專利名稱：小鼠裸卵體外成熟方法及小鼠裸卵體外成熟培養液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種小鼠裸卵體外成熟方法及小鼠裸卵體外成熟培養液。
背景技術：
卵母細胞又稱為卵子，是一個新的生命個體發生發育的前提和基礎。隨著現代生命科學的發展，卵母細胞是新品種培育、轉基因育種和品種改良等方面的重要的材料。對于人類生殖健康而言，卵母細胞的體外成熟培養是試管嬰兒誕生的基礎。因此，卵母細胞的體外培養技術是現代生殖發育的核心技術。卵母細胞在體內存在于卵巢上，出生后的動物卵巢上存在的卵母細胞停滯于生發泡(germinal vesicle, GV)期，不再增殖且數量有限，伴隨著年齡的增長，數量不斷減少，并最終枯竭。因此，卵母細胞不像雄性生殖細胞精子具有數量龐大和源源不斷發生的特點，卵母細胞的體內發生發育特點也就決定了卵子的稀有珍貴。在正常生長發育的情況下，卵母細胞外周包裹有大量的卵丘細胞，自然排卵時，卵母細胞連同外圍的卵丘細胞一起排入輸卵管內等待同精子結合。在進行胚胎工程操作或輔助生殖技術應用時，由于從卵巢上直接抽取的卵母細胞還未達到完全成熟狀態，其中一半以上的卵母細胞周圍未完全由卵丘細胞包裹，臨床應用中把未完全被卵丘細胞包裹的卵母細胞稱為裸卵。目前，由于包裹卵丘細胞的卵母細胞在體外進行成熟培養時能夠獲得較高的發育質量和成熟率，則裸卵不能被發育成熟，常被廢棄，因此造成了卵母細胞資源的浪費。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種小鼠裸卵體外成熟方法。本發明要解決的 另外一個技術問題是提供一種用于小鼠的裸卵體外成熟培養液。
對于小鼠裸卵體外成熟方法，本發明采用的技術方案是:包括以下步驟:
(1)小鼠裸卵的分離培養
實驗動物為性成熟后小鼠，采用頸部脫臼處死小鼠，取出卵巢組織，清洗血跡，分離除去多余的脂肪組織，將卵巢放置在裸卵洗滌培養液中，體視顯微鏡下，用分離針輕輕劃破卵巢表面有腔卵泡，處于不同發育狀態的裸卵進入到裸卵洗滌培養液中，收集裸卵洗滌后隨機分組，用裸卵體外成熟培養液進行37°c培養；
(2)小鼠裸卵的成熟檢測
小鼠裸卵體外成熟培養24小時后，在顯微鏡下觀察記錄培養成熟裸卵排出第一極體情況，并且要求裸卵形態正常，裸卵胞質顏色光澤均一；
成熟培養后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，經磷酸鹽緩沖液洗滌，TrionX-1OO細胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液封閉，通過免疫細胞組織化學方法，用抗微管蛋白的單克隆抗體監測成熟裸卵紡錘體的微管蛋白發育狀態，裸卵內細胞核遺傳物質DNA分裂分離形成第一極體的狀況，用細胞核遺傳物質DNA特異性染料DAPI染色顯示；
(3)小鼠裸卵成熟后發育能力檢測
將成熟后的裸卵用裸卵體外成熟培養液洗滌后，用在含乙醇的裸卵體外成熟培養液中孵育，經胚胎培養液KSOM洗滌后，轉移到胚胎培養液KSOM微滴中進行培養。作為優選，裸卵洗滌培養液為a-MEM + 10% FBS。作為優選，裸卵體外成熟培養液為α-ΜΕΜ + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/mlhCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。對于小鼠裸卵體外成熟培養液，本發明采用的技術方案是:由以下組分組成:a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。Forskolin又稱毛喉素，作為一種天然化合物和常用的腺苷酸環化酶激活劑，其具有使神經細胞分化的功能，用于許多細胞分化過程，能刺激腺苷酸環化酶的活性并增加cAMP, cAMP是一個信號分子，是細胞發生過程中關鍵酶的調節因子。本發明的有益效果是:
為了充分挖掘卵母細胞資源，本發明通過在小鼠卵母細胞培養體系中添加同卵母細胞體外成熟相關的化學試劑，建立了小鼠裸卵體外高效成熟發育體系，該體系不僅能夠有效人工調控小鼠裸卵的體外成熟，而且成熟后的裸卵能夠具有正常卵母細胞形成胚胎的發育能力，從而為小鼠作為實驗動物模型在新品種培育、轉基因育種和品種改良等方面的重要的材料，也為人類輔助生殖技術的縱深發展提供基礎。
具體實施例方式一、實驗方法1、小鼠裸卵的分離培養 裸卵洗滌培養液:a -MEM + 10% FBS
裸卵體外成熟培養液:a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/mlGlu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin
實驗動物為性成熟后小鼠，為了能夠取得較多可用卵母細胞數量，對每只小鼠腹腔注射5IU孕馬血清促性腺激素以促進卵巢上更多卵母細胞發育，激素注射48小時后，采用頸部脫臼處死小鼠，取出卵巢組織，清洗血跡，分離除去多余的脂肪組織，將卵巢放置在裸卵洗滌培養液中，體視顯微鏡下，用分離針輕輕劃破卵巢表面有腔卵泡，處于不同發育狀態的裸卵進入到裸卵洗滌培養液中，收集裸卵洗滌后，隨機分組，裸卵于37°C在裸卵體外成熟培養液中培養。2、小鼠裸卵的成熟檢測
排出第一極體是卵母細胞成熟的最顯著的形態學特征，小鼠裸卵經過體外成熟培養24小時后，在顯微鏡下觀察記錄培養成熟卵母細胞排出第一極體情況，且以卵母細胞形態正常，卵母細胞胞質顏色光澤均一為基本標準。成熟培養后小鼠卵母細胞用多 聚甲醛固定液固定，經磷酸緩沖鹽液洗滌，TrionX-1OO通透，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽液封閉，用抗微觀蛋白的單克隆抗體a-tubulin監測成熟卵母細胞紡錘體的微管蛋白發育狀態，用紅色熒光羅丹明標記的二抗結合一抗Ct -tubulin抗體，同時，卵母細胞內細胞核遺傳物質DNA分裂分離形成第一極體的狀況，用細胞核遺傳物質DNA特異性染料DAPI染色顯示。3、小鼠裸卵成熟后發育能力檢測
卵母細胞成熟后經過孤雌激活能夠發育形成胚胎，因此，卵母細胞的孤雌激活是檢測卵母細胞成熟后發育能力的重要指標。將成熟后的裸卵用培養液洗滌后，用在含7%的乙醇的卵母細胞培養液中孵育6分鐘，經胚胎培養液KSOM洗滌后，轉移到胚胎培養液KSOM微滴中于37 °C進行培養。二、結果
裸卵在該體外成熟培養液中能夠克服外圍沒有卵丘細胞的成熟協助，在培養液其它組成成分不變的情況下，不含10 uM Forskolin的成熟培養液中裸卵體外培養成熟率為15.5%，采用添加10 uM Forskolin的成熟培養液能夠使裸卵的成熟率達到27.5%，具有顯著進一步提高裸卵的體外成熟發育效率(P < 0.05)，在成熟培養液中發育成熟的裸卵，排出第一極體，細胞直徑達到成熟卵母細胞的大小，卵母細胞形態正常，胞質顏色光澤均一。通過免疫熒光檢測分析證實，裸卵在體外成熟過程中隨著細胞核和細胞質成熟，裸卵逐漸發生生發泡破裂，減數分裂啟動和發生，裸卵細胞核中紡錘體微絲、微管組裝形成，染色體排列在紡錘體中央，并由兩端的微絲牽引移動。隨著微絲的牽引，染色體被分裂到兩端，裸卵發生非對稱分裂，并將一半染色體遺傳物質以第一極體的形式排出。裸卵體外成熟培養過程中染色體遺傳物質的遷移排列，紡錘體的微絲、微管形成過程與體內卵母細胞成熟的發生過程一致。通過使用含7%乙醇的卵母細胞激活液，來源于裸卵體外成熟發育的卵母細胞能夠正常激活、分裂和發育。孤雌激活的卵母細胞分裂后形成胚胎，胚胎組成中的卵裂球分裂均等，胞質均勻，形態、色澤均一正常。以上所述 的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護范圍之內。
權利要求
1.小鼠裸卵體外成熟方法，包括以下步驟: (1)小鼠裸卵的分離培養 實驗動物為性成熟后小鼠，采用頸部脫臼處死小鼠，取出卵巢組織，清洗血跡，分離除去多余的脂肪組織，將卵巢放置在裸卵洗滌培養液中，體視顯微鏡下，用分離針輕輕劃破卵巢表面有腔卵泡，處于不同發育狀態的裸卵進入到裸卵洗滌培養液中，收集裸卵洗滌后隨機分組，用裸卵體外成熟培養液進行37°c培養； (2)小鼠裸卵的成熟檢測 小鼠裸卵體外成熟培養24小時后，在顯微鏡下觀察記錄培養成熟裸卵排出第一極體情況，并且要求裸卵形態正常，裸卵胞質顏色光澤均一； 成熟培養后小鼠裸卵用多聚甲醛固定液固定，經磷酸鹽緩沖液洗滌，TrionX-1OO細胞膜通透，含牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液封閉，通過免疫細胞組織化學方法，用抗微管蛋白的單克隆抗體監測成 熟裸卵紡錘體的微管蛋白發育狀態，裸卵內細胞核遺傳物質DNA分裂分離形成第一極體的狀況，用細胞核遺傳物質DNA特異性染料DAPI染色顯示； (3)小鼠裸卵成熟后發育能力檢測 將成熟后的裸卵用裸卵體外成熟培養液洗滌后，用在含乙醇的裸卵體外成熟培養液中孵育，經胚胎培養液KSOM洗滌后，轉移到胚胎培養液KSOM微滴中進行培養。
2.根據權利要求1所述的小鼠裸卵體外成熟方法，其特征在于，所述裸卵洗滌培養液為 a -MEM + 10% FBS。
3.根據權利要求1所述的小鼠裸卵體外成熟方法，其特征在于，所述裸卵體外成熟培養液為 a -MEM + 10% FBS + 10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。
4.一種小鼠裸卵體外成熟培養液，其特征在于，由以下組分組成:a-MEM + 10% FBS +10ng/ml EGF +1.5U/ml hCG + I mM/ml Glu + 0.23 mM/ml 丙酮酸鈉 + 10 uM Forskolin。
全文摘要
本發明公開了小鼠裸卵體外成熟方法及小鼠裸卵體外成熟培養液。其中，小鼠裸卵體外成熟方法的步驟包括(1)小鼠裸卵的分離培養；(2)小鼠裸卵的成熟檢測；(3)小鼠裸卵成熟后發育能力檢測。小鼠裸卵體外成熟培養液由α-MEM+10%FBS+10ng/mlEGF+1.5U/mlhCG+1mM/mlGlu+0.23mM/ml丙酮酸鈉+10uMForskolin組成。本發明通過在小鼠卵母細胞培養體系中添加同卵母細胞體外成熟相關的化學試劑，建立了小鼠裸卵體外高效成熟發育體系，該體系不僅能夠有效人工調控小鼠裸卵的體外成熟，而且成熟后的裸卵能夠具有正常卵母細胞形成胚胎的發育能力，從而為小鼠作為實驗動物模型在新品種培育、轉基因育種和品種改良等方面的重要的材料，也為人類輔助生殖技術的縱深發展提供基礎。
文檔編號C12N5/075GK103074296SQ20131002066
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者楊盼, 曹鴻國, 章孝榮, 張飛, 張運海, 劉亞, 李運生, 陶勇, 方富貴 申請人:安徽農業大學