專利名稱：一種通用型rna干擾載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種RNA干擾載體及其構建方法和應用，特別涉及一種通用型的RNA干擾載體及其構建方法和應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
RNA干擾(RNAinterf erence，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。在動物中，RNAi可以通過U6啟動表達shRNA來實現。目前的U6載體可以通過2種方式表達在動物細胞內表達:瞬時表達以及穩定表達。shRNA是由長度為50 70個核苷酸的單鏈分子產生的具有莖環結構的特殊小分子RNA。其結構特點是:5 10個核苷酸的環連接兩條19 29個核苷酸的互補長鏈RNA片段，這兩條片段通過堿基配對形成莖環結構。shRNA可以通過化學合成和體外轉錄合成在體外產生，但最典型的方式是通過PolIII的啟動子在體內表達產生。緊隨19 29nt靶基因反向互補序列之后連上5 6個T作為RNA聚合酶的轉錄終止子。
發明內容
本發明是結合亞克隆技術與RNA干擾(RNAi)技術所發明的新型通用型RNAi載體。為了使hU6啟動子的使用更加方便，并且提高oligoDNA的連接效率。本發明通過改造hU6啟動子的3 ‘端的核苷酸序列，產生可用的限制性酶切位點粘性末端。并且在載體上設計可以作為部分轉錄終止子可用堿基的酶切位點序列。本實驗成功改造hU6啟動子序列，所表達的shRNA無多余核糖核苷酸，成`功抑制目標基因的表達；改造后的U6啟動子結合亞克隆技術、轉錄終止子，使得U6啟動子的使用更加方便、節約了時間，降低了成本，可以提高RNA干擾技術在一般實驗室的普及應用。為了達到上述目的本發明采用了以下技術手段:本發明的一種通用型RNA干擾載體，從5’端開始，包括以下依次相連的各部分:含有PCMV啟動子的綠色熒光蛋白、人U6啟動子序列、多克隆酶切位點、人U6終止子序列、含有PCMV啟動子的新霉素抗性基因、復制起始位點基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點。其中多克隆酶切位點用于線性化質粒，暴露用于連接oligoDNA的粘性末端 ’人U6啟動子以及終止子用于表達目的shRNA ;綠色熒光蛋白用于觀測質粒轉染效率；PCMV-NE0:用于篩選具有穩定RNAi作用的單克隆細胞；復制起始位點(Origin)提供載體在大腸桿菌中的復制信息；AmP Promoter-AmP用于篩選陽性克隆或者是菌體的大量增殖。在本發明中，優選的，所述的U6啟動子序列是以質粒i a V-PENTR/U6為模板，通過使用以下引物擴增得到的:
F:5’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R:5， -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，；所述的多克隆酶切位點與終止子序列是自行設計合成的核苷酸序列，核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。在本發明中，優選的，所述的載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。進一步的，本發明還提供了一種構建以上任一項所述的RNA干擾載體的方法，其特征在于包 括以下步驟:(I)突變型人U6啟動子的構建以含人U6啟動子的載體為模板，使用點突變后的引物PCR擴增得到突變型人U6啟動子，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構建得到PMD20-T-U6。擴增引物為:F:5’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R: 5 ’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，；(2)綠色熒光蛋白(GFP)的構建以含可以完整表達綠色熒光蛋白元件的載體為模板，擴增得到含有PCMV、GFP、SV40P0LY (A)的表達元件，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構建得到PMD20-T-GFP。擴增引物為:F:5， -TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’R:5’ -TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’ ；(3)正篩選基因的構建新霉素抗性基因NEO以及PCMV啟動子以載體PGT-Vl為模板進行克降，NEO的擴增引物為:F:5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5， -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3，；PCMV啟動子的擴增引物為:F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’ ；(4)骨架載體的構建合成多克隆位點，并將其亞克隆到PUC57載體上，構建骨架載體TOC57-MCS，多克隆位點序列如SEQ ID N0.2或圖2所示；(5)元件組裝①利用PUC57-MCS上的AgeI與ClaI兩個酶切位點以及載體PMD20_T_hU6上的AgeI與ClaIdf hU6亞克隆至PUC57-MCS構建成為載體roC57_hU6 ；②PCMV與NEO基因的組裝:將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點將兩個基因拼接成為PCMV-NE0，利用PCMV-NEO上的BamH1、NheI以及PUC57-hU6上的BglII，SpeI將PCMV-NEO克隆到載體PUC57_hU6上，構建成為載體PUC57-UN ；③利用PMD57-UN上的AgeI與SalI以及PMD20-T-GFP上的XmaI與SalI位點，將GFP克隆到PUC57-UN上，構建成為目的載體PGN_hU6。在本發明中，優選的，步驟(I)中構建得到的含有人U6啟動子、多克隆酶切位點、人U6終止子的片段的序列如SEQ ID N0.3所示。更進一步的，本發明還提供了以上任一項所述的RNA干擾載體在構建豬源細胞RNAi表達載體中的應用。在使用本發明的載體構建豬源細胞RNAi表達載體時，包括以下步驟:1、雙酶切載體，暴露PGN_hU6上的U6啟動子與終止信號之間的粘性末端。2、合成轉錄shRNA所需的DNA序列,符合本載體的ds_oligo (DNA)如圖4所示；3、將合成的片段與酶切后的PGN_hU6連接，轉化連接產物，挑取陽性克隆測序驗證，測序引物為:5’ -G GACTATCATATGCTTACCG-3’。 4、大量獲得陽性菌液，大提質粒。6、脂質體轉染細胞，觀測載體對于目的蛋白的抑制效率。
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本發明的干擾載體實現了不同操作情況下，對細胞基因表達的瞬時抑制或者穩定抑制，在建立穩定表達細胞系時，提高了轉然后載體的整合效率.同時通過對hU6啟動子進行改造，引入了 2個酶切位點，線性化載體可以連接任意的目標oligoDNA，此oligoDNA僅含有2個額外核苷酸(即，不用于表達shRNA的核苷酸)，節省了試驗成本。
圖1為重組載體PGN-U6的載體圖譜；圖2為重組載體PUC57-MCS的載體圖譜；圖3為PCMV與NEO的連接片段；圖4為符合本載體的ds-oligo (DNA)示意圖；圖5為不同時間檢測綠色突光信號圖；圖6為轉染陽性質粒細胞及空轉染細胞中α V的mRNA水平比較；
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例1 一種通用型RNA干擾載體的構建方法1、實驗材料i a V-PENTR/U6載體:本實驗室參照文獻《Lentviral-mediated RNAi to inhibittarget gene expression of the porcine integrin av subunit, the FMDV receptor,and against FMDV infection in PK_15cells〉〉構建；pcDNA3.1/CT-GFP 載體:購自 invitrogene 公司；PGT-Vl:本實驗室參照文獻《雙篩選標記打靶載體的構建及其功能鑒定》構建；多克隆酶切位點，實驗中用到相關引物:由上海生物工程有限公司合成；試驗中用到的各種試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，另限制性內切酶購自NEB公司(應用于載體酶切的內切酶購自寶生物)。2、方法2.1載體的構成載體的構成如PGN-U6結構圖譜圖1所示，其功能介紹如下:ClaI, Sfi1:用于酶切暴露U6啟動子與終止信號之間的粘性末端，便于插入目的ds oligo:hU6啟動子、終止子:用于表達目的shRNA ；PCMV-GFP:用于觀測質粒轉染效率；PCMV-NEO:用于篩選具有穩定RNAi作用的單克隆細胞；PUC Origin:載體在大腸桿菌中的復制信息；AmP Promoter-amP:用于篩選陽性克隆或者是菌體的大量增殖；Nru1、Srf1:用于轉染前，線性化載體；2.2載體基因原件的克隆2.2.1突變型人U6啟動子(hU6)的構建以i a V-PENTR/U6載體為模板擴增突變型人U6啟動子，所使用的擴增引物為:F: 5 ’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R: 5 ’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3，。擴增長度為289bP,擴增程序為:94 °C Imin,55 °C 50s,72 °C 3min(30cycles)；72°C 3min(over)。將克隆得到的片段連接到載體PMD20-T上得到載體PMD20_T_hU6，進行測序驗證，克隆得到突變型人U6啟動子片段，序列如SEQ ID N0.3所示。通過上述引物對產生可由ClaI酶切 位點酶切后產生粘性末端的突變型人U6啟動子。所改造堿基為ATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG 中的 ￡ 點突變為 T。2.2.2綠色熒光蛋白(GFP)的構建以質粒pcDNA3.1/CT-GFP為模板擴增GFP表達元件，所使用的引物為:F:5， -TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3’R:5， -TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3，；擴增長度為1600bP,擴增程序為:94 °C Imin,53 °C 50s、72C2min(30cycles)；72°C 5min (over)。將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，進行測序驗證，克隆得到GFP表達元件，序列如SEQ ID N0.4所示，構建得到PMD20-T-GFP。2.2.3正篩選基因的構建正篩選基因(新霉素抗性基因ΝΕ0)以及PCMV啟動子以載體PGT-Vl為模板進行克隆。NEO的擴增引物為:F:5，-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3，R:5， -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3，；其擴增程序為94°C lmin>59°C 50s>72°C lmin30s (30cycles) ；72°C 8min (over)；長度為1226bP。PCMV的擴增引物為:F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’R:5’ -GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3’ ；其擴增程序為94°C lmin、57°C 50s、72°C Imin (30cycles) ；72°C 8min (over);長度為615bP，PCMV與NEO的連接片段如圖3所示。2.2.4骨架載體的構建本實驗根據所得到各個基因原件的基因序列，設計不存在于這些基因上的酶切位點的多克隆位點，將多克隆位點送上海生工合成，并由上海生共將其亞克隆到TOC57載體上，構建骨架載體TOC57-MCS，多克隆位點序列如SEQ ID N0.2，PUC57-MCS載體圖譜如圖2所示。2.3元件組裝通過如下步驟進行基因的亞克隆將各基因原件組裝到骨架載體PUC57-MCS上。(I)利用PUC57-MCS上的AgeI與ClaI兩個酶切位點以及載體PMD20_T_hU6上的AgeI與ClaIdf hU6亞克隆至PUC57-MCS構建成為載體roC57_hU6 ；⑵PCMV與NEO基因的組裝:將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點將兩個基因拼接成為PCMV-NE0，利用PCMV-NEO上的BamH1、NheI以及PUC57-hU6上的BglII，SpeI將PCMV-NEO克隆到載體PUC57_hU6上，構建成為載體PUC57-UN ；(3)利用 PUC57-UN 上的 AgeI 與 SalI 以及 PMD20-T-GFP 上的 XmaI 與 SalI 位點，將GFP克隆到PUC57-UN 上，構建成為目的載體PGN_hU6，并且進行測序驗證，載體圖譜如圖1所示，載體的序列如SEQ ID N0.1所示。各個亞克隆步驟中每個載體所使用的限制性內切酶及反應條件如表I所示。表I各個亞克隆步驟中每個載體所使用的限制性內切酶及反應條件
權利要求
1.一種通用型RNA干擾載體，其特征在于，所述的干擾載體依次包括以下相連的各部分:含有PCMV啟動子的綠色熒光蛋白、人U6啟動子序列、多克隆酶切位點、人U6終止子序列、含有PCMV啟動子的新霉素抗性基因、復制起始位點基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點；所述的通用型RNA干擾載體的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.構建權利要求1所述的通用型RNA干擾載體的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)突變型人U6啟動子的構建 以含人U6啟動子的載體為模板，使用點突變后的引物PCR擴增得到突變型人U6啟動子，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構建得到PMD20-T-hU6 ;擴增引物為:F:5’ -ACCGGTACTGGATCCGGTACCAAGGTC-3’R:5’ -CATCGATGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ ； (2)綠色熒光蛋白(GFP)的構建 以含可以完整表達綠 色熒光蛋白元件的載體pcDNA3.1/CT-GFP為模板，擴增得到含有PCMV, GFP、SV40P0LY(A)的表達元件，將克隆得到的片段連接到PMD20-T載體上，構建得到PMD20-T-GFP ;擴增引物為:F:5’ -TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3，R:5’ -TAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’ ； (3)正篩選基因的構建 新霉素抗性基因NEO以及PCMV啟動子以載體PGT-Vl為模板進行克隆，NEO的擴增引物為:F:5’ -ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3’R:5’ -TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’ ； PCMV啟動子的擴增引物為:F:5’ -ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’R:5’ -GTT CCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3’ ； (4)骨架載體的構建 合成多克隆位點，并將其亞克隆到PUC57載體上，構建骨架載體TOC57-MCS，多克隆位點序列如SEQ ID N0.2所示； (5)元件組裝 ①利用roC57-MCS上的SalI與ClaI兩個酶切位點以及載體PMD20_T_hU6上的SalI與ClaIdf hU6亞克隆至PUC57-MCS構建成為載體roC57_hU6 ； ②PCMV與NEO基因的組裝:將克隆到的PCMV與NEO基因膠回收后，利用基因上的XmaI酶切位點將兩個基因拼接成為PCMV-NE0，將PCMV-NEO克隆到載體PUC57_hU6上，構建成為載體 PUC57-UN ； ③利用PMD57-UN上的AgeI與SalI以及PMD20-T-GFP上的XmaI與SalI位點，將GFP克隆到PUC57-UN上，構建成為目的載體PGN-hU6。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(5)①中構建得到的含有人U6啟動子、多克隆酶切位點、人U6終止子的片段的序列如SEQ ID N0.3所示。
4.權利要求2-3任一所述的方法構建的通用型RNA干擾載體在構建豬源細胞RNAi表達載體中的應 用。
全文摘要
本發明公開了一種通用型RNA干擾載體及其構建方法和應用，屬于生物技術領域。本發明所述的干擾載體依次包括以下相連的各部分綠色熒光蛋白、人U6啟動子序列、多克隆酶切位點、人U6終止子序列、含有PCMV啟動子的新霉素抗性基因、復制起始位點基因、氨芐青霉素抗性篩選基因以及用于載體線性化的酶切位點。本發明的干擾載體實現了不同操作情況下，對細胞基因表達的瞬時抑制或者穩定抑制，在建立穩定表達細胞系時，提高了轉然后載體的整合效率.同時通過對hU6啟動子進行改造，引入了2個酶切位點，線性化載體可以連接任意的目標oligoDNA，此oligoDNA僅含有2個額外核苷酸(即，不用于表達shRNA的核苷酸)，節省了試驗成本。
文檔編號C12N15/64GK103160532SQ20131005178
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月2日 優先權日2013年2月2日
發明者常惠蕓, 馬延濱, 獨軍政, 邵軍軍, 高閃電, 趙付榮, 叢國正, 林彤 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所