減少所述成本（14，15)。[0006]通過磷酸乙酮醇酶途徑的工業代謝性五碳醣（從半纖維素）所使用的乳酸生物催化劑，阻止這些醣高效率的轉換成乳酸。使用該途徑從五碳醣制造的乳酸被等摩爾量的乙酸所污染（圖1)(8,16?18)。為了提升這些乳酸細菌的木糖發酵性質所做的嘗試僅獲得有限的成功（18，19)。雖然在半纖維素中所有的五碳醣都被大腸桿菌（E.coli)衍生物有效率地通過五碳醣-磷酸途徑發酵成D型（-)或L型（+)乳酸，這種生物催化劑的溫度或pH值容忍度仍不足以允許用于在商業化纖維素的最佳溫度（50°C)或pH值（5.0)下的纖維素發酵（20)。[0007]凝結芽孢桿菌（Bacilluscoagulans)具有多種將木質纖維素醣發酵成乳酸的期望特性。這種細菌利用高效率五碳醣-磷酸途徑在用于商業化真菌纖維素的最佳環境50-55°C及pH值5.0下將五碳醣和六碳醣發酵成L型（+)乳酸（圖1)(15,17,21)。原生菌株在葡萄糖或木糖進行補料分批發酵下，產生濃度高達180gΓ1的旋光性純L型（+)乳酸，并使用真菌纖維素良好地運作于纖維素的同步醣化和發酵（SSF)期間（21，22)。這種用于凝結芽孢桿菌的發酵及真菌纖維素活性的最佳組合使得比較于嗜溫細菌的生物催化劑的同步醣化和發酵允許減少4倍的纖維素使用量（21)。對比于需要復合營養素的乳酸細菌，凝結芽孢桿菌也以便宜的玉米浸漬液（cornsteepliquor)(0.25%，w/v)補充劑于礦物鹽介質中成長并發酵糖（8,15,18)。雖然凝結芽孢桿菌在將纖維素轉變成旋光性純L型（+)乳酸的生物催化劑上具有優異潛力，相同效力的用于制造乳酸的D型（-)異構物的微生物目前仍未被討論過。【
發明內容】[0008]本發明提供一種設計并產生比較于親代多肽（parentpolypeptide)具有修改功能的甘油脫氫酶（glyceroldehydrogenase,GlyDH)變體。本發明更提供一種編碼比較于親代多肽具有修改功能的甘油脫氫酶多肽變體的核酸。本發明的各種實施形態中也提供一種包含編碼甘油脫氫酶變體的多核苷酸的宿主細胞與制造乳酸的方法。【專利附圖】【附圖說明】[0009]圖1為葡萄糖與木糖在凝結芽孢桿菌菌株P4-102B中的無氧代謝途徑。箭頭的厚度表示葡萄糖或木糖流到L-乳酸（折線）作為野生型無氧生長期間的優選路線和流到在本研究中所建構的菌株QZ19的D-乳酸。虛線箭頭（L-LDH和ALS)代表于本研究中引進的二個途徑的變異。在乳酸細菌中的木糖發酵途徑，例如乳酸球菌利用磷酸乙酮醇酶途徑導致等摩爾乳酸和乙酸亦呈現作為比較。參考帕特爾等人透過凝結芽孢桿菌和乳酸球菌發酵五碳醣的細節（17)。[0010]圖2D-乳酸生產凝結芽孢桿菌菌株QZ19的發酵分布曲線圖。葡萄糖為進行發酵在50°C下濃縮為110gΓΗΟ.ΘΜ)且媒介通過添加氫氧化鈣（Ca(0H)2)維持pH值為5.0。[0011]圖3為結晶纖維素通過凝結芽孢桿菌菌株QZ19在50°C、pH值5.0下同步醣化和發酵成D-乳酸。乳酸球菌資料是從歐等人（22)取得并包含作為比較。初始纖維素（過濾禮：，SolkaFloe)濃縮為40gL、[0012]圖4為各種凝結芽孢桿菌菌株在往D-乳酸生產菌株QZ19的路徑上的粗取物蛋白質的聚丙烯酰胺膠體電泳（SDS-PAGE)。以pH控制（5.0)發酵的LB+葡萄糖中（30gΓ1)的培養生長物在生長的中期到晚期指數相期間收獲，且制備并分析細胞萃取物。左線，標準分子量。左側的數字代表蛋白質依千道爾吞的對應分子量。右線，菌株QZ19的純甘油脫氫酶(GlyDH*)〇[0013]圖OTNA插入于強化gldA表達的凝結芽孢桿菌菌株QZ13的gldA基因的上行區域中。插入件DNA(1821bp)以斜體起始表示于gldA基因（在ATG中"A"作為+1)的-62處的"C"後且持續往上行。直接重復（封閉于橢圓形內）的十一個底物表示插入的端點處，一個位于插入件的5-端點處而第二個位于緊鄰插入的3-端點處的gldA基因的5-端點處。0RF1，為假定DoeR家族轉錄調節子；0RF2和0RF3,在插入件DNA中的假定轉座酶；gldA，甘油脫氫酶。表不假定-10、-35及沙恩-達爾加諾序列（Shine-Dalgarnosequences,SD)。[0014]圖6A、6B、6C凝結芽孢桿菌野生型P4-102B的發酵分布曲線圖（圖6A)，和它的ldh(菌株QZ4,圖6B)及ldh、als(菌株QZ5,圖6C)變體。通過自動添加Κ0Η到LB+葡萄糖（0.16M)在pH值控制在5.0下于50°C的小發酵槽內進行發酵作用。[0015]圖7小發酵槽內的凝結芽孢桿菌菌株QZ5到D-乳酸生產菌株QZ19的代謝進化。每三天在代謝進化期間進行乳酸滴度的測定。關于其他細節參考正文。[0016]圖8小發酵槽內的LB+葡萄糖在pH值為7.0下以逐漸增加的葡萄糖濃度的凝結芽孢桿菌菌株QZ14的代謝進化。介質也包含0.2M碳酸鈣（CaC03)。起始葡萄糖濃度為50gΓ1(0.28M)。在第三次轉換后，葡萄糖濃度增加到60gΓ1(0.33M)。在第五次轉換后介質的葡萄糖濃度為l〇〇g1^(0.56M)。在各轉換的三天后測定培養基的乳酸滴度。在進行培養60天之后，隔離制造約0.8Μ乳酸的菌株QZ15。在進行代謝進化的再63天之后，隔離菌株QZ19。[0017]圖9通過凝結芽孢桿菌菌株QZ19在pH值5.0及50°C下進行葡萄糖的補料分批發酵成D-乳酸。在LB+葡萄糖中控制pH值起始于葡萄糖的lOOgPOXSeM)進行發酵，且在72小時加入另外的葡萄糖的lOOgL4(0.56M)。通過添加氫氧化鈣維持培養基的pH值在5.0〇[0018]圖10通過凝結芽孢桿菌菌株QZ19在50°C及pH值5.0下將木糖發酵成D-乳酸。LB介質內含木糖SOgr1(0.53M)及碳酸鈣（CaC03)0.2M。[0019]圖11凝結芽孢桿菌菌株QZ19的甘油脫氫酶的胺基酸序列與D-乳酸脫氫酶活性。在消化胰蛋白酶及片段的LC-MS/MS後檢驗上例的胺基酸。[0020]圖12凝結芽孢桿菌野生菌株P4-102B及它的D-乳酸生產衍生物，內含于甘油脫氫酶中的二突變變異菌株QZ19(序列號第1號）（GlyDH*)改變的甘油脫氫酶（GlyDH)(序列號第3號）的胺基酸序列。[0021]圖13凝結芽孢桿菌甘油脫氫酶根據通過瑞士模型所建構的嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus)甘油脫氫酶（PDB1JPU)的模型。自然酵素顏色為綠色而QZ19(GlyDH*)的酵素顏色為青色，并被迭加在一起。胺基酸121及245被強調顯示；自然胺基酸為黃色以及修改的胺基酸（菌株QZ19)為品紅色。底部：根據所列的嗜熱脂肪桿菌酵素結構，僅有在活性位的胺基酸。左側，具甘油的自然甘油脫氫酶在活性位；右側，具丙酮酸的甘油脫氫酶（GlyDH*)(D121N，F245S)在活性位。[0022]圖14提供各種甘油脫氫酶多肽（序列號第5?32號）的比對。如比對中所表示的，在對應序列號第3號的胺基酸121及245的位置所發現的天冬氨酸（asparticacid)及苯丙氨酸（phenylalanine)保存于所有多肽中。[0023]圖15自然蛋白質以及在基于生長選擇用于生產D-乳酸的凝結芽孢桿菌期間所獲得的酵素修改形式的甘油脫氫酶活性。[0024]圖16自然蛋白質以及在基于生長選擇用于生產D-乳酸的凝結芽孢桿菌的期間所獲得的酵素修改形式的乳酸脫氫酶活性。[0025]圖17于凝結芽孢桿菌菌株QZ19(序列號第53號）的gldA基因上行的插入序列。[0026]圖18包含gldA基因于凝結芽孢桿菌菌株QZ19的gldA基因上行的插入序列。小寫字母代表插入序列而大寫字母表示gldA序列及其緊鄰插入位置的上行序列（在-62後以"ATG"中的"A"作為+1)。以小寫、粗體、斜體并加底線_(序列號第54號中的位置1822?1827)的序列"ttgaca"為假定-35序列，它通過插入序列被引入gldA上行序列中。gldA的自然上行序列不具有假定-35序列。通過插入而引入該新-35序列使得gldA基因可被表達且在菌株QZ13中生產出高程度的蛋白質及其后代。自然gldA基因的假定-10序列也標明（粗體、斜體及_)。[0027]圖19沒有插入序列的自然gldA序列。插入位置是以箭頭標示（在序列號第55號的臉基219之后）。【具體實施方式】[0028]根據本發明，"核苷酸序列"、"聚核苷酸"或"核酸"可以互換使用并被理解為意指雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNAs的轉錄產物（例如RNA分子）。其應同時被理解為本發明應無關于其自然環境或自然狀態中的基因組的聚核苷酸序列。本發明的核酸、聚核苷酸或核苷酸序列可通過包含但不限于離子交換層析法、分子尺寸排出層析法的隔離方法，或通過例如增幅（amplification)、差減雜交（subtractivehybridization)、克隆（cloning)、亞克隆（subcloning)或化學合成（chemicalsynthesis)的基因工程方法或這些基因工程方法的組合而被隔離、純化（或部分純化）。[0029]蛋白質及核酸序列的同源序列可利用領域中任何各種現有的序列比對算法及程序而評估。這樣的算法及程序包含但并不意味著限制于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA及CLUSTALW。典型地，進行序列比對法是使用通過供應商提供的默認參數或使用那些列于上方所確定的參考數據中的參數，它整體內容在這里合并作為參考。如下文所討論的，甘油脫氫酶序列可被比對以確定對應那些分別在序列號第3號的位置245及121所找到的苯丙氨酸（phenylalanine)及天冬氨酸（asparticacid)胺基酸殘基，且那些胺基酸隨后可以被其他的胺基酸取代，例如絲氨酸（serine)或天冬酰胺（asparagine)。[0030]本發明的主題也是提供一種包含編碼變體甘油脫氫酶多肽的多核苷酸序列的基因結構。這里所公開的基因結構可以內含額外的調控單元，例如啟動子（promoters)或增強子（enhancers),以及可選擇性的，選擇標記（selectablemarkers)。同時本發明的主題的范疇內為內含上述的基因結構的載體或表達框（expressioncassettes)或編碼公開在本說明書中可操作性的連接到調控單元的變體甘油脫氫酶多肽的多核苷酸。載體及表達框還可內含額外的轉錄控制序列。載體及表達框可進一步包含選擇標記。表達框可內含至少一個額外基因，可操作性的連接到控制單元，以共轉形有機體。另外，附加基因及控制單元可被提供到多個表達框上。那些表達框被提供具有用于插入本發明的序列的多個限制性酶切位點（restrictionsites)以遵守調控區域的轉錄規則。表達框可額外的內含可操作性的連接到控制單元的可選擇性標記基因。[0031]表達框將包含在轉錄方向5'?3'、轉錄及轉譯起始區、本發明的DNA序列、以及轉錄及轉譯終止區中。轉錄起始區、啟動子，對于宿主細胞而言可以為原型的或類似的，或為外來的或異源的。外來的是意指轉錄起始區不被發現于轉錄起始區被引入的有機體中。[0032]本發明主題也提供變體甘油脫氫酶多肽的表達，編碼在這里所公開的聚核苷酸序列，包含將編碼所述變體甘油脫氫酶多肽的聚核苷酸在允許多肽轉形的條件下轉形進宿主細胞培養，且選擇性地回收表達的多肽。[0033]本發明的其他實施形態更提供編碼變體甘油脫氫酶的多核苷酸（例如序列號第1號），還有包含核酸的重組載體和重組宿主細胞，或編碼變體甘油脫氫酶的重組載體。在一個實施例中，編碼變體序列碼第1號的變體甘油脫氫酶的多核苷酸包含序列碼第2號。[0034]本發明的其他實施形態更提供具有D-乳酸脫氫酶活性的變體甘油脫氫酶多肽。在本發明該實施形態的各種實施例中，甘油脫氫酶多肽是變體的（改變的），使得對應序列碼第3號位置245的苯丙氨酸被絲氨酸（F245S)取代及/或對應序列碼第3號位置121的天冬氨酸被天冬酰胺（D121N)取代。在一個實施例中，變體甘油脫氫酶具有單體胺基酸取代基（F245S或D121N)。其他實施例提供具有二個胺基酸取代基（F245S或D121N)的變體甘油脫氫酶。另一個實施例更提供包含序列碼第1號的變體甘油脫氫酶，或其中具有D-乳酸脫氫酶活性的片段。在優選的特定實施例中，在這里所公開的變體甘油脫氫酶多肽的片段保留了完整長度的變體甘油脫氫酶多肽的至少一個特性或活性。該特性或活性是D-乳酸脫氫酶活性。本發明的該實施形態的其他實施例提供了以同義于絲氨酸（例如蘇氨酸(Thr)、甘氨酸（Gly)和天冬酰胺（Asn))的胺基酸在對應于位置245的苯丙氨酸的胺基酸的取代，以及以同義于天冬酰胺（例如谷氨酰胺（Gin))的胺基酸取代對應于序列碼第3號位置121的天冬氨酸。[0035]本發明的其他實施形態提供包含在這里所公開的甘油脫氫酶變體的組成物。在各種實施例中，該成分典型地包含攜帶體，像是緩沖劑或其他液體介質，結合如在這里所公開的變體甘油脫氫酶。[0036]本發明的另一個實施形態更提供導致可操作性連接到啟動子的核酸序列的組成性表達增加的啟動子。新的重建啟動子（圖5)看上去可正常構成運作且從該啟動子所轉錄的程度是高的（表2;甘油脫氫酶基因gldA的mRNA水平；在SDS-PAGE硅膠中的蛋白質水平-圖4)。該啟動子在凝結芽孢桿菌（革蘭氏陽性）及大腸桿菌（革蘭氏陰性）中作用。"_1〇以及-35"序列本質上為大腸桿菌共識部且通過插入轉座子（transposon)而驅動。在一些實施例中，在一些實施例中的核苷酸，核苷酸cgaaaattacaccgagcaagtaaagcacggtagccgaaagtgtacaaaaagagtgtcttggaatacccgatatttaaaccttgtcgagaaaaacttgacacatacCAAAAATAAGTTATGATGGAATTGTGCTTGTTATATTTTTCAC(序列號第56號）或tcgagaaaaacttgacacatacCAAMATAAGTTATGATGGAATTGTGCTTGTTATATTTTTCAC(序列號第56號的核苷酸84?148)可以為了驅動異源基因序列的表達而被操作性的連接到異源序列。[0037]本發明的其他實施形態更提供相較于對照組的細菌、真菌或酵母細胞（不會產生在這里所公開的變體甘油脫氫酶多肽的細胞）而演示增加D-乳酸的生產率（具有增加的D-乳酸脫氫酶活性）的細菌細胞、真菌細胞及酵母（yeast)。細菌細胞可以是革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。在本發明的該實施形態中，革蘭氏陰性細菌細胞可以是從埃希氏菌（Escherichia)、發酵單胞菌（Zymomonas)、不動桿菌屬（Acinetobacter)、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter)、地桿菌（Geobacter)、希瓦氏菌（Shewanella)、沙門氏菌(Salmonella)、腸桿菌（Enterobacter)和克雷伯氏菌（Klebsiella)組成的群組中選擇的菌屬。革蘭氏陽性細菌可以從芽孢桿菌屬（Bacillus)、梭菌屬（Clostridium)、棒桿菌屬（Corynebacterium)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、乳球菌屬（Lactococcus)、酒球菌(Oenococcus)、鏈球菌（Streptococcus)和真細菌細胞（Eubacterialcells)組成的群組中選擇。各種嗜熱細菌細胞，例如嗜熱厭氧菌（Thermoanaerobes)(例如解糖熱厭氧桿菌（Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum))也可被操縱以通過在這里所公開的變體甘油脫氫酶多肽的表達的方式提升乳酸生產率。其他的嗜熱微生物包含但不限于芽孢桿菌屬（Bacillusspp·)，例如凝結芽孢桿菌菌株（Bacilluscoagulansstrains)、地衣芽孢桿菌菌株（Bacilluslicheniformlsstrains)、枯草芽抱桿菌菌株（Bacillussubtilisstrains)、解淀粉芽抱桿菌菌株（Bacillusamyloliquifaclensstrains)、巨大芽抱桿菌菌株（Bacillusmegateriumstrains)、浸麻芽抱桿菌菌株（Bacillusmaceransstrains)或類芽孢桿菌屬的菌株（Paenibacillusspp.strains)、或土芽孢桿菌屬菌（Geobacillusspp·)，例如嗜熱脂肪土芽抱桿菌屬的菌株（Geobacillusstearothermophilusstrains)可以進行基因改良。其他芽孢桿菌屬菌株可從菌種保藏中心（culturecollection)獲得，例如美國典型培養物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection,ATCC)，并修改（以編碼一個或多個變體甘油脫氫酶多肽的多核苷酸而轉形）以通過在這里所公開的一個或多個變體甘油脫氫酶多肽的表達而具有增加的乳酸脫氫酶活性。特殊實施例明確地排除凝結芽孢桿菌菌株QZ19(收存于2010年11月4日，美國農業研究培養收集中心，美國伊利諾伊州60604波利亞市北大學街1815號，登錄號NRRLB-50443)在其自然態（未轉形）。[0038]其他實施例提供具有增加的D-乳酸脫氫酶活性的酵母細胞或真菌細胞。酵母細胞可以為念珠菌屬（Candida)、漢遜酵母（Hansenula)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、酵母屬（Saccharomyces)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)或耶氏酵母屬細胞（Yarrowiacell),例如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母（Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母（Saccharomycesdiastaticus)、道格拉斯酵母（Saccharomycesdouglasii)、克魯維酵母（Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母（Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)或脂耶氏酵母細胞（Yarrowialipolyticacell)。[0039]在其他實施例中，具有提升的D-乳酸脫氫酶活性的細胞可以為真菌細胞。在這里所使用的"真菌"包含子囊菌門（Ascomycota)、擔子菌門（Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門（Zygomycota)、卵菌門（Oomycota)及所有的有絲分裂孢子真菌門（mitosporicfungi.)。真菌細胞可以是酵母細胞。在這里所使用的"酵母"包含子囊孢子酵母（內孢霉目（Endomycetales))、產擔子孢子囊酵母（basidiosporogenousyeast),且酵母屬于不完全真菌屬（芽生菌目（Blastomycetes))。由于酵母的分類可能會在未來中改變，為了本發明的目的，酵母應該被定義為酵母的生物學和活動（BiologyandActivitiesofYeast)(斯金納F.A.、帕斯穆爾S.Μ.及達文波特R.R.合編應用細菌學研討學會系列第9號，1980年）（Skinner，F.A.，Passmore，S.Μ·，andDavenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所討論的酵母。[0040]真菌宿主細胞可以是絲狀真菌細胞（filamentousfungalcell)。"絲狀真菌細胞"包含絲狀形式的所有細分真菌門（Eumycota)和卵菌門（Oomycota)(如同霍克斯沃思（Hawksworth)等人所定義的，1995年，同上）。絲狀真菌的普遍特性是以幾丁質、纖維素、葡聚醣（glucan)、殼聚醣（chitosan)、甘露聚醣（mannan)和其它復雜多醣構成的菌絲體壁。營養生長通過菌絲延伸且碳分解代謝是專性需氧的。相反的，通過例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母的營養生長是通過單細胞菌體的芽接且碳分解代謝可以是發酵性的。[0041]絲狀真菌宿主細胞可以是支頂頭孢菌（Acremonium)、曲霉菌（Aspergillus)、短梗霉菌（Aureobasidium)、煙管菌屬（Bjerkandera)、擬錯菌屬（Ceriporiopsis)、金孢子菌屬（Chrysosporium)、鬼傘屬（Coprinus)、革蓋菌屬（Coriolus)、隱球菌（Cryptococcus)、線黑粉酵母屬（Filibasidium)、鐮刀菌（Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、稻溫病菌（Magnaporthe)、毛霉菌屬（Mucor)、毀絲霉菌（Myceliophthora)、新考瑪脂霉菌（Neocallimastix)、脈抱霉菌（Neurospora)、擬青霉菌（Paecilomyces)、青霉菌屬（Penicillium)、平革菌屬（Phanerochaete)、射脈菌屬（Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、蛇燕屬（Pleurotus)、裂糟菌屬（Schizophyllum)、籃狀菌屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、梭孢殼菌屬（Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)、栓孔菌屬（Trametes)或木霉細胞（Trichodermacell)。例如，絲狀真菌宿主細胞可以是泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、臭曲霉（Aspergillusfoetidus)、煙曲霉（Aspergillusfumigatus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉（Aspergillusniger)、米曲菌（Aspergillusoryzae)、黑刺煙管菌（(Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌（Ceriporiopsisaneirina)、卡蓋爾擬錯菌（Ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬錯菌（Ceriporiopsisgilvescens)、培寧辛達擬錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、環帶擬錯菌（Ceriporiopsisrivulosa)、淺紅擬錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬錯菌（Ceriporiopsissubvermispora)、貧乏金抱子霉（Chrysosporiuminops)、嗜角質金孢子菌屬（Chrysosporiumkeratinophilum)、勞肯諾溫斯金孢子菌屬(Chrysosporiumlucknowense)、章金抱子菌屬（Chrysosporiummerdarium)、毯金抱子菌屬（Chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金抱子菌屬（Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌屬（Chrysosporiumtropicum)、佐乃特金孢子菌屬（Chrysosporiumzonatum)、灰蓋鬼傘（Coprinuscinereus)、毛革蓋菌（Coriolushirsutus)、桿抱狀嫌抱(Fusariumbactridioides)、禾谷嫌刀菌（Fusariumcerealis)、克地嫌刀菌（Fusariumcrookwellense)、大刀嫌刀菌（Fusariumculmorum)、小麥赤霉病禾谷嫌刀菌屬（Fusariumgraminearum)、禾鎌抱菌（Fusariumgraminum)、異抱鎌抱菌（Fusariumheterosporum)、合歡木德抱（Fusariumnegundi)、尖抱鎌刀菌（Fusariumoxysporum)、網鎌抱菌（Fusariumreticulatum)、粉紅嫌刀菌（Fusariumroseum)、接骨木嫌刀菌（Fusariumsambucinum)、膚色嫌抱菌（Fusariumsarcochroum)、擬枝抱嫌抱菌（Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌（Fusariumsulphureum)、族囊鐮孢菌（Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮刀菌(Fusariumtrichothecioides)、嫌抱霉（Fusariumvenenatum)、特異腐質霉屬（Humicolainsolens)、柔毛腐質霉屬（Humicolalanuginosa)、米赫根毛霉（Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱霉（Neurosporacrassa)、產紫青霉(PeniciIliumpurpurogenum)、黃抱平革霉（Phanerochaetechrysosporium)、福身寸身寸脈菌（Phlebiaradiata)、杏鮑燕（Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭孢殼霉（Thielaviaterrestris)、長絨毛栓菌（Trametesvillosa)、雲芝（Trametesversicolor)、對木徵菌（Trichodermaharzianum)、纖維素分解菌（Trichodermakoningii)、對長梗木霉（Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉（Trichodermareesei)、或綠色木霉菌(Trichodermaviridecell)。[0042]真菌細胞可以通過本身所現有方法包含原生質體形成、原生質體轉形及細胞壁再生的過程而轉形。適合將曲霉（Aspergillus)和木霉（Trichoderma)宿主細胞轉形的過程在EP238023,葉爾頓等人，1984年，美國國家科學院院刊81:1470?1474,和克里斯滕森等人，1988年，生物/技術6:1419?1422(Yeltonetal.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470_1474，andChristensenetal.，1988，Bio/Technology6:1419-1422)中探討。適合將鐮刀菌（Fusariumspecies)轉形的方法在馬拉迪耶等人，1989年，基因78:147?156(]\&1131(1丨616七31.，1989,6611678:147-156)、和1096/00787中探討。酵母可以使用貝克和瓜倫特，于阿伯爾森J.N.和西蒙M.I.編輯，酵母遺傳學和分子生物學指南，酵素學方法，第194卷182?187頁，學術出版社，紐約；伊藤等人，1983年，細菌學雜志153:163;以及埃南等人，1978年，美國國家科學院院刊75:1920(BeckerandGuarente，InAbelson，J.N.andSimon,Μ.I.,editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoetal.,1983,J.Bacteriol.153：163；andHinnenetal.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1920)中所述的過程而轉形。[0043]本發明的各種其他實施形態提供了生產乳酸的方法。在本發明的這些方法中，現有的細菌、真菌或酵母細胞以在這里所公開的編碼變體甘油脫氫酶的多核苷酸轉形并接著用于生產D-乳酸。在各種實施例中，這些方法包含在允許D-乳酸生產的條件下培養含有在這里所公開的編碼變體甘油脫氫酶的多核苷酸的細菌、真菌或酵母細胞。[0044]如在這里所使用的，"隔離"代表使細菌、真菌或酵母細胞部分地或完全地不受其他細菌的污染。被隔離的細菌、真菌或酵母細胞（細菌、真菌或酵母細胞）可以在不會影響被隔離的細菌、真菌或酵母細胞的功能和特性（例如具有提升的D-乳酸脫氫酶活性的細菌、真菌或酵母細胞）的小比例的其他細菌存在下存在。被隔離的細菌、真菌或酵母細胞將普遍純度至少為30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。優選地，根據本發明的受隔離的細菌、真菌或酵母細胞的純度將至少為98%或至少為99%。"重組細胞"是內含異源性多核苷酸序列的細菌、真菌或酵母細胞（例如將在這里所公開的編碼變體甘油脫氫酶的多核苷酸）。[0045]野生型的細菌、真菌或酵母細胞是有機體或菌株的典型型態，舉細菌細胞的例子來說，當它存在于自然中時是不存在有變體的。野生型是指最普通的自然群體的表型。"親細菌、真菌或酵母菌株"、"親細菌菌株"、"親真菌菌株"或"親酵母菌菌株"是給定細菌、真菌或酵母細胞的基因型或表型的標準參考并且可以指稱為等同于"參考菌株"或"參考細菌、真菌或酵母細胞"。"親細菌、真菌或酵母菌株"可以曾被基因操縱或為依照所使用的術語中的內文的"野生型"細菌細胞。增加D-乳酸脫氫酶表達在基因修改的細菌、真菌或酵母細胞中，參考菌株或參考細菌、真菌或酵母細胞將會是野生型細菌、真菌或酵母細胞。[0046]在各種實施例中，提供包含例如以在這里所公開的編碼變體甘油脫氫酶多肽的聚核苷酸而轉形的細菌、真菌或酵母細胞的微生物細胞的組成物。這些組成物可以包含適合用于以在這里所公開的編碼變體甘油脫氫酶多肽的聚核苷酸而轉形的特殊微生物細胞的培養介質。[0047]"增加"、"提升"、"提高"或"增多"等術語是代表增加至少5%，舉例來說，具體活性（例如提升D-乳酸脫氫酶活性或提升D-乳酸生產率）的5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、99%、100%或更高。[0048]本發明的各種實施形態提供各種用于生產D-乳酸的水解產物，其包含但不限于，來自生物質、半纖維生物質、木質纖維素生物質或纖維素類生物質的水解產物。本發明的其他實施形態更提供具提升D-乳酸脫氫酶活性的細菌、真菌或酵母細胞且生產D-乳酸。[0049]本發明的另一個實施形態提供設計并產生相較于親多肽具有修改功能的甘油脫氫酶（GlyDH)變體的方法。本發明更提供編碼相較于親多肽而具有修改功能的甘油脫氫酶多肽變體的核酸（例如自然甘油脫氫酶多肽在宿主細胞內的改變，或使得對應苯丙氨酸的序列號第3號位置245的苯丙氨酸改變成絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺、及/或對應天冬氨酸的序列號第3號位置121天冬氨酸而改變成天冬酰胺或谷氨酰胺的另一個甘油脫氫酶多肽）。包含編碼甘油脫氫酶變體的聚核苷酸的宿主細胞以及生產乳酸的方法也被提供在本發明的各種實施形態中。[0050]本發明的一個實施形態提供設計及產生相較于親多肽而具有修改功能的甘油脫氫酶變體的方法。該方法普遍包含：a)提供甘油脫氫酶多肽的數據庫并比對胺基酸序列；b)選擇一個或多個甘油脫氫酶多肽；c)將對應苯丙氨酸的序列號第3號位置245的胺基酸改變成絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺，及/或將對應序列號第3號位置121天冬氨酸的胺基酸改變成天冬酰胺或谷氨酰胺，以及；d)選擇性的測試被改變的甘油脫氫酶多肽產生乳酸的能力。在一些實施例中，決定在甘油脫氫酶多肽的功能上單體胺基酸取代基的個體影響（在序列號第3號對應位置245的苯丙氨酸或對應位置121的天冬氨酸）。在其他實施例中，決定在甘油脫氫酶多肽的功能上的二個胺基酸取代基的影響（在序列號第3號對應位置245的苯丙氨酸或對應位置121的天冬氨酸的取代）。[0051]在本發明的另一實施形態中，變體甘油脫氫酶多肽相較于親甘油脫氫酶多肽而具有改變的底物特異性及/或改變的活性。具體來說，變體甘油脫氫酶多肽可以被用于產生D-乳酸（D-乳酸）。本發明的該實施形態的一個實施例提供包含序列號第1號的多肽，或催化D-乳酸形成或具有D-乳酸脫氫酶活性的其中片段。[0052]最后，"包含"、"以…組成"或"實質上以…組成"等術語是根據它們的標準涵義而定義。這些術語可以為了附接相互關聯的特定術語而在整篇申請書中以另一個取代。詞組"隔離"或"生物學純度"是代表原料實質上或本質上不具有在其原生狀態中被發現時通常伴隨原料的成分。因此，根據本發明的被隔離肽類優選地不含有正常相關于在其原位（insitu)環境中的肽類的原料。[0053]在這里所討論的實施例及實例應被理解為僅用于說明的目的，且依照其的各種修改或變化本領域中的普通技術人員將提出而包含在本申請書的精神及范圍以及所附權利要求書的范疇內。另外，在這里所公開任何發明或其中實施例的任何要素或限制可以與任何及/或所有的其他要素或限制（單一的或任何組成）、或在這里所公開的任何其他發明或其中實施例、以及考慮在本發明的范疇而不限制其的該類組成進行組合。[0054]在這里所提及或引用的所有專利、專利申請書、臨時專利申請書以及公告書應整體合并于本文中作為參考，包含所有的附圖和表格，它們與本發明說明書的明確教導不會不相符。[0055]以下是說明實施本發明的程序的實施例。這些實施例不應被解釋成限制。除非另有說明，否則所有的百分比是基于重量且所有的溶劑混合物比例是基于體積。[0056]實施例1原料及方法細菌菌株及質粒在該研究中所使用的細菌菌株、質粒及引物列出在表3及表4中。凝結芽孢桿菌菌株P4-102B使用作為前文所述的野生型菌株（17)。質粒pGK12在一些革蘭氏陽性細菌及大腸桿菌（30,31)中進行復制且其復制自然受限制于溫度彡42°C。質粒pGK12在50°C進行復制的這種溫度敏感性質提供選擇凝結芽孢桿菌的染色體DNA整合體可在50-55°C生長的機會介質及成長條件生長及發酵的條件已在前文討論（15,21-23)。如所需要的，培養基在pH值5.0或7.0的L-培養液（LB)中生長。在接種前加入無菌葡萄糖。[0057]在凝結芽孢桿菌中的基因刪除凝結芽孢桿菌的刪除突變體的建構是根據前文所述的方法（32)。使用質粒pGK12作為用于刪除建構（deletionconstruction)而傳輸DNA到凝結芽孢桿菌的第一載體。各細胞中的質粒在37°C的群體中的存在（109CFUπιΓ1)幫助解決了質粒DNA進入該細菌的低轉形效率，而在50?55°C生長而消除質粒時群體中染色體整合體得以輕易辨識。[0058]代謝進化通過在小型pH-控制發酵槽中在指定條件下依序傳代培養進行代謝進化。如生長允許的，每1?3天進行依序傳繼（2%接種體；v/v)。[0059]酶測定培養生長（在pH-控制發酵槽中的LB-葡萄糖介質）成為中期指數期，收獲并如前文所述用于酶測定（23)。來自菌株QZ19的甘油脫氫酶使用差分硫酸銨沉淀而被純化，接著通過陰離子交換和疏水相互作用層析。甘油脫氫酶（GlyDH)及甘油脫氫酶（GlyDH*)也被N-末端His-標記酶純化（33)。甘油脫氫酶及乳酸脫氫酶（LDH)使用標準方法被測定（34，35)。[0060]分析方法如前文所述，葡萄糖及發酵產物通過高效液相色譜法（HPLC)進行測定（36)。D型（-)及1^型（+)乳酸的光學異構物通過!^(：(〇^1^3126(0)-青霉胺柱；150\4.6111111，5微米；菲羅門（Phenomenex)公司）使用2mM硫酸銅作為流動相進行測定，并使用D-乳酸脫氫酶(西格瑪（Sigma)化學公司，密蘇里州圣路易斯）。[0061]在凝結芽孢桿菌中的乳酸脫氫酶基因凝結芽孢桿菌菌株P4-102B典型地以D-異構物（表1)低的（15,17)或無法偵測的程度產生L-乳酸。使用所詮釋的關聯凝結芽孢桿菌菌株36D1的基因組序列（基因庫號碼CP003056)作為引導物，在菌株P4-102B中編碼L-乳酸脫氫酶（ldh)及D-乳酸脫氫酶(ldhA)活性二者的同源基因通過反轉錄聚合酶連鎖反應（PCR)放大并通過測序而確認。在菌株P4-102B中編碼D-乳酸脫氫酶的基因也通過其抑制大腸桿菌突變株（ldhA，pflB)的厭氧生長缺陷的能力而確認，接著將對應復制的ldhA基因進行測序。通過適當的刪除以阻止競爭性途徑（圖1)，該有機物具有僅使用內源基因生產D型（-)乳酸或L型（+)乳酸的潛力。[0062]自然L型（右旋）乳酸脫氫酶（ldh)及乙酰乳酸合成酶（alsS)基因的刪除凝結芽孢桿菌菌株P4-102B在pH值5.0下以少量乙酸乙酯和乙醇混合產生L-乳酸作為第一發酵產物（表1;圖6)。編碼L型⑴乳酸脫氫酶（L-LDH)(菌株QZ4)的ldh基因的刪除使用發展用于凝結芽孢桿菌的方法消除NADH氧化反應的主要途徑，減緩生長反應以及糖的代謝。然而，伴隨D型（-)乳酸的少量增加而大幅增加2,3-丁二醇的產物（表1;圖6)。在pH值7.0,有關菌株36D1的ldh變體的發酵作用的第一產物是如同前面看過的乙醇（23)。[0063]通過刪除乙酰乳酸合成酶（alsS)而進一步修改菌株QZ4,對2,3-丁二醇產物來說是必要的（圖1)。所得的菌株（QZ5)在pH值7.0下以乙醇、乙酸及甲酸迅速代謝葡萄糖作為第一產物（表1)。在該菌株并在該pH值下，流通D-乳酸的丙酮酸僅約為全部分量的5%。然而，當培養在pH值5.0的相同介質中時，菌株QZ5在無氧條件下不會生長。菌株QZ5在pH值5.0下的發酵特性通過在氣相中以空氣開始培養以支持生長而被測定。由于細胞密度的增加，啟動了介質中的氧氣的消耗并維持細菌的無氧代謝作用。菌株QZ5在限制氧氣相（0.9mm〇leSPgcells，期間pH值5.0下消耗葡萄糖的特定速率約為相似條件下pH值7.0培養基（5.9mmolesPgcells4)的15%。低于特定葡萄糖的消耗速率的6倍且甲酸滴度（表1)表明丙酮酸甲酸裂解酶（PFL)活性會在pH值5.0下限制菌株QZ5的厭氧生長。菌株QZ5也具有較高的D-LDH活性及相較于菌株QZ4而對應增加ldhAmRNA(表2)。然而，無論培養pH值，在QZ5培養液中D型（-)乳酸滴度僅約為10mM，每個葡萄糖代謝乳酸的產率<0.15(理論上每個葡萄糖的產率為2)。[0064]由于二倍突變體產生顯著數量的甲酸及其他PFL活性的產品，建構缺少PFL的三倍突變體。然而，缺少L-LDH、ALS及PFL活性的該三倍突變體未能在厭氧性的所有測試條件下生長且沒有進一步的研究。[0065]以生長為基礎的選擇增加D型（_)乳酸產品糖代謝、ATP產品及厭氧生長顯然在菌株QZ5中受到限制，尤其在pH值5.0下，通過用于NADH氧化的不充足途徑（表1;圖1)。在L型（+)乳酸生產期間，預期增加通過菌株QZ5產生的D型（-)乳酸的程度到相似于親代的程度以恢復二倍變體的厭氧生長。以生長為基礎的代謝進化是用于選擇優勢變體（24)的有力工具但是這需要合適選擇的設計。由于菌株QZ5在pH值5.0下產生低程度的PFL活性，通過相關甲酸濃度在培養液中的測定（表1)，該菌株在該pH值用于厭氧生產的代謝進化提供共同選擇增加D乳酸的產品的途徑。[0066]菌株QZ5在LB+葡萄糖發酵中在pH值5.0下為了較高細胞產量的代謝進化在選擇113天之后得到具提升成長的衍生物。該菌株（QZ13)的細胞產量高于野生型，以20倍增加D型（-)乳酸的產品（表1;圖7)。為進一步增加D-乳酸的產率及滴度，進一步在LB+葡萄糖發酵中在pH值7.0下用碳酸鈣演化菌株Q13。將碳酸鈣添加到介質中已顯示于前文以解決凝結芽孢桿菌發酵作用的乳酸抑制并允許滴度在補料分批發酵中接近2M(22)。由于碳酸鈣固體對介質的緩沖效果在pH值7.0比在pH值5.0還好，進一步的代謝進化在該較高的pH值。在選擇的42天之后，菌株QZ14被隔離并測試。以菌株QZ14,D型（-)乳酸代表總量90%以上的發酵產物以及發酵葡萄糖的88%的產率（表1)。[0067]菌株QZ15隨著增加葡萄糖濃度在pH值7.0下移植傳代（serialtransfers)額外60天之后被隔離（圖7及8)。菌株QZ15在pH值7.0的D型㈠乳酸滴度很接近于72小時內1M(表1)。使用lOOgl^HO.56M)的葡萄糖的菌株QZ15的連續代謝進化導致進一步增加流通到乳酸的葡萄糖。菌株QZ19在傳代的63天之后被隔離（圖8)且該菌株在48小時內在pH值7.0下生產約1.0M的D型㈠乳酸（表1)。通過菌株QZ19在pH值5.0下進行的葡萄糖發酵在72小時內的1.1M乳酸的滴度的短期延遲后開始（圖2)。在生產高程度乳酸的菌株QZ15和QZ19的發酵培養液中未偵測到甲酸。由于這些菌株缺少甲酸氫裂解酶活性，因此甲酸是PFL活性的指標。通過菌株QZ19而產生的少量乙醇和乙酸（<5%的葡萄糖碳）大多是衍生自通過丙酮酸脫氫酶復合產生的乙酰輔酶（acetyl-CoA)(25)。[0068]該結果顯示以代謝進化結合的ldh與alsS基因的刪除導致了凝結芽孢桿菌的第一發酵產物從L型（+)乳酸改變成D型（-)乳酸。雖然pfl基因仍然存在并以比較于菌株QZ4的程度（約全部RNA的1.2ngπιΓ1)而轉錄在菌株QZ19中，通過不存在于發酵培養液中的甲酸而使流通到PFL的葡萄糖如所見為最少的。這顯然是將任何流通PFL到乙酰輔酶的丙酮酸在根據生長的選擇期間進行取代而增加D-乳酸的代謝通量的結果（表1)。[0069]產生菌株QZ19的D-乳酸的發酵性質菌株QZ19在葡萄糖的pH值5.0的補料分批發酵中產生接近于2M的D-乳酸（圖9)。在該補料分批發酵中，雖然生產乳酸的速率在該相期間是線性的，首批l〇〇gΡ(0.56Μ)的葡萄糖在約50小時內被發酵而第二批100g1^(0.56Μ)的葡萄糖的發酵則需要額外的72小時。菌株QZ19也在短暫遲滯后將木糖發酵成D-乳酸。大約80g1^(0.53M)的木糖在72小時內依重量百分率為90%的產率被轉化成D型（-)乳酸（圖10)。[0070]纖維素通過菌株QZ19而同時糖化和發酵（SSF)成D-乳酸使用凝結芽孢桿菌作為產生乳酸的微生物催化劑的其中一個優點就是由于符合優化的商業纖維素活性（50°C及pH值5.0)的較高的操作溫度以及較低的pH值，以減少裝載于纖維素的SSF至乳酸的纖維素酵素（14,15)。以約7.5FPU(g纖維素Γ1的結晶纖維素作為原料的菌株QZ19達到最高的D-乳酸的體積生產率（圖3)。利用該酵素的裝載，典型乳酸細菌的乳酸球菌（Lactococcuslactis)在40°C下的產量僅為菌株QZ19的1/3。這個結果符合先前關于為通過比較于其他乳酸細菌未改變的凝結芽孢桿菌而進行優化L-乳酸的生產而減少纖維素需求的研究（21)。菌株QZ19更佳地適合用于纖維素成D-乳酸的SSF并且對於具成本效益的這種非食品碳水化合物的代謝需要顯著較低程度的纖維素。[0071]在菌株QZ19中作為D型（_)LDH活性的來源的甘油脫氫酶的辨識菌株QZ19的無細胞萃取在野生型凝結芽孢桿菌未具偵測到D-LDH活性時具有D型（-)乳酸脫氫酶活性（每毫克蛋白質〇.2單位）（表2)。比較于菌株QZ5在菌株QZ19中所觀察到的D-LDH的活性以30倍增加，無關于被確定為編碼D-LDH的ldhA基因的mRNA以1.3倍增加。為了確定可能掌控異常高的D-乳酸脫氫酶活性的D-LDH蛋白質中的潛在變體，自菌株P4-102B及QZ19將ldhA和兩側DNA進行比對。然而，序列皆相同表示出編碼D-LDH的ldhA與D型（-)乳酸生成在菌株QZ19中的大量增加無關。僅ldhA的單體復制也在菌株QZ19和P4-102B的染色體中被發現，消除基因復制成用于D型（-)乳酸生產的潛在基礎。該結論被進一步地通過比較菌株QZ19的ldhAmRNA程度以及其前代親代，菌株QZ5而被支持（表2)。在這些菌株中比較于野生型的較高程度的ldhAmRNA可導致由菌株QZ5和其他發展的菌株生產的少量D型（-)乳酸，但無法解釋在菌株QZ19觀察到的高D乳酸滴度及產量。在親代的第一發酵途徑，在菌株QZ19中最高程度的ldhAmRNA(D-LDH)僅為約10%的編碼L型（+)-LDH的ldhAmRNA的程度（圖1;表2)。這些結果建議具D-LDH活性的另一個酵素存在于菌株QZ19中促成高D-乳酸滴度。[0072]從菌株QZ13到QZ19的無細胞萃取（明顯分子質量為37KDa)含有不存在于野生型菌株P4-102B中以及前代菌株QZ5中的豐富蛋白質（圖4)。在這些菌株的萃取中的這些蛋白質被計算有代表全部蛋白質的11%。具有D-LDH活性的蛋白質從菌株QZ19被純化。該被純化的蛋白質的大小，37KDa，是可比較于演化菌株中發現的新豐富蛋白質。在具有D-LDH活性的蛋白質的胰蛋白酶消化之后，通過LC-MS/MS隔離片段并確認。產生的22個肽中，9個相同于從凝結芽孢桿菌菌株36D1基因組（Bcoa_1919;登錄號AEP01106.1)中的蛋白質預測的胰蛋白酶肽，通過比較序列分析（26)而確認為甘油脫氫酶（gldA)(圖11)。根據凝結芽孢桿菌菌株36D1的gldA基因序列，菌株P4-102B及QZ19的gldA基因被增幅、復制并測序。比較于原生基因，來自菌株QZ19的gldA基因具有兩處變異：G361A及T734C。這些二個變異導致胺基酸的改變，D121N及F245S及等位基因被指定為gldAlOl且蛋白質為甘油脫氫酶（GlyDH*)(圖12)。除了在編碼區中的這些二個變體之外，1821bp的DNA片段被發現為插入QZ19中gldA基因的上行-62(在ATG中作為+1的"A"）（圖5)。二個ORFs被確認在該插入件中（長度中的103及232胺基酸），皆相似于來自瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus)菌株H10(25%相同及48%相似）的假定轉座子（ISLhel5)(27)。[0073]從菌株QZ19在SDS-PAGE凝膠中對應于37KDa蛋白質的純化蛋白質同時具有氧化甘油及還原丙酮酸的活性。GDH活性（甘油氧化成二羥基丙酮）為每毫克蛋白質1.2單元(ymolemirT1)且丙酮酸還原成D-乳酸活性為每毫克蛋白質0.8單元。從大腸桿菌重組體純化的原生酵素具有每毫克蛋白質7.1單元的甘油脫氫酶活性及0.01單元的LDH活性。這些結果建議在凝結芽孢桿菌基因組中的甘油脫氫酶在菌株QZ19進行代謝進化的期間通過二個變異獲得D-LDH活性。該蛋白質的表達的高程度顯然是由于上行轉座子的插入所致。[0074]來自菌株QZ19的甘油脫氫酶（GlyDH*)在大腸桿菌中產生D-LDH活性為了確認在菌株QZ19中編碼D-LDH活性的gldAlOl等位基因，基因從菌株QZ19被復制（質粒PQZ115)且引入大腸桿菌菌株AH242。由于在糖酵解期間消除了氧化所產生的NADH的能力的ldhA及pflB中的變異，大腸桿菌菌株AH242是負厭氧的（anaerobicminus)(25)。菌株AH242的厭氧成長通過具D型（-)乳酸的質粒pQZ115作為發酵產物而恢復。攜帶缺少C-末端10胺基酸的甘油脫氫酶（GlyDH*)的質粒pQZ109的菌株AH242不進行厭氧生長，表示該蛋白質的截短缺少形式缺少D-LDH活性。該結果建立從凝結芽孢桿菌菌株QZ19的甘油脫氫酶（GlyDH*)具有D型（-)-LDH活性。[0075]為了進一步確認從菌株QZ19的gldAlOl編碼具D-LDH活性的蛋白質，基因從菌株QZ19(質粒pQZl13)進行復制并為蛋白質的純化而以N-末端His-標記而于重組大腸桿菌表達。重組甘油脫氫酶（GlyDH*)也具有甘油脫氫酶及D-LDH活性。具甘油及NAD+的酵素的特定活性為每毫克蛋白質〇.68單元。利用丙酮酸及NADH作為底物（LDH反應），蛋白質的特殊活性為非預期的高的每毫克蛋白質6.9單元且反應產物通過HPLC被確認為D-乳酸。在逆反應中，酵素僅在D型（-)乳酸及NAD+作為底物時呈活性（每毫克蛋白質0.17單元的特殊活性）。具L型（+)乳酸活性作為底物為不可偵測的。[0076]這些結果顯示在菌株QZ5的代謝進化期間，原生甘油脫氫酶獲得D-LDH活性。來自嗜熱脂肪芽孢的原生甘油脫氫酶據稱缺少LDH活性（28)，且與其相符，從重組大腸桿菌純化的凝結芽孢桿菌原生甘油脫氫酶的LDH活性低于甘油脫氫酶活性的0.15%。[0077]通過DNA插入于D-乳酸產生菌株而提升gldA轉錄除了酶為D-LDH的進化外，gldAlOl在菌株QZ19中的表達程度在這項研究所分析的基因中是最高的（表2)。在轉錄中的提升顯然是由于為促進gldAlOl表達將1821bp的DNA插入于于演進菌株的強啟動子的gldAlOl基因的上行（圖5)。[0078]雖然對應于沙恩-達爾加諾（GGAG)及-10區域（TATGAT)的共識序列可在野生型的gldA基因的上行DNA進行確認，卻無法辨別對應的-35區域。以6個堿基對莖和11個堿基環的反向重復在投射-35區域被發現，表示該基因的表達僅為中等的，最多在原生菌中，插入于菌株QZ19中的gldA基因的上行區域1821bp序列引入共識-35序列到gldA(圖5)。gldA基因和⑶H*蛋白質在菌株QZ19(表2)的高程度表達顯然是由于該菌株QZ13中gldA上行區域的重建及其衍生物產生強啟動子。[0079]乳酸產物于菌株QZ19的進化途徑顯然有三個開創性的事件發生于凝結芽孢桿菌菌株QZ5到菌株QZ19的進化途徑中，在約48小時以內產生超過90克的D-乳酸；在甘油脫氫酶中的二處變異（D121N及F245S)以及在gldAlOl的啟動子結構中通過插入而致使改變。在進化途徑中的各種中間產物菌株的DNA序列分析顯示轉座子DNA的插入首先發生于菌株QZ13中。該符合菌株QZ13中的gldAmRNA及甘油脫氫酶的提昇程度（分別為約100倍及50倍的菌株QZ5的程度）以及其他這種菌株的衍生物（表2)。在菌株QZ13中的較高的甘油脫氫酶活性也導致了D-LDH活性的輕微增加。然而，在該菌株中D-LDH到甘油脫氫酶活性的比率僅為0.003,表示甘油脫氫酶仍缺少重要的D-LDH活性。第一甘油脫氫酶變體（F245S)在提升gldA的轉錄后在菌株QZ15中被偵測到，且該變體顯然提升了約7倍的D-LDH/甘油脫氫酶的比率而到0.02(表2)。第二變體（D121N)發生在從菌株QZ15進化的菌株QZ19期間，且該第二變體提升了約10倍的D-LDH/甘油脫氫酶的比率而增加到0.22。值得注意的是，由于D-LDH活性的增加，酵素失去其部分的甘油脫氫酶活性。在菌株QZ19中由于二個變體（QZ19對QZ14)增加10倍的酵素的D-LDH活性而從菌株QZ14減少了約7倍的甘油脫氫酶活性（表2)。在菌株QZ19的萃取物中甘油脫氫酶活性中的這些損失顯然不是由于在細胞中較低的蛋白質程度，因為該蛋白質帶仍然大約占了整體蛋白質的11%(圖4)。[0080]在菌株QZ19的甘油脫氫酶中的變體發生在九個形成深口袋的關鍵胺基酸中的二個，其中從嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus)與酵素中的NAD+的煙酰胺環的結合（29)。凝結芽孢桿菌的甘油脫氫酶的模型也顯示了在具突變胺基酸于邊緣中的酵素二域之間的深裂（圖13)。甘油C1及C3被報告為通過凡得瓦力交互作用于Phe247的芐基環而穩定于嗜熱脂肪芽孢桿菌甘油脫氫酶中。預計消除該作用而改變對應的凝結芽孢桿菌甘油脫氫酶的Phe245為絲氨酸導致了所觀察到的從菌株QZ19的酵素的甘油氧化活性的減少。Asnl21及Ser245可能通過與丙酮酸的C1與C2(圖13)的作用而使丙銅酸穩定于活性位點，導致了觀察到的LDH活性。[0081]這些結果顯示了甘油脫氫酶通過二個變體的gldA的表達程度及D-LDH活性的獲得的增加有關于在凝結芽孢桿菌菌株QZ19發酵作用的D-乳酸滴度的增加（表1)。[0082]原生物的生物化學性質及從凝結芽孢桿菌變體的甘油脫氫酶的各種變體形式在產生凝結芽孢桿菌衍生物（菌株QZ19)的D-乳酸的發展過程期間，具有二變體(D121N及F245S)的甘油脫氫酶（GDH)發展成催化還原丙酮酸為D-乳酸（表1和圖7)。產生顯著D-乳酸滴度的第一衍生物，菌株QZ15,搭載在位置245改變胺基酸苯丙氨酸成為絲氨酸的單體變體。當菌株QZ15被進一步選擇用于較高的乳酸生產率時，GDH蛋白質獲得在胺基酸位置121(D121N)的第二變體（圖15)。這二個變體的結合導致了菌株QZ19在pH值5.0及50°C的pH值控制的發酵作用中于48小時內以接近100g/L的滴度而產生D-乳酸。為了評估這二個變體各別在丙酮酸還原成D-乳酸的催化反應中所扮演的角色，具有二個取代基（D121N或F245S)的GDH/LDH酵素及具有雙重改變的蛋白質在大腸桿菌純化中表達，并決定其生物化學性質。[0083]原生⑶Η在約22.5單元（μmolemirT1.mg蛋白質的特定活性在55°C使甘油氧化（表5)。該酵素的特定活性從室溫的約8.6單位增加到用于活性的55°C的最佳溫度的約22.5單位，那也是用于凝結芽孢桿菌的優化生長溫度。原生酵素的GDH活性在約20mM甘油中呈飽和，符合用于該酵素的11.7mM甘油的表現Km(圖16;表6)。[0084]該原生酵素也將多個其他底物進行氧化（表5)。雖然具有乙烷-1，2-二醇和丙烷-1，2-二醇的活性的程度是顯然低于具有甘油的活性，具有2,3-丁二醇的特殊活性幾乎是2倍高于甘油氧化的速率。1，2-丁二醇和1，3-丁二醇同時作為用于原生酵素的底物。這些結果顯示從凝結芽孢桿菌的GDH酵素具有較廣的底物特異性。雖然該酵素表現丙酮酸還原活性（D-LDH)，該活性仍小于甘油氧化活性（LDH到⑶Η活性的比率0.013)的1.5%。除了減少丙酮酸以外，該酵素也具有非常少但可偵測的2-氧代丁酸還原（到2-羥基丁酸）活性的程度。該酵素的低丙酮酸還原活性可以歸因于非常高的于丙酮酸的表觀Km(lM;約高于用于甘油的100倍）（表6)。原生酵素在以NAD+作為電子接收子于氧化甘油的效率上約為使用NADH還原丙酮酸的1000倍。[0085]凝結芽孢桿菌菌株QZ15、菌株QZ5的衍生物、在55°C發酵葡萄糖并約在72小時內產生約80g/L的D-乳酸。在該菌株中GDH進行胺基酸的改變，苯丙氨酸到絲氨酸，在位置245(圖7)。該改變顯著的改變了LDH到GDH的比率，從GDH活性中具有最小還原力用于原生酵素的〇.01為〇.16(表5;圖15)。除了獲得顯著丙酮酸還原活性（LDH)外（圖16)，該酵素的F245S形式比較于原生酵素也具有1，2-丙二醇和1，2-丁二醇作為底物的較高活性(表5)。在F245S酵素的GDH及LDH活性的這些變異可歸因于用于甘油的表觀Km的增加(78.6mM比較于為原生酵素的值11.7)以及為丙酮酸的表觀Km中的還原（0.23M對用于原生酵素的1.0M)(表6)。[0086]根據選取凝結芽孢桿菌菌株QZ15的進一步生長及發酵導致菌株QZ19在pH值5.0及55°C下約48小時內產生接近100g/L的D-乳酸。從該菌株的⑶Η酵素攜有第二變動，除了F245S的D121N。具有該改變的GDH單獨顯著具有以甘油及其他測試二醇的較低活性(表5)。用于甘油的表觀Km的輕微增加無法解釋大約為7倍的特定活性的還原（表6)。雖然D121N變體減少甘油氧化活性，相較于原生酵素，該改變于在酵素的丙酮酸還原活性上（D-LDH)不具有可偵測的效果。[0087]D121N變體在甘油的氧化及其他二醇上的負面效果會殘留，即使是在該變體從酵素被引入于F245S中。具有二改變（F245S及D121N)的酵素具有相較于原生酵素0.01的值約1.8的LDH/⑶Η活性比率（表5)。D121N的變體也減少用于丙酮酸的表觀Km，從單具F245S的變體對酵素的231mM到具二改變的對酵素的51mM(表6)，更高催化效率的首要原因可能是具丙酮酸作為底物。這些結果顯示這二種改變對于酵素作用于為發展生產D-LDH的菌株QZ19中的D-LDH中皆是很重要的。F245S變體在D121N變體大幅減少蛋白質的⑶Η活性時，增加酵素的D-LDH活性而進一步增強D-LDH活性。[0088]根據從嗜熱脂肪土芽孢桿菌屬（Geobacillusstearothermophilus)(29)⑶Η的結晶結構，和凝結芽孢桿菌GDH胺基酸序列有47%相符，天冬氨酸在位置121處形成氫鍵與氧在甘油的C2位置上。在甘油的C2位置的該第二乙醇（H-C-0H)是在甘油進行氧化成二羥基丙酮時被氧化成C=0。該天冬氨酸改變為天冬酰胺顯然最小化與底物甘油的交互作用。另外，當C2-0與D121反應時，在245的苯丙氨酸被期望與甘油的C1及C3反應。以絲氨酸取代苯丙氨酸可最小化酵素與底物甘油的交互作用，且可導致在酵素的這些修改形式中觀察到較高的表觀Km。然而，這些觀察無法預測到F245S單體或與D121N將支持⑶Η酵素與作為底物的丙酮酸的交互作用且修改的酵素將作為D-LDH。[0089]這些結果推測原生酵素的確是具廣底物特異性的多元醇脫氫酶。具各種耦合其嗜熱特性（優化55°C)的短鏈二醇的F245S酵素的較高活性使這些酵素有助于各種二醇及多元醇的生物轉化作用以對應具立體選擇性的酮類。舉例而言，1，3-丁二醇可被氧化成4-羥基-2-丁酮，為化學產業近期生產的具潛在商業利益的藥物中間產物。[0090]表1在50°C下的凝結芽孢桿菌衍生物到D型（-)乳酸產物的路徑上的發酵作用概況。【權利要求】1.一種隔離的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脫氫酶的序列，其中苯丙氨酸被選自絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代，和/或天冬氨酸被選自谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述苯丙氨酸對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸，且所述天冬氨酸對應于序列號第3號的位置121。2.如權利要求1所述的隔離的多肽，其特征在于，所述的多肽包含序列號第1號。3.如權利要求1所述的隔離的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脫氫酶的序列，其中苯丙氨酸被選自絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述苯丙氨酸對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸。4.如權利要求1所述的隔離的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脫氫酶的序列，其中天冬氨酸被選自谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述天冬氨酸對應序列號第3號的位置121。5.如權利要求1所述的隔離的多肽，其特征在于，所述多肽包含甘油脫氫酶的序列，其中：對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被絲氨酸所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被蘇氨酸所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被蘇氨酸所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被天冬酰胺所取代；對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被甘氨酸所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被甘氨酸所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被天冬酰胺所取代；對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被天冬酰胺所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被天冬酰胺所取代，并且對應于序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被天冬酰胺所取代；所述多肽中僅有對應于序列號第3號的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被選自于絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代；或所述多肽中僅有對應序列號第3號的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被選自于谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代。6.-種組成物，其特征在于，所述的組成物包含攜帶體及如權利要求1-5任一項所述的多肽。7.-種隔離的核酸，其特征在于，所述的核酸包含編碼如權利要求1-5任一項所述的多肽的多核苷酸。8.-種載體或基因架構，其特征在于，所述的載體或基因架構包含如權利要求7所述的多核苷酸。9.一種隔離的微生物細胞，其特征在于，所述的微生物細胞以如權利要求7所述的核酸進行轉形。10.如權利要求9所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述微生物細胞包含含有如權利要求7所述的多核苷酸的載體或基因架構。11.如權利要求9至10所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述微生物細胞是革蘭氏陰性細菌細胞或革蘭氏陽性細菌細胞。12.如權利要求11所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述革蘭氏陰性細菌細胞是選自由埃希氏菌屬、發酵單胞菌屬、不動桿菌屬、葡萄糖酸桿菌屬、地桿菌屬、希瓦氏菌屬、沙門氏菌屬、腸桿菌屬或克雷伯氏菌屬的細菌細胞，并且所述革蘭氏陽性細菌是選自芽孢桿菌屬、梭菌屬、棒桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、酒球菌屬、鏈球菌屬及真細菌細胞屬的細菌細胞。13.如權利要求9至10所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述微生物細胞是大腸埃希氏菌或產酸克雷伯菌。14.如權利要求9至10所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述微生物細胞選自嗜熱厭氧菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬或土芽孢桿菌屬。15.如權利要求9至10所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述微生物細胞是選自念珠菌屬、漢遜酵母、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或耶氏酵母屬細胞的酵母細胞。16.如權利要求15所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述的酵母細胞是乳酸克魯維酵母/aciis)、卡爾酵母釀酒酵母cereFisiae)、糖化酵母斯酵母)、克魯維酵母^/w_7F6?ri)、諾地酵母卵形酵母〇Fi/b_r?i5·)或脂耶氏酵母{Yarrowialipolytica)。17.如權利要求9至10所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述微生物細胞是選自支頂頭抱菌C^cr6?o/?i--)、曲霉菌、短梗霉菌、煙管菌屬（5j'6?r^a/7〇fera)、擬錯菌屬（Cferi^orio^is)、金抱子菌屬（CXrj^c^oria?)、鬼傘屬（Cb/Tri/ws)、革蓋菌屬（Cbrio7w5·)、隱球菌、線黑粉酵母屬(filibasidium)、齋J}麗（fusariuni)、腐質霉鳳Ο?ιπ?αο?Μ')、麗H病麗（Magnaporthe')、毛霉菌屬（M/cor)、毀絲霉菌、新考瑪脂霉菌（AfeocaBiffiasiijr)、脈抱霉菌（Afeamspora)、擬青霉菌、青霉菌屬、平革菌屬、射脈菌屬（/%/ev^ia)、瘤胃壺菌屬〇°2>〇?/^(95·)、蛇燕屬（/VewoiiAs)、裂裙菌屬籃狀菌屬嗜熱子囊菌屬（?6?τ?ο<35·--?5·)、梭孢殼菌屬（?ie/an'a)、彎頸霉屬（7b/_7/7〇c/at/iw?)、栓孔菌屬（7>a?e?es)或木霉細胞(7>icAoofe/macell)的真菌細胞。18.如權利要求17所述的隔離的微生物細胞，其特征在于，所述真菌細胞是泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、構巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉（Aspergillusniger)、米曲菌（Aspergillusoryzae)、黑刺煙管菌（（Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡蓋爾擬錯菌(Ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬錯菌（Ceriporiopsisgilvescens)、培寧辛達擬錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、環帶擬錯菌（Ceriporiopsisrivulosa)、淺紅擬錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬錯菌（Ceriporiopsissubvermispora)、貧乏金抱子霉（Chrysosporiuminops)、嗜角質金孢子菌屬（Chrysosporiumkeratinophilum)、勞肯諾溫斯金孢子菌屬(Chrysosporiumlucknowense)、章金抱子菌屬（Chrysosporiummerdarium)、毯金抱子菌屬（Chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金抱子菌屬（Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌屬（Chrysosporiumtropicum)、佐乃特金孢子菌屬（Chrysosporiumzonatum)、灰蓋鬼傘（Coprinuscinereus)、毛革蓋菌（Coriolushirsutus)、桿抱狀嫌抱(Fusariumbactridioides)、禾谷嫌刀菌（Fusariumcerealis)、克地嫌刀菌（Fusariumcrookwellense)、大刀嫌刀菌（Fusariumculmorum)、小麥赤霉病禾谷嫌刀菌屬（Fusariumgraminearum)、禾嫌抱菌（Fusariumgraminum)、異抱嫌抱菌（Fusariumheterosporum)、合歡木德抱（Fusariumnegundi)、尖抱嫌刀菌（Fusariumoxysporum)、網嫌抱菌（Fusariumreticulatum)、粉紅嫌刀菌（Fusariumroseum)、接骨木嫌刀菌（Fusariumsambucinum)、膚色嫌抱菌（Fusariumsarcochroum)、擬枝抱嫌抱菌（Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌（Fusariumsulphureum)、族囊鐮孢菌（Fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮刀菌(Fusariumtrichothecioides)、嫌抱霉（Fusariumvenenatum)、特異腐質霉屬（Humicolainsolens)、柔毛腐質霉屬（Humicolalanuginosa)、米赫根毛霉（Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱霉（Neurosporacrassa)、產紫青霉(PeniciIliumpurpurogenum)、黃抱平革霉（Phanerochaetechrysosporium)、福身寸身寸脈菌（Phlebiaradiata)、杏鮑燕（Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭抱殼霉（Thielaviaterrestris)、長絨毛栓菌（Trametesvillosa)、云芝（Trametesversicolor)、對木霉菌（Trichodermaharzianum)、纖維素分解菌（Trichodermakoningii)、對長梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉（Trichodermareesei)、或綠色木霉菌細胞(Trichodermaviridecell)。19.一種制造D-乳酸的方法，其特征在于，所述的方法包含在允許生產乳酸的條件下于培養基介質中培養如權利要求9-18任一項所述的轉形的微生物細胞。20.-種組成物，其特征在于，所述的組成物包含培養基介質及如權利要求9-18任一項所述的轉形的微生物細胞。21.如權利要求6或20所述的組成物，其特征在于，所述攜帶體或培養基介質組成物包含從生物質、半纖維素生物質，木質纖維素生物質或纖維素類生物質所派生的水解物。22.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述培養基介質包含從生物質、半纖維素生物質，木質纖維素生物質或纖維素類生物質所派生的水解物。23.-種隔離的核酸，其特征在于，所述的核酸包含序列號第56號或tcgagaaaaacttgacacatacCAAAAATAAGTTATGATGGMITGTGCTTGTTATAITTITCAC(序列號第56號的核苷酸84-148)。24.-種隔離的核酸，其特征在于，所述的核酸包含序列號第56號或tcgagaaaaacttgacacatacCAAAAATAAGTTATGATGGAAITGTGCTTGTTATAITTITCAC(序列號第56號的核苷酸84-148)可操作地連接到異源多核苷酸序列。25.-種載體或隔離的宿主細胞，其特征在于，所述的載體或隔離的宿主細胞包含如權利要求23或權利要求24所述的核酸。26.-種組成物，其特征在于，所述的組成物包含二醇和/或多醇以及如權利要求1-5任一項所述的多肽。27.如權利要求26所述的組成物，其特征在于，所述二醇是1，3-丁二醇。28.-種制造4-羥基-2-丁酮的方法，其特征在于，所述的方法包含以如權利要求1-5任一項所述的多肽在導致1，3-丁二醇氧化成4-羥基-2-丁酮的條件下接觸1，3-丁二醇。【文檔編號】C12P7/02GK104204197SQ201280059613【公開日】2014年12月10日申請日期:2012年10月4日優先權日:2011年10月4日【發明者】王慶昭,基爾納升·T.尚穆根,朗尼歐尼爾·英格拉姆申請人:美國佛羅里達大學研究基金會公司