專利名稱：一種室內鑒定草莓是否抗炭疽病的方法
技術領域：
本發明是鑒定草莓品種對草莓炭疽病抗性的一種新方法，屬于植物病害抗性鑒定技術。
背景技術：
炭疽病是目前草莓上的主要病害之一，特別對紅頰、章姬等目前市場上商品性最好草莓品種而言。草莓炭疽病是典型的高溫高濕型病害。病菌以分生孢子在發病組織或病殘體中越冬，次年分生孢子借雨水、操作工具、病葉、病果等傳播。草莓炭疽病主要發生在夏季草莓育苗期及隨后的初秋草莓定植期，嚴重影響到草莓的產量和品質。草莓炭疽病主要為害匍匐莖、葉柄、葉片、托葉、花瓣，最能確認癥狀的部位是匍匐莖。發生危害初始產生紡錘形或橢圓形病斑，當病斑擴展成為環形圈時，病斑以上部分萎蔫枯死，濕度高時病部可見肉紅色黏質孢子堆。該病除引起局部病斑外，還易導致草莓苗整株萎蔫死亡，隨著病情加重，則全株枯死。根莖部橫切面觀察，可見自外向內發生局部褐變。草莓生產中采用匍匐莖無性 繁殖。草莓匍匐莖由新莖的腋芽當年萌發形成，是草莓主要的營養繁殖器官。匍匐莖細長柔軟，節間長。抽生匍匐莖能力強的品種，每棵母株可產生100 150株匍匐莖苗。草莓炭疽病一旦爆發后，基本無藥可治，目前生產上主要采取發病前期藥劑防治，發病后期拔除病株，控害的效果都不理想。因此，針對這一病害最經濟有效的方法是選育抗病品種應用于生產。目前，抗病育種中多使用苗期活體接種鑒定，雖然抗性結果比較準確，但是由于接種后需要高溫高濕條件，使可鑒定時期較短，而且費時事費力，另外也有通過葉片或葉柄離體鑒定，但是效果都不理想，而且也沒有具體的可操作性的規范。由于炭疽病病毒的易擴散性和高危害性，只能在特定隔離的溫室或大棚進行。這些都嚴重影響了草莓品種炭疽病抗性鑒定的效率。
發明內容
本發明的目的是提供一種鑒定草莓品種對草莓炭疽病抗性的新方法。本發明主要服務于針對草莓炭疽病開展抗病品種選育的各種單位，可對抗草莓炭疽病材料進行當代選擇，有利于加快抗病品種的選育。同時該技術還可以在草莓抗炭疽病的遺傳學和轉基因研究工作中作為生物學檢測方法應用，將大大加快研究進程。本發明提供的對草莓炭疽病抗性的鑒定方法，是根據草莓匍匐莖繁殖的特性，采摘植株上抽發的匍匐莖，在可控條件下可以常年進行抗性鑒定，并根據匍匐莖的抗性表現，對整個植株的抗性進行評價。本發明提供一種室內鑒定草莓是否抗炭疽病的方法，該方法包括切取草莓的匍匐莖，切取的長度為8-20厘米的莖段，底部用石臘封住斷面，將頂端斷面浸入搖動的5 X IO5個/ ml的孢子懸濁液中，其中，浸入的深度為5-7厘米。
在一些優選的方式中，當切取的長度為8厘米的時候，浸入搖動的5X IO5個/ ml的孢子懸濁液的深度為5毫米。在一些優選的方式中，當切取的長度為10厘米的時候，浸入搖動的5X IO5個/ ml的孢子懸濁液的深度為6毫米。在一些優選的方式中，當切取的長度為20厘米的時候，浸入搖動的5X IO5個/ ml的孢子懸濁液的深度為7毫米。在一些優選的方式中，把用孢子液體出的匍匐莖放入到放在墊有微濕吸水紙的培養皿內，在人工氣候箱內中使其發病，培養7天后調查病斑長度。優選的，人工氣候箱內90%以上的濕度保濕48小時后，然后保持濕度80% ;溫度和光照盡量模擬田間環境變化，條件如下上午 8 00 - 12 :00，溫度 25°C，光照 15001ux ;中午 12 00 — 15 :00，溫度 30°C，光照40001ux ;下午 15 00 - 18 :00，溫度 25°C，光照 15001ux ;晚上 18 00 —第二天上午 8 :00，溫度20°C，黑暗。
在一些優選的方式中，將發病嚴重程度分按照下列的方式進行分級0級無病；I級病斑平均長度≤15 mm ；3級病斑平均長度在15.1 20mm ；5級病斑平均長度在20.1 25_ ；7級病斑平均長度為25.1 30_ ；9級病斑平均長度>30_。有益效果
本方法較傳統的苗期活體鑒定法具有以下優點1、更適用于草莓炭疽病抗性品種的選育和遺傳分析。傳統田間活體鑒定的感病植株往往很快出現死苗，既無法獲得后代子苗，也不利于采集葉片進行分子生物學分析，而本方法由于采用匍匐莖鑒定抗性，草莓植株整體得以保存，因此可進行當代選擇，大大加快了品種選育和遺傳研究的進程。2、鑒定結果的準確性和精確性更高。同樣是因為采用了匍匐莖鑒定，可以每株取多個匍匐莖進行重復試驗，提高了鑒定結果的精確性。而當某一材料因其它因素導致未能鑒定出結果時，也可以通過再次取匍匐莖重新鑒定，提高結果的準確性。3、拓寬了抗性鑒定的時間，增加了鑒定次數。草莓活體植株田間鑒定一般只能在夏季高溫高濕時進行，而本方法的離體室內鑒定可以在草莓有匍匐莖的任何時節多次進行，包括夏季育苗期和冬季結果期。具體實施方法
實施例1、草莓不同品種紅頰、章姬、豐香、甜查理對草莓炭疽病的室內接種鑒定 鑒定方法如下1、接種分生孢子的培養和懸菌液的準備。接種用的草莓炭疽病菌是本發明小組自行從田間發病株上分離的菌株{c. gloeosporioides),這是我國草莓生產上最多見的草莓炭疽病小種(2011年7月取自建德市航頭鎮的紅頰草莓育苗基地，現保存在杭州市農業科學研究院生物所實驗室)。25°C條件下，菌株在PDA培養基上常規培養7天后刮除菌絲，14天后刮取分生孢子堆用無菌水配成懸菌液，濃度調整為5X IO5個/ ml。2、接種植物材料的準備。草莓品種紅頰、章姬、豐香、甜查理。每個草莓品種取苗各50株,移栽到營養缽中，待其抽發出匍匐莖時用如下方法進行匍匐莖離體鑒定。3、接種鑒定從每個品種的田間草莓植株上采集新抽發匍匐莖，每個品種選取匍匐莖，切取長度分別為6cm ,ScmUO cm,20 cm左右的莖段，底部斷面用石臘封住，將頂端斷面浸入搖動的5 X IO5個/ ml的孢子懸濁液中。每個不同長度的匍匐莖浸入孢子懸濁液的深度分別為
6厘米長匍匐莖的深度為I毫米、3毫米；
8厘米長匍匐莖的深度為2毫米、5毫米、7毫米；
10厘米長匍匐莖的深度為3毫米、6毫米、8毫米；
20厘米長匍匐莖的深度為5毫米、7毫米、10毫米。接種后取出，放在墊有微濕吸水紙的培養皿內，在人工氣候箱內中使其發病，調查病斑長度。每個不同的處理選取15個匍匐莖作為處理，并重復3次。在所有以上處理接種后，人工氣候箱內90%以上的濕度保濕48小時后，然后保持濕度80%。溫度和光照盡量模擬田間環境變化，條件如下上午8 00 - 12 :00，溫度25°C，光照15001ux左右；中午12 00 - 15 :00，溫度30°C，光照4000Iux左右；下午15 00 — 18 00，溫度25°C，光照15001ux左右；晚上18 00 一第二天上午8 :00，溫度20°C，黑暗。培養7天后觀察并逐個記載匍匐莖發病的長度，將發病嚴重程度分為如下6級
0級無病；
I級病斑平均長度彡15 mm；
3級病斑平均長度在15.1 20_ ；
5級病斑平均長度在20.1 25_ ；
7級病斑平均長度為25.1 30mm ；
9級病斑平均長度>30mm。調查處理后的發病率和病情指數
發病率(DR) (% )=發病株數/調查株數XlOO ；
病情指數(DI)= [ E (各級發病株數X病級數)/ (最高發病級數X調查株數)]XlOO
品種群體抗病性劃分標準DI=O :免疫；0<DI ( 15:高抗(HR) ；15<DI ( 25:抗(R)；25<DI ( 40:中抗(MR) ；40<DI ( 60:中感(MS) ；60<DI < 80:感(S) ； 80〈DI ( 100 :高感(HS)。4、匍匐莖離體鑒定結果
結果如下表所示，不同的處理獲得不同的抗性結果。表1:匍匐莖離體鑒定結果(匍匐莖長6厘米，浸入深度為I毫米)
權利要求
1.一種室內鑒定草莓是否抗炭疽病的方法，該方法包括切取草莓的匍匐莖，切取的長度為8-20厘米的莖段，莖段底用石臘封住斷面，將頂端斷面浸入搖動的5 X IO5個/ ml的孢子懸濁液中，其中，浸入的深度為5-7厘米。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于當切取的長度為8厘米的時候，浸入搖動的5X IO5個/ ml的孢子懸濁液的深度為5毫米。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于當切取的長度為10厘米的時候，浸入搖動的5 X IO5個/ ml的孢子懸濁液的深度為6毫米。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于當切取的長度為20厘米的時候，浸入搖動的5 X IO5個/ ml的孢子懸濁液的深度為7毫米。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于把用孢子液體出的匍匐莖放入到放在墊有微濕吸水紙的培養皿內，在人工氣候箱內中使其發病，培養7天后調查病斑長度。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于人工氣候箱內的條濕度條件為90%以上的濕度保濕48小時后，然后保持濕度80% ;溫度和光照的條件如下上午8 :00 - 12 :00，溫度 25°C，光照 15001ux ;中午 12 00 — 15 :00，溫度 30°C，光照 40001ux ;下午 15 00 — 18 00，溫度25°C，光照15001ux ;晚上18 00 —第二天上午8 :00，溫度20°C，黑暗。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于該方法還包括對發病程度進行分級，分級的方式如下0級無病；1級病斑平均長度< 15 mm ;3級病斑平均長度在15.1 20mm ；5級病斑平均長度在20.1 25mm ；7級病斑平均長度為25.1 30mm ；9級病斑平均長度 >30mm。
全文摘要
本發明提供一種室內鑒定草莓是否抗炭疽病的方法，該方法包括切取草莓的匍匐莖，切取的長度為8-20厘米的莖段，莖段底用石臘封住斷面，將頂端斷面浸入搖動的5×105個／m1的孢子懸濁液中，其中，浸入的深度為5-7厘米。通過該方法可以快速在室內鑒定出草莓品種是否抗炭疽病，為草莓抗炭疽病的篩選提供一種新的方法。
文檔編號C12Q1/18GK103060422SQ201310001478
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月4日 優先權日2013年1月4日
發明者忻雅, 馬華升, 阮松林, 童建新, 王淑珍, 吳根良, 方獻平, 肖文斐 申請人:杭州市農業科學研究院