超富集植物龍葵金屬硫蛋白（mt-l2）基因序列及其克隆方法
【專利摘要】本發明屬于分子生物學中基因克隆領域，具體的說是一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白（MT-L2）基因序列及其克隆方法。超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列為2型金屬硫蛋白基因，其基因序列為SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2中核苷酸序列所示。超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因的成功克隆和測序，為進一步分析MT-L2影響下生物抗逆能力，為MT-L2其它功能的篩選及應用奠定了基礎。
【專利說明】超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列及其克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學中基因克隆領域，具體的說是一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列及其克隆方法。
【背景技術】
[0002]金屬硫蛋白(Metallothionein, MTs)是一類低分子量、高Cys含量、具有金屬結合能力的多肽，最早在蓄積鎘的馬腎組織中發現，而在植物中分離的與動物MTs同源的蛋白被稱為植物類金屬硫蛋白(Metallothionein Like, MT-L)。最早是由Casterline和Barnett于1977年從大豆根中發現的。根據Cys的位置與排列方式，植物類金屬硫蛋白被分為三類。MT-Ll具有6個Cys-X-Cys單元，C端和N端結構域各含3個，2個結構域之間是由約40個氨基酸殘基組成的不含Cys的間隔區，間隔區氨基酸殘基較多是絕大多數植物MT的共同特征；MT_L2與MT-Ll類似，但第一和第二個Cys以Cys-Cys形式出現，而且通常位于多肽鏈的第三和第四位，N端多有一個高度保守的序列MSCCGGNCGCG，C端結構域有3個Cys-X-Cys單元，MT-Ll與MT-L2的最大區別在于前者的Cys集中分布在肽鏈的N端和C端，中間由一段不含Cys的間隔區相連，后者的Cys則散布在整個肽鏈中；MT-L3為非基因編碼產物，是以谷胱甘肽為底物酶促合成的多聚物，在N端有4個Cys，前面3個多以 Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys 方式排列，第四個 Cys 通常包含 Gln-Cys-X-Lys-Lys-Gly 單元中，C端結構域有6個Cys。MT-L4包含3個富含Cys的結構域，每個都包含5_6個Cys殘基，結構域之間為10-15個氨基酸殘基組成的間隔區，多數Cys以Cys-X-Cys的形式存在。MT-L通過Cys殘基上的-SH可以與CcUZn等重金屬離子螯合形成無毒或低毒的絡合物，還可以與重金屬等脅迫 條件誘發產生的自由基、ROS發生氧化還原反應，從而降低氧化損傷。植物MT-L基因家族的成員大多數以單拷貝或兩個拷貝的方式分散在整個基因組中。植物MT-L基因表達具有組織器官特異性和發育階段特異性，目前研究最多的是金屬離子對植物MT-L基因表達的影響，已有研究報道植物MT-L基因與重金屬Cd的耐受性有一定相關性，但金屬離子影響MT-L基因表達的機理仍不十分清楚，特別是在重金屬超富集植物中MT-L基因究竟扮演何等角色是目前該領域的研究熱點。
[0003]由ZL200410021546.1專利中可知龍葵(Solanum nigrum L.)為具有Cd超富集特征的植物，經分析表明:龍葵在土壤中Cd含量為20-110mg/kg條件下，其植物葉片或莖中Cd含量范圍為110-496mg/kg，超過100mg/kg這一 Cd超富集植物應達到的臨界含量標準，并且具有超富集植物的其它特征；植物盆栽試驗表明:在Cd污染水平為25.0和50.0mg/kg時，該植物莖和葉中Cd含量超過100mg/kg這一 Cd超富集植物應達到的臨界含量標準；小區試驗和污染區采樣試驗也表明:該植物也表現出Cd超富集植物的基本特征。此外，研究表明:龍葵生育期較短，通常只有80天左右，在沈陽地區采取花期收獲方式一年可收獲兩季，吉林和黑龍江地區至少可生長一季。其株高一般為80-150cm，生物量較大，根系分布廣，株型緊湊，非常適合作為重金屬Cd污染土壤的修復植物。因此，研究超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因為揭示和利用其解毒防御系統功能具有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列及其克隆方法。
[0005]為實現上述目的本發明采用的技術方案為:
[0006]一種超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列，超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列為2型金屬硫蛋白基因，其基因序列為SEQ ID N0.1和/或SEQ ID N0.2中核苷酸序列所示。
[0007]超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白，超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白為SEQ ID N0.3和/或SEQ ID N0.4中氨基酸序列所示。
[0008]超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列的克隆方法，首先從鮮活的龍葵葉片中提取總RNA;然后利用反轉錄酶AMV和反轉錄引物(隨機引物)合成第一鏈cDNA ;而后以合成的第一鏈 cDNA 為模板，利用兼并引物 MT-L2-F (5’-ATGTCTTGCTGTGGAGGAAN-3，)和 MT-L2-R(5，-GATCCACATTTGCAGCCATT-3’ )進行PCR擴增；將PCR產物克隆至pMD_18T載體后，取陽性克隆經測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列SEQ ID N0.1和/或SEQID N0.2。
[0009]本發明具有如下優點:
[0010]1.采用本發明對超 富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因的成功克隆和測序，首次確定其全部編碼序列，從而也弄清了它所編碼的氨基酸序列，該序列可以用以設計引物再克隆該基因，也可以根據該序列或該序列所推導的氨基酸序列對該基因進行重組表達或基因轉移。
[0011]2.超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因的成功克隆和測序，為進一步分析MT-L2影響下生物抗逆能力，為MT-L2其它功能的篩選及應用奠定了基礎；
[0012]3.利用本發明所得MT-L2基因對不同濃度污染物的表達情況來作為重金屬超富集植物篩選工具提供了方法學的指導。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明實施例2提供的超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因PCR的電泳圖。
[0014]圖2為本發明實施例3提供的Cd脅迫處理能夠顯著誘導MT-L2表達的效果圖。
【具體實施方式】
[0015]本發明通過對GeneBank中龍葵2型金屬硫蛋白基因序列進行比對分析，利用ABI公司的Primer Express Software v2.0軟件分析所有龍葵2型金屬硫蛋白基因序列的同源性區域設計簡并引物；其克隆方法包括:(1)通過分析龍葵2型金屬硫蛋白基因的同源性區域設計簡并引物MT-L2-F和MT-L2-R ; (2)從鮮活的超富集植物龍葵葉片中提取總RNA ；(3)利用反轉錄酶AMV和反轉錄引物(隨機引物)合成第一鏈cDNA ； (4)以合成的第一鏈cDNA為模板，利用兼并引物MT-L2-F和MT-L2-R進行PCR擴增，擴增片段大小約為200bp ;此外，所述兼并引物還可以為序列表中SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2核苷酸序列片段；(5)克隆及測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因核苷酸序列SEQ ID N0.1或SEQ IDN0.2。
[0016]本發明首次從超富集植物龍葵中克隆到兩種2型金屬硫蛋白基因:MT_L2a序列cDNA全長243bp，其中開放閱讀框位于1-242位核苷酸，編碼80個氨基酸殘基；MT_L2b序列cDNA全長270bp,其中開放閱讀框位于1-261位核苷酸,編碼86個氨基酸殘基。
[0017]實施例1
[0018]龍葵MT_L2a 基因如 SEQ ID N0.1 所示:
[0019]atgtcttgct gtggaggaag ctgtggctgt ggatctggct gcaagtgcggcagtggctgtggaggatgtg ggatgtaccc tgacttggag agcaccacta cctttaccatcattgagggtgttgcaccta tgatgaacta tggaaaggtt gagggaggac ctaagaatgcaacagaaggtggaaatggct gcaaatgtgg atcaatctct agaggatccc cgggtaccga gctcgaatcgtaa
[0020](a)序列特征:
[0021]?長度:243bp 1-242位核苷酸
[0022]?類型:核苷酸序列
[0023]籲鏈型 :單鏈
[0024]?拓撲結構:線性
[0025](b)分子類型:雙鏈DNA
[0026](C)假設:否
[0027](d)反義:否
[0028]( e )最初來源:龍葵
[0029]龍葵MT_L2b 基因如 SEQ ID N0.2 所示:
[0030]atgtcttgct gtggaggaag ctgtggctgt ggatctggct gcaagtgcggcagtggctgtggaggatgtg ggatgtaccc tgacttggag agcaccacta cctttaccatcattgagggtgttgcaccta tgatgaacta tggaaaggtt gagggaggac ctaagaatgcaacagaaggaggaaatggct gcaaatgtgg atcaatcgtc gacctgcagg catgcaagcttggcactggccgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa
[0031](a)序列特征:
[0032]?長度:270bpl_261位核苷酸
[0033]?類型:核苷酸序列
[0034]籲鏈型:單鏈
[0035]?拓撲結構:線性
[0036](b)分子類型:雙鏈DNA
[0037](C)假設:否
[0038](d)反義:否
[0039]( e )最初來源:龍葵
[0040]實施例2龍葵MT-L2基因的克隆方法
[0041]從龍葵中克隆上述MT-L2基因的方法為:
[0042](I)從鮮活的超富集植物龍葵葉片中提取總RNA ；
[0043](2)以總RNA為模板，利用反轉錄酶AMV和隨機引物(Random Primers,Invitrogen,美國)合成第一鏈cDNA ；
[0044](3)以合成的第一鏈cDNA為模板，利用兼并引物MT-L2-F和MT-L2-R進行PCR擴增，擴增片段大小約為200bp (見圖1)；
[0045](4)將PCR產物克隆至pMD-18T載體后，取多個陽性克隆經測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列MT-L2a和MT_L2b。
[0046]其中所述引物包括:
[0047]MT-L2-F:5’ -ATGTCTTGCTGTGGAGGAAN-3’
[0048]MT-L2-R:5’ -GATCCACATTTGCAGCCATT-3’
[0049]具體操作條件如下:
[0050]1.RNA提取步驟
[0051](I)總 RNA 提取:
[0052]稱取1.5g葉片組織放入用液氮預冷過的碾缽中，在液氮中研磨至粉末狀，轉至無 RNA 酶、無熱源的 1.5ml Eppendorf 管中，加 Iml Trizol,用 QIAGEN Tissue Ruptor 勻漿；室溫放置10分鐘，加200 μ I氯仿，充分混勻，15000rpm離心5分鐘；取上清，至1.5mlEppendorf管加600 μ I氯仿，混勻，15000rpm離心5分鐘；取上清，至1.5ml Eppendorf管加500ul異丙醇,混勻，15000rpm離心10分鐘；棄上清,用預冷的75%乙醇Iml沖洗，13000rpm離心5分鐘；棄上清，RNA沉淀于空氣中干燥3分鐘；將干燥后的RNA溶解于DEPC處理水中，至完全溶解。將總RNA作適當稀釋后，紫外分光光度計測OD26tZOD28tl的比值，并定量。定量公式:RNA濃度(μ g/ml) =OD260值X 40 X稀釋倍數(本實驗為400倍)
[0053]2.反轉錄反應
[0054](I)按下列順序在1.5ml離心管中加入下列組份:
[0055]
【權利要求】
1.一種超富集植物龍葵金屬硫蛋白(MT-L2)基因序列，其特征在于:超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列為2型金屬硫蛋白基因，其基因序列為SEQ ID N0.1和/或SEQ IDN0.2中核苷酸序列所示。
2.—種權利要求1所述的超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白，其特征在于:超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列編碼蛋白為SEQ IDN0.3和/或SEQ ID N0.4中氨基酸序列所示。
3.—種權利要求1所述的超富集植物龍葵金屬硫蛋白基因序列的克隆方法，其特征在于:首先從鮮活的龍葵葉片中提取總RNA;然后利用反轉錄酶AMV和反轉錄引物合成第一鏈cDNA ;而后以合成的第一鏈cDNA為模板，利用兼并引物MT-L2-F(5，-ATGTCTTGCTGTGGAGGAAN-3，)和 MT-L2-R (5，-GATCCACATTTGCAGCCATT-3，)進行 PCR 擴增；將PCR產物克隆至pMD-18T載體后，取多個陽性克隆經測序最終獲得超富集植物龍葵2型金屬硫蛋白基因序列SEQ ID N0.1和/或SEQ ID N0.2。
【文檔編號】C12N15/29GK103937809SQ201310023804
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月22日 優先權日:2013年1月22日
【發明者】張倩茹, 魏樹和, 焦洪靜 申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所