流感病毒溫度敏感株關鍵位點的篩選、突變株及其機制的探討的制作方法
【專利摘要】本發明首次從PB1和PB2基因水平上，應用冷獲得性流感病毒A/AA/6/60和A/Leningrad/134/57/17關鍵位點，通過點突變A/PR8病毒株，篩選出新的溫度敏感型突變株：A/PR8/34(H1N1)/PB1-391/581(CGMCCNo.6207)和A/PR8/34(H1N1)/PB1-265/591+PB2-478(CGMCC?No.6206)；本發明從病毒RNA水平和聚合酶活性兩個方面對突變株表型的機制進行了分析；本發明還對篩選的溫度敏感株在細胞和動物水平進行了研究；本發明所述的溫度敏感型流感活疫苗，適應于臨床應用。
【專利說明】流感病毒溫度敏感株關鍵位點的篩選、突變株及其機制的探討
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，本發明具體地涉及溫度敏感型流感病毒突變株A/PR8/34(HlNl)/PB1-391/581 和 A/PR8/34(HlNl)/PB1-265/591+PB2-478 及其構建方法，以及所述突變株的溫度敏感型及減毒表型的研究，并從分子生物學、細胞及動物水平對其進行了分析及篩選，具有臨床應用價值。
【背景技術】
[0002]A型流感病毒是具有高度傳染性的人類和動物病原體。作為一個主要的冬季呼吸道感染，季節性流感仍是發病率和死亡率的重要原因。流感流行伴隨著死亡率的增加。增加的死亡率不僅僅由流感和肺炎引起，也與流感引起的心肺疾病和其他慢性病惡化有關。
[0003]接種疫苗是預防和控制流感的主要戰略。兩種不同類型的疫苗，滅活和活的，目前獲準用于預防季節性流感。三價季節性流感疫苗，每個劑型包含三種病毒(或HA蛋白)，即最有可能在即將到來的流感季節流通的A型H3N2、HlNl及B型流感株。自1945年以來三價滅活流感疫苗(TIV)已被使用。三個減毒活疫苗在2003年通過了美國FDA批準；2009年9月，FDA又批準了一株LAIV鼻內的新型甲型HlNl流感病毒疫苗。
[0004]在美國，冷適應性流感病毒A/AA/6/60(H2N2)是減毒三價季節性流感活疫苗的主要組成。該病毒最初是取喉嚨洗出液于36°C在雞胚腎組織培養，逐步降低溫度到25°C至連續傳代適應。該 病毒復制效率在25°C和33°C，但在溫度超過39°C不能有效地復制；這些表型性狀分別為冷適應(CA)和對溫度敏感的(TS)表型。此外，該病毒在體內減毒(ATT表型)，并僅限于小鼠和雪貂的呼吸道中復制。這些表型是由三個基因(PB1，PB2和NP)段指定的五個突變。
[0005]在俄羅斯有兩株冷適應性流感疫苗，均來自同一 H2N2株A/Leningrad/134/57，已適應25°C雞胚增長。第一株，Len/17,傳代17次，已用于成人。第二，Len/47,傳代47次，并已用于年齡小于16歲的兒童。
[0006]雖然減毒活疫苗已被批準用于人類，但是它的機制還不清楚。病毒RNA聚合酶在感染禽類和人類的流感病毒株中高度保守。我們檢測了聚合酶活性和RNA水平，試圖解釋減毒活疫苗的機制。本實驗選擇突變A/PR8 (HlNl)。通過反式遺傳技術，改良了 PB2和PBl基因，使其獲得溫度敏感和減毒表型。我們的研究建議，這些用于減毒活疫苗制備的突變位點可以用于流感流行株的制備，利于季節性流感的預防。
【發明內容】
[0007]本發明旨在構建一種通用的溫度敏感型流感活疫苗，從而有效地預防流感病毒。
[0008]本發明首次從PBl和PB2基因水平上，基于A/AA/6/60 (H2N2)和A/Leningrad/134/57/17關鍵位點信息去構建新的溫度敏感型流感突變株。
[0009]本發明所述的流感病毒活疫苗，其在PBl和/或PB2基因中包含與A/AA/6/60 (H2N2)和A/Leningrad/134/57中的突變位點相似的突變位點。
[0010]本發明的優選實施例中，篩選出溫度敏感株具有溫度敏感型和減毒表型。
[0011]本發明的優選實施例中，上述的敏感株突變位點基于A/AA/6/60(H2N2)和A/Leningrad/134/57的突變位點信息選擇。
[0012]本發明的優選實施例中，上述的敏感株是基于A/PR8改造的，八質粒系統A/PR8由倫敦大學的Dr Kenth Gustafsson饋贈,本實驗室按照常規方法包裝,該病毒株目前很多實驗室都在使用，許多文獻都有報道，例如Jin H，Lu B，Zhou H，Ma C，Zhao J，et al.(2003)Multiple amino acid residuesconfer temperature sensitivity to human influenzavirus vaccine strains (FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60.Virology 306:18-24.。2005年Hoffmann等建立了使用雙向轉錄表達載體的8質粒系統，在同一個模板(載體上)實現vRNA的轉錄和病毒蛋白的表達。在這種表達載體中，把編碼—嫩的(^嫩正向克隆至？0111啟動子(從人巨細胞瘤病毒CMV啟動子衍化而來)和終止序列(牛生長激素Poly(A)信號aIIBGH)之間，在此表達盒之間還反向插入了人pol I啟動子(P I h)和鼠pol I終止序列(t I)。8個基因片段cDNA分別克隆后轉染真核細胞，在同一個模板上由pol I控制合成負鏈vRNA，由polll控制合成正鏈mRNA并表達蛋白質。該技術已是一成熟的流感病毒包裝技術并被廣泛應用。以A/PR8作為減毒株，通過對其關鍵位點的突變，我們成功獲取了兩株溫度敏感型流感病毒突變株:A/PR8/34 (HlNl)/PB1-391/581和A/PR8/34 (HlNl) /PB1 -2 65/591+PB2-478,所述兩株溫度敏感型流感病毒突變株已于2012年6月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101)，A/PR8/34(HlNl)/PB1-391/581 的保藏號為 CGMCC N0.6207, A/PR8/34 (HlNl)/PB1-265/591+PB2-478 的保藏號為CGMCC N0.6206。上述兩株溫度敏感型流感病毒突變株在本發明中還分別簡稱為PB1-391/581 和 PB1-265/591+PB2-478。
[0013]從下表3可以看到，以往文獻報道至少需要4個以上突變位點才能檢測到溫度敏感表型，而A/PR8/34 (HlNl) /PB1-391/581只需要突變兩個位點即可。而A/PR8/34 (HlNl) /PB1-265/591+PB2-478是首次在A/PR8病毒株上進行突變并獲得相應的溫度敏感株。以上突變位點為溫度敏感及減毒株的制備提供了依據。
[0014]表1.A/PR8/34 (HlNl)/PB1-391/581 突變株的突變位點
【權利要求】
1.以A/PR8為骨架構建的溫度敏感型流感病毒突變株:A/PR8/34(HlNl) /PB1-391/581和A/PR8/34 (HlNl)/PB1-265/591+PB2-478，其中溫度敏感型流感病毒突變株A/PR8/34 (HlNl)/PB1-391/581的保藏號為CGMCC N0.6207，溫度敏感型流感病毒突變株A/PR8/34 (HlNl)/PB1-265/591+PB2-478 的保藏號為 CGMCC N0.6206。
2.—種構建減毒和穩定敏感型流感病毒突變株的方法，所述方法包括在流感病毒的PBl基因中引入K39IE和E581G突變氨基酸位點；或者在流感病毒的PBl基因中引入K265N及V591I突變氨基酸位點，并且在流感病毒的PB2基因中引入V478L突變氨基酸位點。
3.含K391E及E581G突變氨基酸位點的PBl基因或含K265N及V591I突變氨基酸位點的PBl基因組合含V478L突變氨基酸位點的PB2基因在構建減毒和穩定敏感型流感病毒突變株中的應用。
4.一種減毒和穩定敏感型流感疫苗，所述疫苗包含權利要求1所述的溫度敏感型流感病毒突變株中的任一種。
【文檔編號】C12N7/01GK103923886SQ201310011824
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月11日 優先權日:2013年1月11日
【發明者】高斌, 賀文, 王偉 申請人:中國科學院微生物研究所