專利名稱：修飾的安卡拉痘苗病毒基因的基因組中保守基因之間的基因間位點的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于穩定整合外源DNA序列至MVA基因組內的插入位點。相關技術的描述痘病毒科的成員具有編碼數百種蛋白質的龐大雙鏈DNA基因組(《費氏病毒學，第五版》Moss, B.2007 “痕病毒科:病毒及其復制”(〃Poxviridae: The Viruses and TheirReplication^in Fields Virology, 5th Ed) (D.M.Knipe, P.M.Howley, D.E.Griffin, R.A.1 Lamb, M.A.Martin, B.Roizman 和 S.E.Straus, Eds) , Lippincottffi 11 iams&ffilkins, Philadelphia, PA)。已 知高度減毒的痘苗病毒株-修飾的安卡拉痘苗病毒(MVA)的基因組序列(Sutter, G 和 Moss, B.1992 美國科學院院報(Proc Natl Acad Sci USA) 89:10847-10851 ；和Sutter, G.等1994疫苗(Vaccine) 12:1032-1040)，其中所述的修飾的安卡拉痘苗病毒不能生長在大多數哺乳動物細胞中并且是重組疫苗載體的良好候選物。修飾的安卡拉痘苗病毒已經在雞胚成纖維細胞中傳代超過570次，在此期間相對于宿主范圍嚴格限制的親代野生型Ankara株而言,6個重大缺失已經出現(Meyer, H.等1991普通病毒學雜志(J GenVirol) 72:1031-1038)。發明簡述本發明涉及用于整合外源序列至痘苗病毒基因組的基因間區(IGR)內的新插入位點，其中所述的IGR位于該痘苗病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框(ORF)之間或所述的IGR位于該痘苗病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框的側面，并且其中所述ORF對應于保守基因，并涉及用來插入外源DNA至痘苗病基因組內的相關質粒載體，并且還涉及作為藥物或疫苗的含有插入所述新插入位點內的外源序列的重組痘苗病毒。
圖1.基于pol基因序列同一性的HIV-1和HIV-2的系統發生學關系。SIVcpz和SIVsmm是分別從黑猩猩(chimpanzee)和白眉猴(sooty mangabey monkey)中回收的類人靈長類慢病毒。圖2.基于全長pol基因序列的具有四種不同SIVepz分離株的HIV-1M組、N組和O組(group)的系統發生學關系。短棒表示遺傳距離0.1 (10%核苷酸趨異性)并且星號指出基于env序列的N組HIV-1分離株的位置。圖3.HIV-1分離株的嗜性及生物學特征。圖4.HIV-編碼的蛋白質。顯示HIV基因的位置、初級翻譯產物(在一些情況下是多聚蛋白)的尺寸和加工的成熟病毒蛋白。圖5.成熟HIV-1病毒粒子的示意圖。圖6.HIV-1Env糖蛋白的線性示意圖。箭頭I表示gpl60切割成gpl20和gp41的位點。在gpl20中，交叉線區域代表可變結構域(V1-V5)并且空心框描述保守序列(C1-C5X在gp41胞外結構域中，顯示幾個結構域:氨基端融合肽和兩個胞外結構域螺旋(氨基端螺旋與羧基端螺旋)。跨膜結構域由黑色框代表。在gp41胞漿結構域中，顯示Tyr-X-X-Leu(YXXL)內吞基序(SEQ ID NO:1)和兩個預測性螺旋結構域(螺旋-1和螺旋-2)。氨基酸編號被標出。圖7.pLW-73轉移載體。圖8.pLW-73轉移載體的核苷酸序列(上部鏈，SEQ IDNO:2 ;底部鏈，SEQ ID N0:3)。圖9.編碼烏干達進化枝D Env蛋白(分離株A07412)的核苷酸序列(SEQ IDN0:4)。圖10.編碼烏干達進化枝D gagpol蛋白(分離株A03349)的密碼子變異的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。圖11.重組MVA的生成和對所插入基因的穩定性的分析。A)將env和gagpol分別插入Del II和Del III位點的示意圖例。B)通過免疫染色法評價穩定性。
圖12.MVA/65A/G env中env突變的類型和頻率。圖 13.在 Del III 中插入 Env in I8R/G1L IGR 和 Gag Pol。圖14.修飾Α/G構建體以增加穩定性。圖15.蝕斑傳代后的Env的表達。圖16.各個克隆的PCR和蛋白質印跡分析。圖17.通過雙重重組 MVA (double recombinant MVA)表達 A/G env。圖18.表達來自烏干達HN-1分離株的env和gagpol的重組病毒。圖19.MVA/UGD4a_無著色env蝕斑的分析。圖20.對重組MVA中UGD env基因的修飾圖21.MVA/UGD4b_無著色gag蝕斑的分析。*,成段4-6個G或C殘基的位置。圖22.對重組MVA中UGD gagpol基因的修飾。圖23.構建表達UGD env和gagpol的穩定重組MVA。圖24.由MVA/UGD4d激發的細胞應答。圖25.由MVA/UGD4d激發的抗體應答。微生物的保藏以下微生物已經根據布達佩斯條約條款以所示日期保藏于弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心(ATCC):
權利要求
1.重組修飾的安卡拉痘苗(MVA)病毒，其包含插入所述MVA基因組的基因間區(IGR)內的異源DNA序列，其中，所述的IGR位于該MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框(ORF)之間或所述的IGR位于該MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框的側面，并且其中所述ORF對應于保守基因，并且其中所述的兩個相鄰ORF以示例性方式或其相應方式選自由(使用CDC/阿卡姆貝斯的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所組成的組中。
2.根據權利要求I所述的MVA，其中，所述的兩個相鄰ORF選自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122 和 132-133 所組成的組中。
3.根據權利要求2所述的MVA，其中，所述的兩個相鄰ORF是071-072。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的MVA，其中，所述的異源DNA序列包含在痘病毒轉錄控制元件的轉錄性控制下的至少一個編碼序列。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的MVA，其中，所述的異源DNA序列編碼一種或多種蛋白質、多肽、肽、外來抗原或抗原表位。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的MVA，其中，所述的異源DNA序列得自人免疫缺陷病毒(HIV)。
7.根據權利要求6所述的MVA，其中，所述得自人免疫缺陷病毒的異源DNA序列編碼HIV包膜。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的MVA，其中，所述的MVA基因組是保藏于美國典型培養物保藏中心登錄號PTA-5095下的MVA的基因組。
9.根據權利要求1-7中任意一項所述的MVA，其中，所述的MVA基因組是具有Genbank登錄號AY603355的序列的MVA基因組。
10.根據權利要求1-7中任意一項所述的MVA，其中所述的MVA基因組是具有Genbank登錄號U94848的序列的MVA基因組。
11.權利要求1-10中任意一項所述的MVA用作藥物和/或疫苗。
12.權利要求1-10中任意一項所述的MVA在制備用于治療和/或預防病毒感染和/或增殖病的藥物和/或疫苗中的用途。
13.根據權利要求12所述的用途，用于治療或預防人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
14.用于誘導免疫應答的疫苗或組合物，其包含權利要求1-10中任意一項所述的MVA。
15.藥物組合物，其包含權利要求1-10中任意一項所述的MVA以及藥學上可接受的載體、添加物、輔藥、稀釋劑和/或穩定劑。
16.用于在包括人的活的動物體中誘導免疫應答的方法，其包括施用權利要求1-10中任意一項所述的MVA至包括人的所述動物。
17.用于體外制備蛋白質、多肽、肽、抗原或表位的方法，其包括用權利要求1-10中任意一項所述的重組MVA感染宿主細胞，在合適條件下培養所述感染的宿主細胞，并且分離和/或富集由所述宿主細胞產生的多肽、蛋白質、肽、抗原、表位和/或病毒。
18.用于體外導入DNA序列至細胞的方法，所述的DNA序列與所述細胞的基因組同源和/或異源，其中，所述細胞用權利要求1-10中任意一項所述的MVA感染。
19.用于離體導入DNA序列至細胞的方法，所述的DNA序列與所述細胞的基因組同源和/或異源，其中，所述細胞用權利要求1-10中任意一項所述的MVA感染，并且所述的感染細胞隨后施用至包括人在內的活的動物體。
20.用于導入DNA序列至包括人在內的活的動物體的方法，所述的DNA序列與所述動物體的基因組同源和/或異源，其通過施用權利要求1-10中任意一項所述的MVA至包括人在內的所述動物。
21.質粒載體，其包含得自MVA的基因組或與其同源的DNA序列，其中，所述的DNA序列包含位于所述MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框之間或位于所述MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框的側面的IGR序列的完整片段或部分片段和插入所述IGR序列的克隆位點，所述克隆位點用于插入與該MVA的基因組異源的DNA序列和任選地插入報道基因盒和/或選擇基因盒，并且其中所述的兩個相鄰ORF以示例性方式或其相應方式選自由(使用CDC/阿卡姆貝斯的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、07卜072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所組成的組中。
22.包含得自MVA的基因組或與其同源的DNA序列的質粒載體，其中，所述的DNA序列包含兩個相鄰ORF的IGR側翼序列和插入所述IGR的克隆位點，所述克隆位點用于插入與該MVA的基因組異源的DNA序列和任選地插入報道基因盒和/或選擇基因盒，并且其中所述的兩個相鄰ORF以示例性方式或其相應方式選自由(使用CDC/阿卡姆貝斯的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的 044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071,071-072,072-073,073-074,074-075,075-076,076-077,077-078,078-079,081-082,085-086,086-087,089-090,092-093,093-094,095-096,097-098,100-101,101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所組成的組中。
23.根據權利要求21或22所述的質粒載體，其中，所述的DNA序列包含IGR序列的完整片段或部分片段，所述的IGR序列包括用于插入所述異源DNA序列和任選地插入報道基因盒和/或選擇基因盒的克隆位點。
24.根據權利要求21或22所述的質粒載體，其中，所述的兩個相鄰ORF選自由049-050、071-072、074-075、078-079、092-093、100-101、118-119、121-122 和 132-133 所組成的組中。
25.根據權利要求24所述的質粒載體，其中，所述的兩個相鄰ORF是071-072。
26.根據權利要求21-25中任意一項所述的質粒載體，其中，所述DNA序列得自保藏于美國典型培養物保藏中心登錄號PTA-5095下的MVA的基因組或與其同源。
27.根據權利要求21-25中任意一項所述的質粒載體，其中，所述DNA序列得自具有Genbank登錄號AY603355的序列的MVA的基因組或與其同源。
28.根據權利要求21-25中任意一項所述的質粒載體，其中，所述DNA序列得自具有Genbank登錄號U94848的序列的MVA的基因組或與其同源。
29.用于制備權利要求I所述的MVA的方法，其包括用權利要求21-39中任意一項所述的質粒載體轉染細胞；用MVA感染已轉染的細胞；并鑒定、分離及任選地純化所述MVA。
30.穩定在重組痘苗病毒中的插入物的方法，其包括鑒定所述插入物中的一段4個或4個以上G或C殘基，并且通過置換在如此鑒定的殘基段中產生沉默突變，從而減少所述殘基段的長度。
31.pLW-73。
32.MVA/UGD4do
33.重組痘苗病毒，其包含插入所述痘苗病毒的基因間區(IGR)內的異源DNA序列，其中，所述的IGR位于該痘苗病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框(ORF)之間或所述的IGR位于該痘苗病毒基因組的兩個相鄰開放閱讀框的側面，并且其中所述ORF對應于保守基因，并且其中所述的兩個相鄰ORF以示例性方式或其相應方式選自由(使用CDC/阿卡姆貝斯的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的 044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、07卜072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142 和 142-143 所組成的組中。
全文摘要
本發明涉及重組修飾的安卡拉痘苗病毒，其包含插入所述MVA基因組的基因間區內的異源DNA序列，其中，所述的IGR位于該MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框之間或所述的IGR位于該MVA基因組的兩個相鄰開放閱讀框的側面，并且其中所述ORF對應于保守基因，并且其中所述的兩個相鄰ORF以示例性方式或其相應方式選自由(使用CDC/阿卡姆貝斯的命名法則)其它痘苗病毒毒株中的044-045、049-050、050-051、058-059、064-065、065-066、069-070、070-071、071-072、072-073、073-074、074-075、075-076、076-077、077-078、078-079、081-082、085-086、086-087、089-090、092-093、093-094、095-096、097-098、100-101、101-102、102-103、104-105、108-109、113-114、114-115、118-119、121-122、122-123、123-124、127-128、128-129、129-130、130-131、131-132、132-133、133-134、134-135、135-136、141-142和142-143所組成的組。
文檔編號C12N15/863GK103255110SQ20131005490
公開日2013年8月21日 申請日期2007年8月24日 優先權日2006年8月25日
發明者伯納德·莫斯, 琳達·懷亞特, 帕特里夏·厄爾 申請人:美國國有健康與人類服務部(馬里蘭州)