專利名稱：一種表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的構建方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于畜牧獸醫技術領域，尤其涉及一種表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的構建方法及其在促進豬腸道健康中的應用。
背景技術：
在當前，養豬業已成為關系國計民生的重要產業。在養豬生產中，仔豬是生長發育最快、飼料利用率最高、開發潛力最大的一個階段，仔豬飼養的好壞直接影響豬整個飼養期的生產成績。然而，仔豬階段也是生存能力、生理機能最脆弱的階段，仔豬死亡率通常占整個飼養期死亡率的70%。仔豬成活率低和生長緩慢是目前我國養豬生產中面臨的主要問題，提高仔豬飼養成績是保障養豬業快速發展的關鍵。動物腸道不僅是動物體內最大的消化吸收器官，是所有營養物質最終的吸收場所，同時也是體內最大的免疫器官，仔豬腸道健康發育是快速生長與高成活率的生理基礎。新生仔豬由于腸道處于快速發育之中，結構與功能不完善，養分的消化吸收與免疫屏障功能有很大的局限性，難以適應營養與環境的變化，增加了飼養的困難。仔豬哺乳期間，初乳和常乳中都含有高水平的、可促進腸道發育和成熟的生長因子，如谷氨酰胺、表皮生長因子、類胰島素生長因子和多胺等，斷奶后，這些因子消失，對腸細胞生長、分化及細胞功能的發育產生不良影響。仔豬斷乳后由于受營養、生理、環境和病原微生物等多種應激因素的影響，導致腸道黏膜萎縮、腸道上皮完整性和腸道屏障作用被破壞以及腸道功能紊亂，引起消化不良、腹瀉、生長抑制，甚至死亡。據統計，斷奶仔豬腹瀉率一般在20% 30%，腹瀉死亡率占仔豬總死亡率的40%。因此，生產實際中迫切需要采取有效措施促進仔豬腸道健康發育、改善消化吸收與免疫屏障功能。豬表皮生長因子作為豬乳中含量較高的生長因子之一，它對初生仔豬胃腸道發育有著極其重要影響。早期斷奶是縮短母豬生育周期的重要手段，而早期斷奶導致的斷奶應激是影響早期斷奶仔豬生產性能的主要原因，通過在飼料中添加表皮生長因子可以緩解斷奶應激。盡管豬表皮生長因子憑借其獨特的理化特性以及顯著的生理作用，作為飼料添加劑具有廣闊的發展前景，但是目前生產的豬表皮生長因子都是從乳產品中獲得或利用大腸桿菌表達系統表達所得，這兩種途徑都具有一定的局限性，從乳中分離豬表皮生長因子的量有限，很難滿足市場需要，而利用大腸桿菌表達系統表達的豬表皮生長因子，由于宿主菌大腸桿菌的局限性不能直接作為飼料添加使用，存在著分離純化的難題，增加了添加成本，很難滿足市場需要，鑒于此本發明以公認安全的微生物嗜酸乳桿菌為載體菌，構建能夠表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌，并以此重組嗜酸乳桿菌作為飼料添加劑。該載體菌屬于革蘭氏陽性菌，細胞壁不含內毒素的毒性 成分，并具有促進動物消化道益生菌的生長，抑制有害菌的繁殖，改善腸道環境，增強動物免疫功能等多種作用，已作為益生菌飼料添加劑應用于畜禽生產中。而所表達的豬表皮生長因子可以促進損傷腸道上皮的修復，達到預防腹瀉的目的。因此開發仔豬用表達腸黏膜表皮生長因子的重組益生菌，在飼料業與養豬業中具有廣闊的應用前景。目前國內在該領域的研究尚屬空白。發明內容
本發明的目的是針對目前仔豬斷奶應激導致的腸道損傷而不能有效修復，現有技術不足而無法解決的現狀，提供一種重組嗜酸乳桿菌的構建方法及用途，研發一種能夠促進仔豬腸道粘膜損傷修復的重組嗜酸乳桿菌。本發明的重組嗜酸乳桿菌既具有嗜酸乳桿菌對腸道微生態環境的維護功能，又可以發揮重組表皮生長因子對豬腸道損傷的修復功能，達到治療仔豬因各種因素導致的腸道損傷繼而引起的腹瀉，增加仔豬的存活率，解決生豬養殖過程中的瓶頸問題。
本發明的目的可通過下述技術方案來實現:
一種表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的構建方法，包括以下步驟:
(I)豬表皮生長因子基因的獲得:提取豬下頜腺RNA，經過RT-PCR得到cDNA，以此cDNA為模板，設計合成含有Sac I和Xba I酶切位點的上下游引物Pl和P2，上下游引物Pl和P2分別具有豬egf基因(Gene ID:X59516.1)的序列，采用PCR方法擴增豬egf基因片段。將所擴增的egf目的基因片段與克隆載體PMD18-T載體連接，得到重組質粒，轉入大腸桿菌DH5a中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，并通過酶切鑒定和測序分析驗證，驗證正確的質粒命名為pMD18T_egf，重組質粒序列測定表明該質粒具有豬egf的基因序列。
(2)重組表達質粒pMG36e_egf的構建:將乳酸菌表達載體pMG36e和克隆質粒pMD18T-egf用限制性內切酶Sac I和Xba I進行雙酶切，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和egf目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，通過紅霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，提取重組質粒，酶切鑒定正確后，命名為pMG36e-egf，其具有豬egf的基因序列。
(3)重組嗜酸乳桿菌的構建:采用電轉化方法將重組質粒pMG36e_egf轉化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態細胞中，利用紅霉素抗性進行篩選，得到重組菌，命名為:NZ6092-egfo
(4)豬表皮生長因子 在嗜酸乳桿菌中的誘導表達:將所構建的重組嗜酸乳桿菌NZ6092-egf接種于含有100ug/mL紅霉素的MRS液體培養基中，進行誘導表達，摸索其誘導表達條件，并對表達產物進行SDS-page和Western Blot分析。誘導表達。得到大小為6Kda左右的蛋白條帶。
(5)基因重組菌的防腹瀉效果:將所構建的基因重組嗜酸乳桿菌飼喂仔豬，觀察其防治仔豬腹瀉的效果。
一種表達豬表皮生長因子基因的重組益生菌的用途，所述的表達豬表皮生長因子基因的重組益生菌的應用是通過飲水或飼料中添加，促進豬胃腸道健康，防治仔豬腹瀉的發生，提聞生長性能。
本發明所具有的優點是:
本發明所構建的表達細胞因子egf的重組益生菌，具有傳統益生菌無法比擬的優點。該重組益生菌既有嗜酸乳桿菌的改善腸道環境，促進動物生長的優勢；所表達的細胞因子egf又具有修復腸道損失的功效。可以作為一種新型的飼料添加劑。
圖1為豬egf基因的RT-PCR擴增產物電泳2為克隆載體pMD18T_egf酶切電泳3為表達載體pMG36e_egf酶切電泳4為誘導表達的egf的western-blot分析
具體實施例方式實施例參見附圖1-圖4，本發明所述表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌采用以下方法構建:根據已公開的豬表皮生長因子(egf)的基因序列及表達載體質粒的特點，設計含有特異酶切位點的引物；以豬下頜腺為材料，提取mRNA，反轉錄得到cDNA為模板進行PCR擴增，獲得含有egf基因片段，并將其與表達載體質粒pMG36e進行連接，獲得重組質粒pMG36e_egf,通過電轉化方法將該重組質粒電轉化入嗜酸乳桿菌感受態細胞內，進行表達。并以所構建的重組豬表皮生長因子的嗜酸乳桿菌飼喂動物，觀察其防治腹瀉的效果。本發明的所需的實驗材料及具體實施方式
如下:一)實驗材料(I)目的基因序列
豬表皮生長因子EGF的基因序列來自于NCBI Genebank中。(2)載體Nisin誘導性表達載體pMG36e購自湖南瀛潤生物科技有限公司。pMD18-T克隆載體購自Takara生物科技有限公司。(3)菌株大腸桿菌DH5a購自Takara生物科技有限公司，受體菌嗜酸乳桿菌NZ6092購自中國農業微生物菌種保藏中心。二)實施方案1、豬表皮生長因子EGF基因的獲得以報道的豬表皮生長因子的基因序列(GeneID:X59516.1)為模板，設計合成含有Sac I 和 Xba I 酶切位點的 h下游引物 Pl:5~GGAGCTCCGAATAGTTACTCTGAAT~3 (Sac I),如 SEQID N0.2 和 P2:5~TATCTAGACGCAGCTCCCACCATTT~3 (Xba I)，如 SEQID N0.3 ;提取豬下頜腺RNA，經過反轉錄得到cDNA，以此cDNA為模板，通過PCR方法擴增豬egf基因片段，PCR產物經凝膠電泳檢測后回收PCR產物。將所擴增回收的egf目的基因片段與克隆載體PMD18-T載體連接后，轉入大腸桿菌DH5a中，通過氨芐青霉素抗性篩選，得到重組質粒，重組質粒用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產物經凝膠電泳檢測，酶切鑒定正確后重組質粒命名為pMD18T-egf。同時將重組質粒送往北京奧克生物科技有限公司進行序列測定。2、重組表達載體的pMG36e的構建將乳酸菌表達載體pMG36e和克隆質粒pMD18T_egf用限制性內切酶Sac I和Xba I進行雙酶切，雙酶切產物經凝膠電泳分析后，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和egf目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，通過紅霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，提取質粒，重組質粒用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產物經凝膠電泳檢測。鑒定正確后的重組質粒，命名為pMG36e-egf，其具有豬egf的基因序列。
3、表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的構建
采用電轉化方法將重組質粒pMG36e_egf轉化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態細胞中，電擊條件為電壓2.5KV，電阻400 Ω，電容25 μ F。利用紅霉素抗性進行篩選，經過PCR鑒定、酶切鑒定和測序(北京奧科生物科技有限公司)驗證后重組菌命名為:NZ6092-egf。
4、豬表皮生長因子在乳酸乳球菌中的誘導表達及SDS、Western Blot分析
挑取重組菌NZ6092_egf接種于含有100 μ g/mL紅霉素的MRS液體培養基中，30°C靜置培養過夜。培養物以3%的比例轉接于500mL含紅霉素MRS培養液中，培養至OD600=0.5 0.6時，加入誘導劑nisin，使其終濃度為5ng/mL，繼續培養3_5小時。重組菌裂解后經SDS-PAGE和Western blot分析證明目的基因得到正確表達。重組菌經nisin誘導后，在6Kda左右處出現一特異性蛋白條帶，與預期的大小一致。凝膠經薄層掃描分析顯不，目的蛋白約占受:體菌總蛋白的8%。
5、表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的防腹瀉效果
以本發明構建的表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌菌液(含重組嗜酸乳桿菌103億/kg)與二氧化硅按照體積重量比1:50在37°C下混合制成重組嗜酸乳桿菌飼料添加劑進行斷奶仔豬試驗。試驗選用6.23±0.17kg 21日齡斷奶的杜長大仔豬48頭，隨機分為兩組，每組分三個重復(欄)，每欄8頭。兩組基礎日糧一致，試驗組添加0.05%的重組嗜酸乳桿菌飼料添加劑，空白對照組未加重組嗜酸乳桿菌飼料添加劑。
三)實驗效果
1、豬表皮生長因子EGF基因的RT-PCR擴增
提取豬下頜腺RNA，采用RT-PCR方法擴增豬egf基因片段，PCR產物經凝膠電泳檢測，得到大小約為150bp的目的條帶，與預期結果相符。結果如圖1所示。
2、克隆質粒pMD18T_egf的酶切鑒定
克隆載體用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產物經凝膠電泳檢測，結果顯示酶切出大小2800bp左右的載體片段和大小約為150bp的目的基因片段，酶切結果表明克隆質粒構建正確。鑒定正確后重組質粒命名為pMD18T-egf。酶切結果如圖2所示。
3、豬表皮生長因子egf的序列測定
將酶切鑒定正確的克隆載體送往北京奧科生物科技有限公司進行序列測得，結果表明該質粒具有豬egf的基因序列，序列如SEQ ID N0.1所不。
4、表達質粒pMG36e_egf的酶切鑒定
表達質粒用Sac I和Xba I雙酶切，酶切產物經凝膠電泳檢測，結果顯示酶切出大小3600bp左右的載體片段和大小約為150bp的目的基因片段，酶切結果表明表達質粒構建正確。鑒定正確后重組表達質粒命名為pMG36e-egf。酶切結果如圖3所示。
5、豬表皮生長因子在乳酸乳球 菌中的誘導表達及SDS、Western Blot分析
重組豬EGF的嗜酸乳桿菌經過誘導表達，得到大小約為6KDa的目的蛋白，經SDS-PAGE和Western blot分析證明目的基因得到正確表達。結果如圖4所示。
6、表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的防腹瀉效果以本發明構建的表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌菌液進行動物實驗，觀察其對斷奶仔豬生長性能的影響，飼養結果見表I。表I添加表達豬表皮生長因子基因的重組益生菌對斷奶仔豬生長性能的影響
權利要求
1.一種表達豬表皮生長因子基因的重組益生菌的構建方法，其特征在于包括以下步驟: (I)豬表皮生長因子基因的獲得:提取豬下頜腺RNA，經過RT-PCR得到cDNA，以此cDNA為模板，設計合成含有Sac I和Xba I酶切位點的上下游引物Pl和P2，上下游引物Pl和P2分別具有豬egf基因(Gene ID:X59516.1)的序列，采用PCR方法擴增豬egf基因片段。將所擴增的egf目的基因片段與克隆載體PMD18-T載體連接，得到重組質粒，轉入大腸桿菌DH5a中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，并通過酶切鑒定和測序分析驗證，驗證正確的質粒命名為pMD18T_egf，重組質粒序列測定表明該質粒具有豬egf的基因序列。
(2 )重組表達載體pMG36e-egf的構建:將乳酸菌表達載體pMG36e和克隆質粒pMD18T-egf用限制性內切酶Sac I和Xba I進行雙酶切，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和egf目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，通過紅霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，提取重組質粒，酶切鑒定正確后，命名為pMG36e-egf，其具有豬egf的基因序列。
(3)表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的構建:采用電轉化方法將重組質粒pMG36e-egf轉化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態細胞中，利用紅霉素抗性進行篩選，得到重組菌,命名為:NZ6092-egf。
(4)豬表皮生長因子在嗜酸乳桿菌中的誘導表達及SDS、WesternBlot分析:挑取重組菌NZ6092-egf接種于含有100ug/mL紅霉素的MRS液體培養基中，誘導表達。得到大小為6Kda左右的蛋白條帶。
2.根據權利要求1所述的一種表達豬表皮生長因子基因的重組益生菌的用途，其特征在于:所述的表達豬表皮生長因子基因的重組益生菌通過飲水或飼料中添加，促進豬胃腸道健康，防治仔豬腹瀉的發 生，提高生長性能。
全文摘要
本發明公開了一種表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌的構建方法及用途，根據已公開的豬表皮生長因子的基因序列及表達載體質粒特點，設計含特異酶切位點的引物；以豬下頜腺組織為材料，通過RT-PCR獲得含有豬表皮生長因子基因的片段，將其與乳酸菌表達載體質粒pMG36e進行連接，獲得重組質粒pMG36e-egf，通過電轉化方法將該重組質粒轉入嗜酸乳桿菌內，得到表達豬表皮生長因子的重組嗜酸乳桿菌，在乳鏈菌肽(nisin)的誘導下進行表達，并經SDS-PAGE和Western blot分析證明目的基因得到正確表達。該重組菌用于防治腹瀉的發生，改善豬的腸道健康，提高生長性能。
文檔編號C12N1/21GK103146738SQ20131003883
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月31日 優先權日2013年1月31日
發明者侯永清, 吳濤, 竇茂鑫, 趙迪, 丁斌鷹 申請人:武漢工業學院, 武漢泛華生物技術有限公司