專利名稱：檢測常見食品過敏原的基因芯片及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因芯片及包含該芯片的檢測用試劑盒，尤其是涉及一種常見食品中過敏原基因芯片及檢測用試劑盒。
背景技術：
食物過敏是人們對某些食物產生的一種不良反應，在醫學上屬于一種變態反應。 據國外的一些流行病學調查表明，占總人口 4%以及3歲以下嬰幼兒的6% 7%的人群對某些食物產生過敏。嬰幼兒患者在5 6歲時大約80%對牛乳、雞蛋、花生、小麥、大豆產生免疫耐受，大約20%對魚及甲殼類水產動物的過敏會消除，對其余的往往是終生過敏。在成年人，果蔬過敏的發病率成快速上升的趨勢，主要是因為存在果蔬-花粉的免疫交叉反應。我國尚未進行大規模調查，但早些時候的小范圍調查表明在北京、廣州及勝利油田，居民食物過敏的發生率為3. 4% 5. 0%。食物過敏反應的臨床表現包括蕁麻疹、皰疹樣皮炎、口腔過敏綜合征、腸病綜合征、哮喘及過敏性鼻炎等不同形式的臨床癥狀，嚴重時可導致過敏性休克，危及生命。患者在長期的忌食過敏食物過程中，往往會導致營養攝入的缺失，如I 9 歲兒童的食物過敏患者，鈣、鐵、鋅、維生素D、維生素E的攝入量小于RDA的有67%。因此， 食物過敏已被視為一種嚴重的公共營養衛生問題，引起了全球廣泛的關注。食物過敏是指食物進人人體后，機體對之產生異常免疫反應，導致機體生理功能的紊亂或組織損傷，進而引發一系列臨床癥狀食物變態反應具有特異性，各種免疫病生理機制均可涉及。食物過敏反應的一個共同特點是必須有致敏原的預先接觸及前接觸，使機體處于致敏狀態，當再次接觸該致敏原時，才誘發變態反應川。食物過敏是臨床上最常見，最重要的過敏性疾患之O
食物過敏發病機制，IgE介導的食物變態反應的發病機制食物過敏原進人易感者體內誘導產生免疫球蛋白E(IgE)介導的速發過敏反應，其過程首先是B淋巴細胞分泌致敏原特異的IgE抗體，敏化的IgE型抗體和致敏原在肥大細胞和嗜堿細胞表面交連，使肥大細胞釋放組織胺致敏介質，從而產生過敏反應。致敏蛋白具有對T-細胞和B-細胞的識別區，產生專一性的IgE型抗體。因此，致敏原含有兩類抗原決定簇，即T細胞抗原決定簇和B 細胞抗原決定簇。抗原決定簇一般為小于16個氨基酸殘基的短肽。非IgE型介導的食物變態反應I1、II1、IV型超敏反應均可涉及，但目前尚缺乏直接證據。牛奶誘發的血小板減少可涉及II型超敏反應。食物誘發吸收不良綜合征、食物誘發小腸結腸炎涉及III和IV型超敏反應。非IgE型介導的食物變態反應誘發癥狀所需食物量較IgE型介導型大。
近來有報道部分食物變態反近來有報道部分食物變態反應患者血清中IgG 4增高而IgE及其他IgG不一定增高。有人認為IgG 4只是一種同種細胞 趨化抗體，在抗原激發下可使嗜堿性粒細胞釋放介質，但亦有研究結果不支持上述討論。IgG 4在食物變態反應中的作用尚無定論，有待進一步研究。
食物的種類成千上萬，其中只有一部分容易引起過敏。同族的食物常具有類似的致敏性，尤以植物性食品更為明顯，如對花生過敏的患者對其它豆科類植物也會有不同程度的過敏。各國家、各地區的飲食習慣不同，機體對食物的適應性也就有相應的差異，因而致敏的食物也不同，比如西方人認為羊肉極少引起過敏，但在中國羊肉比豬肉的致敏性高； 西方人對巧克力、草莓、無花果等過敏較多，在中國則極少見到。根據西方的資料，易引起過敏的食物為牛奶、雞蛋、巧克力、小麥、玉米、堅果類、花生、橘子、檸檬、草莓、洋蔥、豬肉，某些海產及魚類，蛤蛘、火雞及雞等。在中國容易引起過敏的食物有以下幾類1.牛奶及奶制品是嬰幼兒最常見的食物，也是誘發嬰幼兒濕疹和哮喘的最常見食物變應原。牛奶中含有甲種乳蛋白、乙種乳蛋白和酪蛋白等成分，其中甲種乳蛋白是牛奶中最強的變應原成分。雖然甲種乳蛋白經高溫處理后，其變應原性可明顯減弱，但對于高度牛奶過敏的患者仍然可以誘發較為嚴重的癥狀。過去認為甲種乳蛋白具有較高的種屬特異性，故曾對牛奶過敏的兒童考慮采用山羊奶來替代，但近年研究證實許多不同種屬的動物奶食品中的某些抗原性是相似的對于牛奶過敏的兒童，山羊奶并不是可靠的替代食品特別是對牛奶嚴重過敏的兒童，其食物處方中也不應含山羊奶等。
2.雞蛋以及蛋制品可以誘發各個年齡段患者的過敏癥狀，其中蛋清的卵白蛋白是誘發過敏的主要成分，蛋黃則很少誘發過敏。
3.研究已證實蝦類蟹類、魚類和貝類等均可誘發過敏癥狀，特別是鮐魚、鱒魚和鮭魚等魚肉顏色偏紅的魚類極易誘發過敏癥狀。蝦、蟹等甲殼綱海產品也含有較高的變應原成分這些食物的變應原常耐熱，熟食也常常誘發過敏。
4.花生、芝麻和棉籽等油料作物主要與這些食物含較高的蛋白有關，一旦制成油制品則很少誘發過敏。在臨床上經常可以遇到花生引發過敏性休克和哮喘的患者。黃豆、 綠豆、紅豆、黑豆等均可誘發過敏。
5.面包師哮喘(Baker, s asthma)即與接觸面粉有關。堅果類包括胡桃、山胡桃、 開心果、榛子、松子和栗子等，蔬菜包括蕓豆、青豆、白羽扇豆、蘑菇、西紅柿、辣椒、韭菜、大蒜、茄子、白菜和蕨菜等，新鮮水果如桃子、蘋果、香蕉、草莓、菠蘿、李子、櫻桃和椰子等常常可誘發過敏癥狀。肉類及其肉制品常見的包括牛肉、羊肉、豬肉、雞、肉、兔肉和鴨肉等， 不常見的肉類包括狗肉、鵝肉、鱉肉和鳥肉等也可誘發過敏，如對鳥肉的過敏往往發生在有鳥蛋綜合征的患者。咖啡、啤酒、葡萄酒、白酒、花粉制成的保健品、巧克力和某些可食昆蟲(如螞蚱、蠶、蛹和豆蟲等)均可誘發過敏癥狀。當前食物過敏原檢測方法主要有免疫學法和核酸擴增法，然而無論ELISA方法還是核酸檢測方法，通常只能同時檢測I種過敏原，而在實際食品檢測中，需要對過敏原進行篩查檢測，即對多種過敏原進行同時檢測。隨著分子生物學的迅速發展，越來越多的食品基因組核酸序列被公布，人們對食物過敏原的認識已經從外部形態結構及生化特性深入到核酸、 基因水平。在此基礎上，人們建立了許多新的檢測技術，如核酸探針(Nuclear acid probe) 和聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction, PCR)等，由 于具有靈敏度高、特異性強、 操作簡便、反應快速等特點，己逐步應用于食品中過敏原的檢測。在這樣的背景下，生物芯片技術應運而生。分子生物學檢測技術的發展，已為過敏原快速檢測提供了良好的技術平臺。在過敏原檢測領域，目前國內外均建立了許多基于PCR方法的檢測技術，但由于PCR 技術只能針對某一種或幾種過敏原，而食品中存在的過敏原種類很多，這就需要同時對大多數常見食品過敏原進行檢測，PCR的這種局限性大大增加了檢測的工作量，不適用于食品過敏原分析等領域大量樣品的快速檢測。而基因芯片技術以其高通量、高特異性、高敏感、操作簡便、反應快速的特點為過敏原檢測提供了一種強有力的技術平臺。為此，本發明中以 DNA為檢測目標，選取8種食物樣品，建立一種用于檢測食品中過敏原新型基因芯片，以彌補傳統檢測技術存在的費時、耗力，分辨能力差的缺陷，擴展檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強度，縮短檢測周期。發明內容
本發明所述的基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針， 該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種①芹菜的MTD基因②雞的線粒體DNA③魚的線粒體DNA④花生的Arahl基因⑤芝麻的Sal基因⑥大豆(豆芽)Lectin基因⑦小麥的GAG56D基因⑧杏仁的Prudul基因所述寡聚核苷酸探針優選具有SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO: 1-8但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1_8所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
上述的優選序列及功能如下所示SEQ ID (5，-3，)NO:1 ATTACATGCTGAGTCACGATGAGCGTG 用于檢測芹菜過敏原；NO:2 TTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGAC 用于檢測魚過敏原；NO:3 AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG 用于檢測花生過敏原 NO:4 TTCCCGCAGCCCCAACAACCGCAACAA 用于檢測小麥過敏原 NO:5 TCGCAGGTGCAACATGCGACCCCAGCA 用于檢測芝麻過敏原 NO:6 CCTTTCATCCTCATTTCTATGAATCCG 用于檢測雞過敏原；NO:7 CACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTTGC 用于檢測大豆過敏原；NO: 8 GAGAAAATCAGTTATGAGATTAAGTT 用于檢測杏仁過敏原；本發明的基因芯片，可用于常見食品過敏原芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁的檢測。
本發明所述的基因芯片的制備方法，主要包含步驟1)按照SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列，根據芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁中的過敏原基因設計并制備出用于PCR擴增的 引物；2)制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟I)中的引物，對待測樣品基因組DNA進行PCR 擴增，得到靶序列；3)標記步驟2)中得到的靶序列；4)將標記后的靶序列與SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列基因芯片雜交；5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析雜交結果。
其中，步驟I)中所述的引物包括SEQ ID NO: 9-24所示的核苷酸序列的至少一種，各條引物探針的寡核苷酸序列由5’端至3’端的組成及其對應擴增作用是Pl (SEQ ID N0:9) TTTGATCCACCGACTTACAGCC用于擴增芹菜過敏原MTD基因的上游引物；P2(SEQIDNO:10)ATAAAAACAGATAACGCTGACTCATCAC用于擴增芹菜過敏原MTD基因的下游引物；P3(SEQIDN0:11)ATAACAGCGCAATCCTCTCCC用于擴增魚線粒體DNA的上游引物；P4(SEQIDNO:12)GCTGCACCATTAGGATGTCCT用于擴增魚線粒體DNA的下游引物；P5(SEQIDNO:13)GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG用于花生Arahl基因的上游引物；P6(SEQIDNO:14)CGCTGTGGTGCCCTAAGG用于擴增花生Arahl基因的下游引物；P7(SEQIDNO:15)CAACAAITTTCTCAGCCCCAACA用于擴增小麥GAG56D基因的上游引物；P8 (SEQ ID NO: 16) TTCTTGCATGGGTTCACCTGTT 用于擴增小麥 GAG56D 基因的下游引物；P9 (SEQ ID NO: 17) CCAGAGGGCTAGGGACCTTC用于擴增芝麻Sal基因的上游引物；PlO (SEQ ID NO: 18) CTCGGAATTGGCATTGCTG用于擴增芝麻Sal基因的下游引物；Pll (SEQ ID NO: 19) CTCTACCCTTGCTGAAAC用于擴增雞線粒體DNA基因的上游引物 P12 (SEQ ID NO: 20) TGATGAGGCTTACTGTGC用于擴增雞線粒體DNA基因的下游引物 P13 (SEQ ID NO:21) ACCTTGGTACTGGTGCTAC 用于擴增大豆 Lectin 基因的上游引物 P14 (SEQ ID N0:22)ACCTTGGCTACTTTATTGTT 用于擴增大豆 Lectin 基因的下游引物 P15 (SEQ ID N0:23) TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 用于擴增杏仁 Pru dul 基因的上游引物 P16 (SEQ ID N0:24)TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 用于擴增杏仁 Pru dul 基因的下游引物本發明的另一目的是提供一種檢測食品中過敏原的試劑盒，該試劑盒包括上述的基因芯片，所述的基 因芯片包含SEQ ID NO: 1-8的核苷酸序列或其互補核苷酸序列的至少一種；還包含PCR擴增的引物，該引物具有SEQ ID NO: 9_24的核苷酸序列的至少一種， 其中，用于擴增芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁的PCR引物分別根據MTD基因、 mitochondrion DNA、線粒體 16s、Arahl 基因、Sal 基因、Lectin 基因、GAG56D 基因、Pru dul 基因設計。
本發明所述的試劑盒還包括雜交盒、雜交液等。
本發明所述的試劑盒，可用于常見食品過敏原芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁至少一種致病菌的檢測。
與現有技術相比，本發明采用上述技術方案的有益效果在于現有芯片技術研究所設計的引物和探針基本都位于16s rRNA基因，本發明將在具有明顯進化優勢的過敏原特異基因上，設計特異探針和引物，有效的避免了分辨能力較低，無法區分到種的弊端，同時，本發明的檢測范圍已基本涵蓋了日常生活中常見食品過敏原，大大彌補了現有技術中檢測芯片檢測范圍欠缺的缺點。
本發明的檢測靈敏度高，提供的檢測試劑盒及其檢測方法敏感性高，檢測精度高， 可以檢測到lng/μ I的DNA模板見(圖11、圖12、圖13)。對常見致病菌可以進行全面、系統、準確的檢測與鑒定。
本發明所述的基因芯片可特異地檢測8種常見食品過敏原芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁。該檢測方法大約需24小時。在一張片基上可同時檢測8個樣品，減少了成本，實現高通量，同時檢測多個樣品的目的，特別適合于檢測那些多元混合的樣品。
由上述的技術方案可見，本發明將芯片技術引入食物過敏原快速檢測中，建立了一種快速、靈敏、高通量、準確性高、重復性強的全新的食物過敏原檢測基因芯片及其檢測方法，利用本發明的基因芯片可以達到對8種主要的食品進行檢測的目的，由于操作簡便， 準確性高，能一次完成多種型別的檢測，重復性強，因此對于醫院監測過敏原有重要的應用價值，實現對食物過敏原的快速準確的檢測。
圖1為本發明的基因芯片結構外形示意圖；圖2為本發明芯片的單一點陣結構示意圖；圖3為為利用本發明的基因芯片檢測芹菜過敏原的雜交結果示意圖；圖4為利用本發明的基因芯片檢測魚肉過敏原雜交結果示意圖；圖5為利用本發明的基因芯片檢測花生過敏原雜交結果示意圖；圖6為利用本發明的基因芯片檢測小麥的雜交結果示意圖；圖7為利用本發明的基因芯片檢測芝麻的雜交結果示意圖；圖8為利用本發明的基因芯片檢測雞肉過敏原的雜交結果示意圖；圖9為利用本發明的基因芯片檢測大豆過敏原的雜交結果示意圖；圖10為利用本發明的基因芯片檢測杏仁過敏原的雜交結果示意圖；圖11為以大豆(I ng/uL)為例檢測靈敏度的雜交結果示意圖；圖12圖11的延續(10 ng/uL)；圖13圖11的延續(100 ng/uL)。
具體實施方式
為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下面特舉較佳實施例， 并配合說明書附圖，作詳細說明如下。本發明所用到的各種試劑均有市售。
實施例1探針的設計和制備1.序列獲得芹菜的MTD基因，雞的mitochondrion DNA，魚的線粒體16s，花生的Arahl基因，芝麻的 Sal基因，大豆(豆芽)Lectin基因，小麥的GAG56D基因，杏仁的Pru dul基因均從GenBank 公共數據庫下載得到。
2.探針設計舉例(I)芹菜的MTD基因探針將芹菜的MTD基因基因序列導入Glustal X軟件中，選取一條代表序列在公共數據NCBI中作blastn比對，確定可否作為特異靶點 以及特異靶點的位置。將序列導入01igoArray2. O軟件中。參數設定如下:_n 20 ；-1 30 ；-L 40 ；-D 3000 ；-t79；-T 90 ；-s 65°C ；-χ 65°C ；-Ν 2 ；-ρ 33, -P 65 ；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA ；-g 15。 運行程序在線設計探針。
3.探針合成將下表I中的探針序列的5’端延長N個T并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備用。
4.探針篩選將合成好的探針溶解并適量稀釋后用基因芯片點樣儀點在玻璃片基上制成基因芯片，通過雜交實驗進行探針篩選，最終得到用于制備本發明基因芯片所需的特異的探針。
其它探針的設計方法與芹菜MTD基因探針設計方法相同，使用的設計參數也相同。
本發明通過多次雜交實驗進行探針篩選，得到的優選的探針如表I所示表1:本發明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測出的食物過敏原
權利要求
1.一種檢測常見食品中過敏原的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種①芹菜MTD基因②雞線粒體DNA③魚的線粒體16SDNA④花生的Arahl基因⑤芝麻的Sal基因⑥大豆的Lectin基因⑦小麥的GAG56D基因⑧杏仁的Prudul基因 ⑨① ⑧中選取的DNA片段。
2.根據權利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述寡聚核苷酸探針具有SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO: 1_8但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1-8 所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列與SEQ ID NO: 1-8所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
3.權利要求1所述的基因芯片在制備檢測常見食品芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁中過敏原試劑盒方面的應用。
4.權利要求1所述基因芯片的制備方法，其特征在于按如下的步驟進行1)根據權利要求1所述的常見食品過敏原的特異基因設計并制備出用于PCR擴增的引物；2)制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟I)中的引物，對待測樣品基因組DNA進行PCR 擴增，得到靶序列；3)標記步驟2)中得到的靶序列；4)將標記后的靶序列與權利要求1所述的基因芯片雜交；5)用生物芯片掃描儀獲取雜交信號并分析雜交結果。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟I)中所述的引物包括SEQID NO: 9-24所示的核苷酸序列的至少一種。
6.一種檢測食品中常見過敏原的試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的基因芯片。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的基因芯片包含SEQID NO: 1-8所示的核苷酸序列或其互補核苷酸序列的至少一種。
8.根據權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于還包含PCR擴增的引物，該引物具有 SEQ ID NO: 9-24的核苷酸序列的至少一種。
9.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于還包含雜交盒、雜交液。
10.權利要求6所述的試劑盒在制備檢測常見食品芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁中過敏原方面的應用。
全文摘要
本發明提供了一種常見食品中過敏原的基因芯片及檢測用試劑盒，其主要針對芹菜、雞、魚、花生、芝麻、大豆、小麥、杏仁等8種常見食品過敏原。該基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，上述寡聚核苷酸探針包含從芹菜MTD基因、雞線粒體DNA、魚的線粒體16S、花生的Arah1基因、芝麻的Sal基因、大豆的Lectin基因、小麥的GAG56D基因、杏仁的Prudul基因上選取的DNA片段。利用本發明的基因芯片及檢測試劑盒可以常見食品中過敏原，且操作簡便，高通量，準確性高，重復性強等特點，可用于食品過敏癥的臨床檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103060462SQ20131001925
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者王磊, 曹勃陽, 劉向前, 陳敏, 馮露 申請人:天津生物芯片技術有限責任公司