專利名稱：抗重茬修復三七連作土壤生態菌劑的制備方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵，特別是指一種能夠抗重茬修復三七連作土壤生態菌劑的制備方法。
背景技術：
在三七大量種植的今天，由于大量使用化肥、農藥，使得土壤-微生物-三七根形成的土壤生態系統受到嚴重破壞，有益菌受到抑制，而致病的真菌，如銹腐病菌、惡疫霉、腐皮鐮孢菌、立枯絲核菌和腐霉菌等，得到擴散生長，致使三七頻繁發生重茬病，如根腐、枯萎、黃苗、花葉、黑斑等，使得新開墾的森林土在種植3-5年(一茬)三七后，不能再重復利用，一般需要經過十年甚至十幾年以上的自然修復才能再種植三七。因此，能種植三七的土地越來越少。對三七重茬病的傳統防治方法有化學防治和種植措施防治。近年來，由于傳統的種植措施防治方法不能從根本上控制病害的發生，防治效果甚微；而長期使用化學農藥會使病原菌產生抗藥性，過量使用農藥也會破壞土壤的微生態環境，加重農藥對環境的污染，造成有害有毒物質在作 物體內殘留過高的惡果。采用微生物菌劑防治方法研究越來越受到人們的重視。從修復土壤生態系統入手，增加土壤中的有益菌，從而抑制那些容易感染植株病害的細菌和真菌。采用細菌-真菌聯合、多菌種聯合的技術方法，達到修復土壤生態系統，防止根腐病、枯萎病等重茬病發生，同時促進根生長，松土壯苗。益根生菌劑還具有降解農藥、化肥殘留污染的作用。菌劑經發酵工程完成后有效活菌數(cfu)在20億以上，即 2-3X109cfu/go采用細菌-真菌聯合預防三七重茬病益根生菌菌劑及其高密度、高活性的生產工藝還未見報道。
發明內容
本發明目的在于提供一種高密度、高活性的預防三七重茬病益生菌菌劑制備方法。本發明的技術設計構思是抗重茬益生菌菌劑的制備方法，包括發酵步驟，是將菌劑生產的一級種子液接種于以玉米粉-馬鈴薯-豆柏為主成分的培養基中進行二級、三級發酵，所述的發酵過程是在溫度為30°C、pH值為7. 2-7. 6的條件下進行的好氧發酵，生產菌種選用枯草芽孢桿菌 CGMCC1. 1630 (Bacillus subtil is)，地衣芽孢桿菌 CGMCC1. 518 (Bacilluslicheniformis),多粘芽抱桿菌 CGMCC1. 516 (Paenibacillus poIymyxa),幾鏈球菌 CGMCC1. 101(Streptococcus feaculis),熱帶假絲酵母 CGMCC2. 1773(Candidatropicalis),淡紫擬青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces Iilacinus),細黃鏈霉菌CGMCC4. 399 (Streptomyces microf Iavus)等7株細菌-真菌。將發酵終產物吸附、固定化于用草炭生物炭上，制成的固體粉末菌劑。本發明中所用菌種均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。無毒、無害，對土壤環境友好。用這些菌去修復遭到破壞的土壤生態系統，與原土壤的有益菌共同形成新的生態平衡。所述的擴大培養發酵過程包括下列工藝步驟(I)、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經試管(約IOmL)、小三角瓶(100-150mL)到大三角瓶(1000-1500mL)逐級擴大培養制成一級種子液(每株菌各1000-1500mL)級種子液的制備過程枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌，糞鏈球菌和細黃鏈霉菌的培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH值7. 2-7. 6，水IOOOmL);熱帶假絲酵母和淡紫擬青霉采用馬鈴薯-蔗糖培養基(去皮馬鈴薯200g水煮20-30min，雙層紗布過濾去渣留液，蔗糖20g，用水補足IOOOmL,自然pH值)。培養條件溫度為28_30°C，時間為24-48h.(2)、將(I)步驟中制備的一級種子液進行等質量混合，轉接于二級擴大培養液(30-35L)，(培養基組成玉米粉30g，去皮馬鈴薯20g，豆柏2g，蔗糖2g，硝酸鉀1. 0g，磷酸氫二鉀0. 5g,硫酸鎂0. 5g,氯化鈉0. 5g,硫酸亞鐵0. OOlg,蒸懼水IOOOmL,用過飽和氫氧化鈣調節PH值7. 2-7. 6)。以5% -10%的接種量接入發酵培養基，進行混合好氧發酵，溫度300C，攪拌轉速150-200r/min，通氣壓力保持0. 05Mpa,發酵培養20_24h，制備成二級種子液； (3)、將⑵步驟中制備的二級種子液轉接于三級擴大培養液(300-350L)，培養基同(2):以5%-10%的接種量導入發酵培養基進行好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速200-250r/min，通氣壓力保持0. 05Mpa，發酵培養20_24h，制備成發酵終產物；發酵終點用分光光度法測定以660nm波長吸光值最大(發酵液稀釋100倍，用滅菌發酵培養基作空白對照)或用血球計數板顯微計數法(稀釋100倍)以菌群數最多為發酵終點。為能給所擴大培養的菌群提供一定保護環境，必須選擇具有一定的營養成分，還具有網狀結構，具有較大的比表面積，能在單位體積內吸附、固定化較多的菌體。優選選用占發酵終產物總質量4-5倍的草炭生物炭。草炭生物炭，采用新工藝，在無氧或少氧條件下經400-45(TC，4-8h炭化過程而制成的生物炭。這種載體具有較高的有機質含量，無菌、無水，容易吸附菌體，容易與土壤混合，保護菌群適應土壤生態環境。為減少菌群的耗氧，延長保質期，防止污染。優選的實施方案是將吸附、固定化于草炭上制成的益生菌菌劑密封包裝。其中更為優選的技術方案是密封包裝是將益生菌菌劑密封于內襯聚乙烯膜的包裝袋內。本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于1、在二、三級擴大培養時采用玉米粉-馬鈴薯-豆柏為主成分的培養基對混合后的菌種實現擴大培養，大大降低了成本，縮短了發酵周期，提高了設備利用效率。2、經檢測，將發酵終產物(復合菌)固定化于草炭生物炭上，每克固體菌制劑的有效菌菌落數(cfu)可高達20億以上(即2-3X109cfu/g)，至今還未見如此高含菌量菌制劑的報道。草炭生物炭不僅能為所培養菌提供一些營養成分，還由于其網狀結構，具有較大的比表面積，所以能在單位體積內附著、吸附固定較多的菌體。因此，一定量的有效菌菌劑一旦均勻加入三七根圍土壤中就可以很快形成優勢菌群，發揮抗重茬、益根生的作用。
3、因土壤生態系統復雜，單一的菌或少量的菌是難以完成生態修復的。必須由細菌-真菌聯合、多種菌聯合，產生多種酶才能最終降解農藥、化肥殘留，達到松土狀苗、促根生長、抗重茬病、修復生態系統的目的。
具體實施例以下結合實施例對本發明作進一步描述，但不作為對本發明的限定，本發明的保護范圍以權利要求記載的內容為準。實施例1益生菌菌劑的制備方法，包括發酵步驟，是將菌劑的生產二級、三級菌液接種于以玉米粉-馬鈴薯-豆柏為主成分的培養基中進行混合擴大培養發酵，所述的發酵過程是在溫度為30°C、pH值為7. 2-7. 6的條件下進行的好氧混合發酵，生產菌種選用枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌，糞鏈球菌，熱帶假絲酵母，淡紫擬青霉，細黃鏈霉菌等7株細菌-真菌。將發酵終產物吸附、固定化于草炭生物炭上的固體菌劑。本實施例中所涉及的具體的工藝步驟和工藝參數是(I)、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經試管(SmL)、小三角瓶IOOmL)到大三角瓶(1500mL)逐級擴大培養制成一級種子液(每株菌各1500mL);一級種子液的制備過程枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌，糞鏈球菌和細黃鏈霉菌的培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH值7. 2-7. 6，水IOOOmL);熱帶假絲酵母和淡紫擬青霉采用馬鈴薯_蔗糖培養基(去皮馬鈴薯200g水煮20-30min，雙層紗布過濾去渣留液，蔗糖20g，用水補足IOOOmL,自然pH值)。培養條件溫度為30°C，時間為28h.(2)、將(I)步驟中制備的一級種子液進行等質量混合，轉接于二級擴大培養液(30L)，培養基組成玉米粉30g，去皮馬鈴薯20g，豆柏2g，蔗糖2g，硝酸鉀1. Og,磷酸氫二鉀O. 5g,硫酸鎂O. 5g,氯化鈉O. 5g,硫酸亞鐵O. OOlg,蒸懼水IOOOmL,用過飽和氫氧化I丐調節pH值7. 2-7. 6。以10%的接種量接入發酵培養基，進行混合好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速200r/min，通氣壓力保持O. 05Mpa,發酵培養24h，制備成二級種子液；(3)、將(2)步驟中制備的二級種子液轉接于三級擴大培養液(300L):培養基同
(2)。以5% -10%的接種量導入發酵培養基進行好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速250r/min，通氣壓力保持O. 05Mpa,發酵培養24h，制備成發酵終產物；發酵終點用分光光度法測定以660nm波長吸光值最大(發酵液稀釋100倍，用滅菌發酵培養基作空白對照)或用血球計數板顯微計數法(稀釋100倍)以菌群數最多為發酵終點。載體選用占發酵終產物總質量5倍的草炭生物炭，將發酵終產物-菌液直接噴灑、攪拌于草炭生物炭上。將吸附、固定化于草炭生物炭上制成的益生菌菌劑密封于內襯聚乙烯膜的包裝袋內。實施例2
將益根生菌劑的生產菌種的細菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基，真菌接種于馬鈴薯-蔗糖培養基，在溫度為30°C、pH值為7. 6的條件下制備一級
種子培養液。二級、三級擴大培養采用以玉米粉-馬鈴薯-豆柏為主要成分的培養基。生產菌種選用同實施例1。本實施例中所涉及的具體的工藝步驟和工藝參數是(I)、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經試管(7mL)、小三角瓶(IOOmL)到大三角瓶(1500mL)逐級擴大培養制成一級種子液(每株菌各1500mL);一級種子液的制備過程枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌，糞鏈球菌和細黃鏈霉菌的培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH值7. 2-7. 6，水 IOOOmL)；熱帶假絲酵母和淡紫擬青霉采用馬鈴薯-蔗糖培養基(去皮馬鈴薯200g水煮20-30min，雙層紗布過濾去渣留液，蔗糖20g，用水補足IOOOmL,自然pH值)。培養條件溫度為30-37°C，時間為24-48h.(2)、將(I)步驟中制備的一級種子液進行等質量混合，轉接于二級擴大培養液(35L)，(培養基組成玉米粉30g，去皮馬鈴薯20g，豆柏2g，砂糖2g，硝酸鉀1. Og,磷酸氫二鉀O. 5g,硫酸鎂O. 5g,氯化鈉O. 5g,硫酸亞鐵O. OOlg,蒸懼水IOOOmL,用過飽和氫氧化I丐調節pH值7. 2-7. 6)。以5% -10%的接種量接入發酵培養基，進行混合好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速150-200r/min，通氣壓力保持O. 05Mpa，發酵培養24h，制備成二級種子液；(3)、將(2)步驟中制備的二級種子液轉接于三級擴大培養液(350L)，培養基同
(2):以10%的接種量導入發 酵培養基進行好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速200r/min，通氣壓力保持O. 05Mpa,發酵培養22h，制備成發酵終產物；發酵終點用分光光度法測定以660nm波長吸光值最大(發酵液稀釋100倍，用滅菌發酵培養基作空白對照)或用血球計數板顯微計數法(稀釋100倍)以菌群數最多為發酵終點。將發酵終產物-菌液直接噴灑、攪拌于4倍草炭生物炭上。密封包裝于內襯聚乙烯膜的包裝袋內。常溫保存。實驗效果1.盆栽實驗已種植3年三七的土樣，過2mm篩，稱取1500克，加入益生菌菌劑7. 5克(質量比O. 5% )與土樣混合均勻，均勻分至3盆，每盆各栽三七3棵，作為實驗組；另取同樣1500克土樣，加入7. 5克草炭生物炭，混合均勻后分置3盆，同樣每盆種植3棵三七，作為對照組。在相同的常規溫室管理條件下(保持一定濕度、溫度、光照)，兩組條件一樣。經過6個月的觀察，實驗組三七生長良好，未出現花葉枯萎、爛根等重茬病病狀。而對照組生長緩慢，有3棵出現花葉枯萎病癥，有6棵出現爛根現象。2.云南文山州三七種植基地實驗選擇4坰(長條狀10*14m2)已種3年，剛剛起出三七的地塊，常規施底肥，翻耕、耙平后，設2坰為實驗組，加入益生菌菌劑100kg，2坰為對照組，不另加別的肥料。實驗組和對照組一字排開，相間排列，常規種植三七，每坰栽種1000棵三七苗，其它管理條件完全相同(溫度、光照、濕度)。實驗期18個月。結果實驗組僅有10棵出現重茬病病癥，而對照組90%的秧苗(1800棵)出現爛根等重茬病病癥，余下的200棵也生長不良。
權利要求
1.抗重茬修復三七連作土壤生態菌劑的制備方法，包括發酵步驟，是將抗重茬病益生菌菌劑的生產菌種接種先分別培養，然后用以玉米粉-馬鈴薯-豆柏為主要成分的培養基中進行混合擴大發酵培養，其特征在于所述的發酵過程是在30°C、pH值為7. 2-7. 6的條件下進行的混合好氧發酵過程。生產菌種選用枯草芽孢桿菌CGMCC1. 1630 (Bacillus subtilis),地衣芽抱桿菌 CGMCC1. 518 (Bacillus licheniformis),多粘芽抱桿菌 CGMCC1. 516(Paenibacillus poIymyxa),幾鏈球菌 CGMCC1. 101(Streptococcus feaculis),熱帶假絲酵母 CGMCC2. 1773(Candida tropicalis),淡紫擬青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces Iilacinus),細黃鏈霉菌 CGMCC4. 399(Streptomyces microflavus)等7株細菌-真菌；將發酵終產物吸附、固定化于用草炭在無氧或少氧、 400 V下炭化的草炭生物炭上而制備成的固體粉末菌劑。
2.根據權利要求1所述的預防三七重茬病益生菌菌劑的制備方法，其特征在于，所述的二級、三級擴大培養的培養基以玉米粉-馬鈴薯-豆柏為主要成分的培養基。培養基組成玉米粉30g，去皮馬鈴薯20g，豆柏2g，蔗糖2g，硝酸鉀1. Og,磷酸氫二鉀0. 5g，硫酸鎂0.5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. 001g，蒸餾水IOOOmL,用過飽和氫氧化鈣調pH值7. 2-7. 6。
3.根據權利要求1所述的抗重茬修復三七連作土壤生態菌劑的制備方法，其特征在于所述的發酵過程包括下列工藝步驟(1)、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經試管(約 IOmL)、小三角瓶(100-150mL)到大三角瓶(1000-1500mL)逐級擴大培養制成一級種子液 (每株菌各 1000-1500mL)；(2)、將(I)步驟中制備的一級種子液進行等質量混合，轉接于二級擴大培養液 (30-35L)。以5% -10%的接種量接入發酵培養基，進行混合好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速 150-200r/min，通氣壓力保持0. 05Mpa，發酵培養20_24h，制備成二級種子液；(3)、將(2)步驟中制備的二級種子液轉接于三級擴大培養液(300-350L)，培養基同(2)。以5% -10%的接種量導入發酵培養基進行好氧發酵，溫度30°C，攪拌轉速200-2501·/ min，通氣壓力保持0. 05Mpa，發酵培養20_24h，制備成發酵終產物；發酵終點用分光光度法測定以660nm波長吸光值最大(發酵液稀釋100倍，用滅菌發酵培養基作空白對照)或用血球計數板顯微計數法(稀釋100倍)以菌群數最多為發酵終點。
4.根據權利要求3所述的抗重茬修復三七連作土壤生態菌劑的制備方法，其特征在于所述的(I)步驟一級種子的制備過程中，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌， 糞鏈球菌和細黃鏈霉菌的培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基(配方牛肉膏5g，蛋白胨10g， 氯化鈉5g，pH值7. 2-7. 6，水IOOOmL);熱帶假絲酵母和淡紫擬青霉采用馬鈴薯-蔗糖培養基(配方去皮馬鈴薯200g水煮20-30min，雙層紗布過濾去渣留液，蔗糖20g，用水補足 IOOOmL,自然pH值)。培養條件溫度為28_30°C，時間為24_48h。
5.根據權利要求3所述的預防三七重茬病益生菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的(I)、(2)、(3)、(4)步驟中的培養基的滅菌條件是壓力0.1Mpa、溫度121°C、時間30min。
6.根據權利要求1所述的抗重茬修復三七連作土壤生態菌劑的制備方法，其特征在于所述的吸附菌液的載體選用占發酵終產物總質量4-5倍的草炭生物炭，將發酵終產物-菌液直接噴灑、攪拌于載體上，制備成固體粉末菌劑。
7.根據權利要求1或6所述的發酵菌劑的制備方法，其特征在于將吸附、固定化于草炭生物 炭上制成的發酵固體菌劑密封于內襯聚乙烯膜的包裝袋內。
全文摘要
預防三七重茬病益生菌菌劑的制備方法，屬于微生物發酵領域。包括發酵步驟，是將益生菌菌劑的生產菌種先分別個別培養制備成一級種子液，再接種于以玉米粉-馬鈴薯-豆粕為主要成分的培養基中進行好氧混合發酵擴大培養。生產菌種選用枯草芽孢桿菌等7株細菌-真菌。將發酵終產物吸附、固定化于草炭生物炭上，制備成固體菌劑。本發明解決了現有三七種植技術普遍存在的重茬病，種植2-3年后三七種植地塊能夠連種連收。本發明的制備方法，具有生產成本低、發酵周期短、菌群密度高的突出特點。該菌劑，可以預防三七種植過程中的死苗、黃苗、枯萎、干葉、根腐等土壤生態病狀。同時，還能促進根生長、松土壯苗，解除農藥、化肥殘留，具有顯著土壤生態修復作用。
文檔編號C12R1/10GK103045582SQ20131002057
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者張清敏, 唐景春, 張彥峰, 王發云, 王麟猛, 趙穎, 張瑩捷 申請人:南開大學, 文山市盛大中藥材專業合作社, 昆明天泰昌生物科技有限公司