專利名稱：共軛亞油酸的發酵方法及所用菌株的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及菌株的構建及發酵，尤其是一種共軛亞油酸的發酵方法及所用菌株。
背景技術：
共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid,簡稱CLA)是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸，是人體必需的脂肪酸亞油酸(linoleic acid，簡稱LA)衍生而成的一系列位置和構象異構體的總稱。CLA具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、降低膽固醇、調節血糖、增強機體免疫能力、促進生長等多種生理活性，其中，tlO, C12-CLA是最具生理活性的異構體之一。在自然界中，CLA廣泛存在于反芻動物的肉制品和乳制品中，但是含量極低。目前，工業上生產CLA主要采用化學異構法，即通過亞油酸的堿催化異構化。但是，這種方法獲得的產物是多種異構體的混合物，除了具有生理活性的異構體外，還含有多種安全性未知的副產物，而活性異構體的分離純化是十分困難的。采用基因工程技術，獲得能夠表達亞油酸異構酶的菌株，利用自身的亞油酸異構酶將LA轉化成CLA，條件溫和，并且能夠合成具有生理活性的單一異構體，不僅可以大大簡化后續分離純化的步驟，降低生產成本，而且對于將來CLA用于臨床試驗以及膳食添加不同CLA異構體的合理配比，都具有混合異構體無法比擬的優點。來源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)的亞油酸異構酶(pai)是唯
--種已知晶體結構的亞油酸異構酶，能夠將LA轉化成單一的活性異構體tlO, cl2-CLA，
并已在大腸桿菌、酵母、煙草及大米等多種系統中成功的進行了表達。
發明內容
本發明的目的在于利用釀酒酵母表面展示系統表達了來源于痤瘡丙酸桿菌的亞油酸異構酶，成功構建了一株通過展示亞油酸異構酶能催化合成單一活性異構體tlO, C12-CLA的酵母工程菌株，并利用該菌株成功發酵合成tio，Cl2-共軛亞油酸。本發明實現目的的技術方案如下:一種在細胞壁表達共軛亞油酸異構酶基因的基因工程菌，含有亞油酸異構酶基因，基因序列見序列3，表達載體的pYDl，宿主菌為釀酒酵母EBYlOO。而且，所述共軛亞油酸為tlO，cl2-共軛亞油酸。在細胞壁表達共軛亞油酸異構酶基因的基因工程菌的培養方法，步驟為:將所述基因工程菌接種到含有半乳糖的YNB-CAA培養基中，誘導培養，離心，收集菌體。而且，所述半乳糖濃度為1-2% (W/V)。而且，所述誘導培養溫度為20-25° C，誘導培養時間為48-96h。而且，將所述工程菌加入到含有底物亞油酸的緩沖液中進行振蕩反應，反應后獲得共軛亞油酸。而且，所述緩沖液pH為6.5-7.5。而且，所述緩沖液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
而且，所述振蕩反應溫度為30-37° C，振蕩反應時間為4_36h。一種制備共軛亞油酸的全細胞催化劑，含有如權利要求1所述的基因工程菌，所述共軛亞油酸為tlO，cl2-共軛亞油酸。本發明的優點和積極效果如下:1、本發明通過將來源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)的亞油酸異構酶基因插入載體PYDl中，構建了表達載體pYDl::pai，并將它導入釀酒酵母EBY100中，獲得含有表達載體pYDl::pai的釀酒酵母菌株EBY100-PYDl-pai，本菌株經誘導培養后，PAI成功的展示在釀酒酵母細胞壁表面，能夠與底物亞油酸充分接觸，并將LA轉化為單一活性異構體 tlO, C12-CLA。2、本發明首次利用釀酒酵母表面展示系統，將亞油酸異構酶基因展示在細胞壁表面，使得底物能夠與其充分的接觸，既能夠提高亞油酸異構酶的催化效率，又能夠獲得具有生理活性的單一異構體，不需要再進一步純化分離，提高生產效率。3、本發明利用微生物表面展示系統將亞油酸異構酶連接在釀酒酵母細胞壁上，使細胞外底物與酶充分接觸，提高催化效率，并且能夠獲得具有生理活性的單一異構體，省掉分離純化步驟，降低生產成本。
圖1為本發明釀酒酵母表面展示系統原理示意圖。圖2為本發明表達載體pYDl::pai的結構示意圖。圖3為本發明pYDl::pai轉化釀酒酵母PCR鑒定電泳結果圖。
圖4為本發明EBY100-pYDl-pai表面展示亞油酸異構酶催化合成tlO，cl2_CLA的
產量測定圖。圖5為本發明EBY100-pYDl-pai表面展示亞油酸異構酶催化合成tlO, cl2_CLA的氣相色譜圖。
具體實施例方式下面結合實施例，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。本發明的內容包括:帶有天然亞油酸異構酶pai基因的表達質粒，含有PAI表達質粒的能夠生產tlO，C12-CLA的釀酒酵母菌株，所述釀酒酵母菌株的構建方法和所述釀酒酵母菌株生產tlO, C12-CLA的方法。本發明通過將來源于P.acnes的pai基因插入載體pYDl中，構建了表達載體pYDl::pai，并將它導入釀酒酵母EBY100中，獲得含有表達載體pYDl::pai的釀酒酵母菌株EBY100-pYDl-pai。上述菌株經誘導培養后，PAI成功的展示在釀酒酵母細胞壁表面，能夠與底物亞油酸充分接觸，并將LA轉化為單一活性異構體tlO，C12-CLA。所述的天然亞油酸異構酶基因(pai)來源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes),菌株保藏編號為 ATCC6919,該基因的 GenBank 號為AX062088.1，其核苷酸序列如序列3所示。所述的表達質粒將pai基因插入初始載體pYDl (購自invitrogen公司，貨號V83501);所述的釀酒酵母將構建后的表達質粒轉入初始菌株釀酒酵母EBYlOO中(購自invitrogen 公司，貨號 C83900)；所述的釀酒酵母表面展示亞油酸異構酶的方法是，將釀酒酵母接種到YNB-CAA中，經半乳糖誘導培養，離心，收集菌體，洗滌，得到表面展示有亞油酸異構酶的釀酒酵母菌株；所述的半乳糖濃度為1-2% ;所述的誘導溫度為20-25° C ;所述的誘導時間為48-96h ；所述的釀酒酵母表面展示亞油酸異構酶催化合成共軛亞油酸的方法是，將已表面展示亞油酸異構酶的釀酒酵母菌株作為全細胞催化劑加入到含有亞油酸的緩沖液中(PH6.5-7.5)，振蕩反應；所述的緩沖液為磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液；所述的反應溫度為30-37° C ;所述的反應時間為4-36h ;一、釀酒酵母表面展示系統表達載體的構建以痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)的基因組為模板,利用表I中的引物進行PCR擴增。 PCR 反應體系為:2XPCR Buffer (含 Mg2+)25iil，dNTP (25mM) 5 yl，上游引物PA1-F和下游引物PA1-R (IOiiM)各I iil，模板(痤瘡丙酸桿菌全基因組DNA) Iiil，KOD FxDNA聚合酶0.5 ill，加無菌水至終體積為50 ill。PCR反應條件為:94°C預變性2min，98°C變性10s，56°C退火30s，68°C延伸90s，反應35個循環，68°C后延伸lOmin。表I所用引物序列
權利要求
1.一種在細胞壁表達共軛亞油酸異構酶基因的基因工程菌，其特征在于:含有亞油酸異構酶基因，基因序列見序列3，表達載體的pYDl，宿主菌為釀酒酵母EBY100。
2.根據權利要求1所述的在細胞壁表達亞油酸異構酶基因的基因工程菌，其特征在于:所述共軛亞油酸為tlO，cl2-共軛亞油酸。
3.按權利要求1所述的在細胞壁表達共軛亞油酸異構酶基因的基因工程菌的培養方法，其特征在于:步驟為:將所述基因工程菌接種到含有半乳糖的YNB-CAA培養基中，誘導培養，離心，收集菌體。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述半乳糖濃度為1-2%(W/V)。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述誘導培養溫度為20-25°C，誘導培養時間為48-96h。
6.用如權利要求所述的基因工程菌發酵共軛亞油酸的方法，其特征在于:將所述工程菌加入到含有底物亞油酸的緩沖液中進行振蕩反應，反應后獲得共軛亞油酸。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述緩沖液pH為6.5-7.5。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述緩沖液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述振蕩反應溫度為30-37°C，振蕩反應時間為4-36h。
10.一種制備共軛亞油酸的全細胞催化劑，其特征在于:含有如權利要求1所述的基因工程菌，所述共軛亞油酸為 tl0，cl2-共軛亞油酸。
全文摘要
本發明涉及一種利用釀酒酵母表面展示系統表達亞油酸異構酶，并利用該酶催化合成t10,c12-共軛亞油酸的方法。本發明構建了含有來源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)的亞油酸異構酶基因(pai)的表達載體，獲得了含有該表達載體的釀酒酵母菌株。經誘導培養后，亞油酸異構酶在釀酒酵母中得到展示表達，將該酶加入到含有底物亞油酸的緩沖液中，進行催化反應，生成t10,c12-共軛亞油酸。本發明利用微生物表面展示系統將亞油酸異構酶連接在釀酒酵母細胞壁上，使細胞外底物與酶充分接觸，提高催化效率，并且能夠獲得具有生理活性的單一異構體，簡化分離純化步驟，降低生產成本。
文檔編號C12P7/64GK103087935SQ201310015150
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月16日 優先權日2013年1月16日
發明者劉浩, 何希宏, 李凡 申請人:天津科技大學