重組人成纖維細胞生長因子-17的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體涉及重組人成纖維細胞生長因子-17的生產方 法。
【背景技術】
[0002] 成纖維細胞生長因子（FibroblastGrowthFactor,FGF)是一類廣泛存在于多種 組織中的多肽細胞生長因子，目前已發現23個成員，分子量為16kD~34kD，其中心區域含 有高度同源性（30%~70% )的大約120個氨基酸序列，對來源于中胚層和神經外胚層的 多種類型細胞具有廣泛的生物學活性。FGFs在體內含量甚微但分布廣泛，各個因子調控著 一系列的發育過程，包括腦的發育、肢體的分化和軀干的形成。大多數FGFs成員與胚胎發 育、組織損傷修復、腫瘤的發生、發展和轉移等等有密切關系，具有可觀的應用價值。
[0003]FGF-17屬FGF8亞家族（FGF8、FGF17、FGF18)，與其他FGF成員一樣，均屬于旁分 泌因子，而在前列腺癌和肝癌中，FGF17還以自分泌方式參與其中。在胚胎發育過程中的組 織和器官形成中起重要作用。1998年，日本科學家MasamitsuHoshikawa等人從大鼠胚胎 中分離得到一種能夠編碼含有216個氨基酸的FGF17的cDNA，利用轉染了含cDNA的桿狀 病毒的HighFive昆蟲細胞有效得到了大鼠FGF17蛋白。科學家發現FGF17mRAN在大鼠胚 胎腦組織峽部及隔膜的神經上皮優先表達。說明FGF17對于胚胎腦組織發育至關重要。人 FGF17有兩種亞型，FGF17a和b，b為主要形式，本實驗中要表達的人FGF17也就是FGF17b。 人FGF17基因定位于染色體8p21. 3,共有3個外顯子，6個突變位點，由216個氨基酸組成， 與其他已發現的家族成員之間具有30%~70%的同源性，人FGF-17與老鼠的氨基酸序列 具有93%的高度同源性。人FGF17分子量約為25kD，而本次實驗設計中切除了信號肽，只 獲取成熟蛋白部分序列，最終蛋白分子量為22. 6kD，等電點10. 43,為堿性蛋白。結構上， FGF17與FGF8、FGF18相似，屬同一家族成員，其同源性分別為60%和50%，均具有信號肽 序列，采用大腸桿菌表達時需將其切除。
[0004]FGF17對腦組織神經系統正常發育意義重大。FGF17是腦組織結構正常發育的 關鍵因子，其表達和同家族的FGF8出現部分重疊，兩者在MHB區域（mid-hindbrain，中后 腦）和皮質層扮演重要角色。Cholfin等研究發現FGF17是小鼠額葉皮層分區的重要參 與部分，敲除FGF17會導致背側額葉皮層縮小以及額葉皮層投射到皮層下靶部位程度的 減少JingsongXu等以FGF17敲除小鼠為模型發現無論是出生后兩天的幼鼠還是成年小 鼠，在解剖學上無異常且呈現健康狀態，而經過組織學檢測卻發現其中腦尾端、下丘腦和 小腦蝴部出現顯著的組織缺失現象，即發育異常。（Hoshikawaetal.BiochemBiophys ResCommun. 1998, 244:187 - 191；Maruokaetal.MechDev,1998,74 (1-2):175 - 177 ； Reifersetal.MechDev, 2000, 99(1-2) :39 - 49；Cholfinetal.ProcNatlAcadSciU SA, 2007, 104(18):7652 - 7657；XuJetal.Development, 2000, 127(9):1833-1843 ；)
[0005]FGF17在研究神經精神性疾病方面具有潛在價值。針對這點，要涉及FGF17于染 色體上的位置。2009年的一篇報道綜述了染色體8p為神經精神病學易感位點，與神經 精神性紊亂（精神分裂癥、自閉癥）、神經退行性疾病（阿爾茨海默病、帕金森）、卡爾曼 綜合征等密切聯系；8p21-23是腦胼胝體發育不全的關鍵位點，后者和認知缺陷、抽搐、自 閉癥以及精神分裂癥密切相關。FGF17基因位于染色體8p21. 3,從而對于研究上述病癥 意義重大。Zanni等人經過研究案例來探討FGF17與小腦發育和疾病的關系，該案例中， 患者伴有嚴重的生長發育遲緩、癲癇以及DWM(Dandy-Walkermalformation，第四腦室 孔閉塞綜合征，也稱非交通性腦積水）癥狀，檢測發現患者體內染色體8p21. 2-p21. 3距 始端2. 3Mb處有缺失現象，也即FGF17基因有所缺損，而分析患者的血液淋巴細胞和皮膚 成纖維細胞發現FGF17表達水平明顯降低，這是關于人類小腦畸形與FGF17基因轉錄下 調的首次報道；Scearce-Levie等研究發現FGF17 /小鼠社會行為出現異常，表現為幼鼠 發聲減少，成年鼠社會互動缺陷，并發現在人體中，FGF17信號通路的干擾可能會導致一 系列神經精神類疾病，比如精神分裂癥和自閉癥，而這些異常行為可能由于FGF17缺失的 額葉皮層結構中Fos基因的激活減少所致，然而相關的神經循環和信號通路機制依然所 知甚少，需待進一步探究。目前對于神經精神方面的疾病治療仍有不足和很大的空間，從 而對于涉及在內的FGF17基因的研究具有很大的前景。（Tabar6s_Seisdedosetal.Mol Psychiatry. 2009, 14(6):563-589；Pauletal.NatRevNeurosci, 2007, 8(4):287-299 ； Zannietal.Neurogenetics, 2011, 12(3):241-245 ；Scearce-Levieetal.GenesBrain Behav, 2008, 7(3):344-354)
[0006]FGF17在骨骼方面的研究具有重要價值。可能與FGF17作用于受體FGFR3有 關。FGFR3在骨骼發育中起重要作用，是軟骨細胞中主要表達的受體，其激活突變會導致 一系列骨骼發育缺陷性疾病，如軟骨發育不全（ACH)、季肋發育不全（HCH)和致死性骨發 育不全（TD)，持續性活化骨細胞中FGFR3會導致侏儒癥。KrejciP等人利用免疫組化方 法檢測到在正常人類生長板軟骨中有FGF17蛋白的表達，且水平和FGF19 -致，隨后在細 胞增殖實驗中發現FGF17與FGF1同等水平抑制RCS(大鼠軟骨瘤軟骨細胞）的軟骨細胞 增殖，隨著FGF17濃度加大，抑制作用愈明顯。低濃度時，FGF17通過與肝素聯用顯著抑制 RCS增殖，而單獨的FGF17抑制效果不明顯，檢測發現FGF17能夠誘使ERK信號通路磷酸 化。從而可知FGF17參與激活軟骨細胞中FGFR3信號通路，誘使ERK磷酸化，抑制軟骨瘤細 胞的生長，而要想達到顯著抑制作用需要有肝素的配合使用。（Passos-Buenoetal.Hum Mutat, 1999, 14(2) :115-125；Naskietal.Front.Biosci, 1998, 3:d781-794；Naskiet al.NatGenet, 1996, 13(2) :233-237；Shiangetal.Cell, 1994, 78 (2) : 335-342；Krejci etal.PediatrRes, 2007, 61 (3) : 267-272.)
[0007]FGF17對于腫瘤發生、發展和轉移的影響。和其他成纖維細胞生長因子一樣，FGF17 也是一種潛在的致癌因子。FGF17主要通過與細胞表面的酪氨酸激酶受體FGFR3c、FGFR4、 FGFR2c和FGFRlc發生特異性結合（FGFR3c>FGFR4>FGFR2c>FGFRlc)，通過MAPK途徑引發 DNA合成以及促進細胞增殖，且在促進DNA合成時，FGF17誘導有絲分裂的活性是FGF8的兩 倍JingsongXu等人將攜帶有FGF17a和FGF17b(人FGF17的主要表達形式）基因的載體 轉入NIH3T3細胞中，一個星期之后，含有FGF17b的細胞40%出現腫瘤化，兩個星期之后， 所有細胞全部形成腫瘤，而含有FGF17a的細胞依然成正常狀態；Polnaszek和Heer等人均 檢測FGF17在前列腺癌細胞中出現過表達，尤其DU145細胞系中FGF17表達水平較高，Heer 等還發現在高度分化的前列腺癌細胞中FGF17mRNA以4倍于BPH(良性前列腺增生）的水 平上調。Polnaszek等從根治性前列腺切除手術標本的癌細胞中檢測到癌細胞和正常上皮 細胞中均有類似水平的FGF17的表達（由于癌細胞密度大，所以總體而言，FGF17在腫瘤 組織濃度偏高），表達量相對于FGF7偏低（FGF7為28ng/g，FGF17為0. 4~0. 5ng/g);關 于乳腺癌，目前依然沒有足夠的證據證明FGF17在乳腺癌細胞中有表達，不過Meijer等人 在三苯氧胺治療乳腺癌中發現組織中的受體FGFR4與其配體FGF17的信號傳導造成了三苯 氧胺抵抗，這一通路的發現對于內分泌治療乳腺癌無效的患者進行靶向治療提供了指導價 值。Gauglhofer等人研究人肝癌細胞（HCC，!fepG2andΗ印3B)發現包括FGF17在內的FGF8 家族的表達出現上調，而此現象可能與wnt通路下調有關。當饑餓或添加模擬低氧藥物甲 磺酸去鐵胺進行肝癌細胞培養時，發現FGF8家族的表達顯著增加，饑餓培養的肝癌細胞， 在添加了FGF8亞家族因子后，細胞凋亡減少，而這個與ERK1/2和核糖體蛋白S6的磷酸化 有關，研究發現無血清時，pERK和pS6下調，pGSK3β上調，細胞存活減弱，當添加FGF17后， pERK上調，肝癌細胞增多。目前已知FGF17與腫瘤密切相關，因此將其作為腫瘤診斷和治 療的靶分子具有廣闊的前景。（ZhangXeta.JBiolChem, 2006, 281 (23) : 15694 - 15700 ; Murrayetal.CurrCancerDrugTargets, 2009, 9(5):639 - 651；Reifersetal.Mech Dev,2000,99(1 - 2):39 - 49；XuJetal.MechDev,1999, 83(1-2):165-78；Polnaszek etal.Prostate, 2004, 60(1) :18-24；Heeretal.JPathol,2004, 204(5):578-586 ； Meijeretal.MolCancerRes, 2006, 4(6):379-86；Gauglhoferetal.Hepatolo gy, 2011, 53(3) :854-864.)
[0008] 由于FGF-17對于腦組織、神經系統、骨骼及腫瘤等方面有著重要意義，其研究和 臨床應用前景廣闊，