專利名稱：一種生產轉基因克隆豬的激活方法
技術領域：
本發明涉及轉基因克隆豬的生產，尤其涉及一種生產轉基因克隆豬的激活方法。
背景技術：
克隆的效率低下和發育異常的一個主要原因是克隆胚的表觀水平，如全基因組甲基化水平存在異常。克隆胚的激活是啟動克隆胚胎發育的關鍵，常用克隆胚的激活方案有物理激活(如電脈沖刺激、機械刺激、溫度變化等)和化學激活(如鈣離子載體，乙醇、蛋白合成抑制齊U、蛋白激酶抑制劑等)。方法雖不同，但其激活機理基本是一致的，均是要使停止在M II階段的卵母細胞恢復分裂。化學激活對豬孤雌胚/克隆胚的激活能力較差，電激活是克隆豬生產中主要的激活方法，世界首批克隆豬都是用電激活方案獲得，而后人對電激活參數進行了優化，通過提高脈沖次數、降低場強、增加激活液中的Ca2+濃度以及激活前孵育2 3h等策略來改善克隆胚的發育。尤其是在電激活的之后，再利用化學輔助激活處理克隆胚胎的研究較多；在常用的化學輔助激活試劑中，6-DMAP輔助激活因易導致大部分(58%以上)胚胎倍性異常而被謹慎使用。放線菌酮(以下簡稱為CHX)作為蛋白質合成抑制劑，在單獨使用時不能激活豬的克隆胚，但在電激活之后使用，明顯改善了克隆胚的發育能力，因此，CHX被廣泛應用于克隆豬的生產中，電激活后使用CHX處理4 6h (小時)成為當前較為流行的克隆胚激活方案。在現有的激活方案中，通常采用的是在電激活后，使用CHX處理4 6h的激活方案，該方案中由于要把轉基因克隆胚放在化學輔助激活劑CHX中處理4 6h，在CHX暴露時間長，會造成胚胎凋亡率的上升和產生過高的全基因甲基化水平從而可能影響克隆效率和后代健康，且要耗費大量時間和人力成本。即使在采用上述電激活后的CHX處理的方案中，將CHX激活時間縮短至2 3h，輔助激活對胚胎發育的提高效果亦將消失。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種生產轉基因克隆豬的激活方法。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種生產轉基因克隆豬的激活方法，系采用電激活與化學激活的聯合激活方法，在采用電激活前用放線菌酮激活處理3min 25min。優選的是，放線菌酮激活的處理時間為10 20min。進一步優選的是，放線菌酮激活的處理時間為lOmin。另外一個優選是，放線 菌酮激活處理的濃度為5 10 μ g/mL。本發明的有益效果是通過改變常規的聯合激活方式的順序，采用先化學激活、再電激活的方案，并縮短激活方案中化學輔助激活的時間，可以得到與常規的先電激活、后化學激活并花費較長時間的組合激活方案相似的胚胎發育能力，以及較低的囊胚凋亡率和囊胚階段的DNA甲基化水平，將該方案生產的胚胎移植后成功生產轉基因克隆豬。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明生產轉基因克隆豬的激活方法實施例的操作流程圖。
具體實施例方式一種生產轉基因克隆豬的聯合激活方法，在采用電激活前用放線菌酮處理lOmin。其中放線菌酮處理的濃度為10 μ g/mL。本實施例采用在電激活前CHX處理lOmin，與通常的先電激活后CHX處理4h相比，發現可以降低克隆胚胎的全基因組甲基化水平，而較高的甲基化水被認為是克隆胚發育能力低下的原因。使用本實施例的激活方案(電激活前使用CHX輔助處理lOmin)，我們成功獲得健康的轉基因克隆豬。如圖1所示，生產轉基因克隆豬的聯合激活方法的具體實施步驟如下1、豬卵母細胞的體外成熟將從屠宰場剛摘取的豬卵巢，放入37°c含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，2h內運回實驗室。無菌生理鹽水洗滌3遍，配有18號針頭的10 mL —次性塑料注射器抽取卵巢上2 6 mm直徑的卵泡，在帶有熱臺的體視鏡下迅速撿取胞質均勻，有2層以上且包裹完整的卵丘細胞COCs，獲得的COCs用成熟液洗3遍后轉入在38. 5 °C，5%C02,100%濕度的二氧化碳培養箱中平衡4h以上的石蠟油覆蓋的成熟培養滴中培養42±2 h，每50 μ L成熟液滴培養15 20枚COCs或是Nunc四孔皿每孔培養100 120枚。2、脫除卵丘將成熟培養42小時后的COCs移入已用37°C預熱的含I mg/ml透明質酸酶的DPBS中，再用移液器裝上吸嘴吹打3min，將脫完卵丘的卵母細胞移入T2(TCM199+2%FBS)液滴洗滌3次，移進礦物油覆蓋的T2滴中備用。3、體細胞的準備供核細胞采用培養第3 9代胎兒成纖維細胞或耳成纖維細胞體細胞，選擇匯合度在60% 90%的細胞，于顯微操作I h前，按正常細胞傳代后，并保存在4 °C冰箱中待用。4、體細胞核移植脫除卵丘后，在顯微鏡下挑選排出第一極體且卵胞膜完整的卵母細胞，將卵母細胞和體細胞一起放入顯微操作皿的核移植操作液，即為HEPES緩沖的含
7.5 μ g/mL細胞松馳素B (CB)及2%FBS的TCM199中。盲吸法去核，之后用去核針吸取體細胞，從去核切口進入卵母細胞透明帶下注核，輕輕點壓透明帶，使體細胞與胞質膜緊密接觸。操作完后將重構卵轉移到石蠟油覆蓋好的T2液滴中，在38. 50C的恒溫箱中恢復30min。5、重構卵的融合與激活將T2中已恢復好的重構卵在化學輔助激活液CHX(PZM-3+1Ομ g /mL CHX+10 μ g/mL CB)處理 lOmin，進行激活，然后用 CF-150B 融合儀(BLS，匈牙利)施加單個156V/mm，100 μ s的直流電脈沖誘導融合同時電激活，PZM-3培養液洗滌3遍后，轉入蓋礦物油的胚胎培養液PZM-3中，38. 5°C,5% CO2,100%濕度培養，I h后取出，在體視顯微鏡下判定融合。
6、胚胎培養將判斷融合的重構胚用胚胎培養液洗滌3遍后轉入預平衡4h以上的胚胎培養滴內，每個培養滴培養10 15枚胚胎或是Nunc四孔板培養。在38. 5°C，5% CO2,100%濕度條件下繼續培養.
7、胚胎移植胚胎培養至24或48小時后，收集卵裂的克隆胚胎，再移植入發情同步的受孕母豬子宮內，體內發育直至出生(申請人所在實驗室應用該激活方法已獲得健康的轉基因克隆豬)。以上所述的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護范圍之內。`
權利要求
1.一種生產轉基因克隆豬的激活方法，采用電激活與化學激活的聯合激活，其特征在于，在采用電激活前用放線菌酮激活處理3min 25min。
2.根據權利要求1所述的激活方法，其特征在于，所述放線菌酮激活的處理時間為10 20min。
3.根據權利要求2所述的激活方法，其特征在于，所述放線菌酮激活的處理時間為IOmin0
4.根據權利要求1-3任何一項所述的激活方法，其特征在于，所述放線菌酮激活的濃度為5 10 μ g/mL。
全文摘要
本發明公開了一種生產轉基因克隆豬的激活方法，采用電激活與化學激活的聯合激活，在采用電激活前，先用放線菌酮激活處理3min～25min。作為優選，放線菌酮激活的處理時間為10～20min；進一步優選，放線菌酮激活的處理時間為10min；放線菌酮激活處理的濃度為5～10μg/mL。本發明通過改變通常聯合激活方式的順序，采用先化學激活后電激活的方案，并縮短激活方案中化學輔助激活的時間，可以得到與原來先電激活后化學激活并較長時間的組合激活方案相似的胚胎發育能力，以及較低的囊胚凋亡率和囊胚階段的DNA甲基化水平，將該方案生產的胚胎移植后成功生產轉基因克隆豬。
文檔編號C12N15/877GK103060381SQ20131002266
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者張運海, 李運生, 章孝榮, 隨劉才, 張遠亮, 方富貴, 劉亞, 曹祖兵 申請人:安徽農業大學